Толерантний до інгібуючого als гербіциду мутант буряку звичайного

Реферат: Винахід стосується толерантної до інгібуючих ALS гербіцидів рослини буряку звичайного та її частин, які включають мутацію ендогенного гена ацетолактатсинтази (ALS), причому ALS ген кодує поліпептид ALS, який містить лейцин замість триптофану, у позиції 569 поліпептиду ALS. UA 113721 C2 (12) UA 113721 C2 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується толерантних до інгібуючих ALS гербіцидів рослин буряка звичайного та їх частин, а також способу їх одержання. Культурні форми буряка звичайного (як визначено у публікації Ford-Lloyd (2005) Sources of genetic variation, Genus Beta. In: Biancardi E, Campbell L G, Skaracis G N, De Biaggi M (eds) Genetics and Breeding of Sugar Beet. Science Publishers, Enfield (NH), USA, pp 25-33) є важливими сільськогосподарськими культурами у районах з помірним та субтропічним кліматом. Наприклад, близько 20 % світового виробництва цукру здійснюється на основі цукрового буряка. Оскільки сіянці та молоді рослини буряка протягом перших 6-8 тижнів їхнього життя є чутливими до жорсткої конкуренції, спричиненої швидко зростаючими бур'янами, які пригнічують молоді культурні рослини, надійні заходи з боротьби з бур'янами є нагальною потребою на площах вирощування культур. Вже понад 40 років гербіциди є оптимальними засобами для боротьби з бур'янами на площах вирощування буряків. Продукти, які застосовуються з цією метою, такі, як фенмедіфам, десмедіфам та метамітрон, пригнічувати бур'яни на полях цукрового буряка без зашкодження культурі. Незважаючи на це, за несприятливих екологічних умов ефективність цих продуктів ще є далекою від максимальної, особливо у випадках, коли такі бур'яни, як Chenopodium album, Amaranthus retroflexus та/або Tripleurospermum inodorata розвиваються протягом тривалого періоду часу. Нові гербіцидні активні інгредієнти є дуже бажаними для розширення засобів боротьби з бур'янами на площах вирощування буряка. Такі сполуки мають діяти проти широкого спектра бур'янів, в оптимальному варіанті – від проростання до повного розвитку рослин бур'янів, без ураження культури буряків незалежно від її стадії розвитку. При застосуванні класичного відбору гербіцидів за останні десятиліття не вдавалося виявити активних інгредієнтів з вибірковою гербіцидною активністю для буряків, які б мали всі ці чіткі властивості, що забезпечували б агрономічні переваги. Деякі хімічні речовини інгібують фермент "синтазу ацетогідроксикислоти" (AHAS), також відомий як "ацетолактатсинтаза" (ALS [EC 4.1.3.18]). ALS є місцем дії п'яти різних за структурою родин гербіцидів, які належать до класу інгібуючих ALS гербіцидів, таких, як (a) сульфонілсечовинні гербіциди (Beyer E.M et al. (1988), Sulfonylureas in Herbicides: Chemistry, Degradation, and Mode of Action; Marcel Dekker, New York, 1988, 117-189), (b) сульфоніламінокарбонілтріазолінонові гербіциди (Pontzen, R., Pflanz.-Nachrichten Bayer, 2002, 55, 37-52), (c) імідазолінонові гербіциди (Shaner, D.L., et al., Plant Physiol., 1984, 76, 545-546; Shaner, D.L., and O'Connor, S.L. (Eds.) The Imidazolinone Herbicides, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991), (d) тріазолпіримідинові гербіциди (Kleschick, W.A. et al., Agric. Food Chem., 1992, 40, 10831085), та (e) піримідиніл(тіо)бензоатні гербіциди (Shimizu, T.J., Pestic. Sci.,1997, 22, 245-256; Shimizu, T. et al., Acetolactate Syntehase Inhibitors in Herbicide Classes in Development, Böger, P., Wakabayashi, K., Hirai, K., (Eds.), Springer Verlag, Berlin, 2002, 1-41). ALS бере участь у перетворенні двох молекул пірувату на молекулу ацетолактату та діоксид вуглецю. У реакції застосовують тіамінпірофосфат з метою з'єднання двох молекул пірувату. Одержаний в результаті продукт цієї реакції, ацетолактат, зрештою стає валіном, лейцином та ізолейцином (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine", in Plant Amino Acids, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-247). Інгібітори ALS переривають біосинтез валіну, лейцину та ізолейцину в рослинах. Внаслідок цього відразу вичерпуються запаси відповідних амінокислот, що викликає припинення біосинтезу білків, призводячи до припинення росту рослини та, зрештою, її загибелі або щонайменше ураження. Інгібуючі ALS гербіциди широко застосовуються у сучасному сільському господарстві завдяки їхній ефективності при помірних нормах внесення та відносній нетоксичності для тварин. Через інгібування активності ALS ці родини гербіцидів запобігають подальшому ростові та розвиткові сприйнятливих рослин, включаючи багато видів бур'янів. Для забезпечення рослин з підвищеною толерантністю до ще більших концентрацій інгібуючих ALS гербіцидів, які можуть вимагатися для достатнього контролю над бур'янами, потрібні додаткові резистентні до інгібуючих ALS гербіцидів лінії та сорти культурних рослин, а також способи та композиції для виведення та застосування резистентних до інгібуючих ALS гербіцидів ліній та сортів. Широкий вибір інгібуючих ALS гербіцидів дозволяє фермерам боротися з різними видами бур'янів незалежно від стадії їхнього росту, але ці високоефективні гербіциди не можуть бути застосовані для буряка, оскільки традиційні рослини цукрового буряка / комерційні сорти цукрового буряка, є дуже уразливими перед цими інгібуючими ALS гербіцидами. Незважаючи на це, такі інгібуючі ALS гербіциди демонструють відмінну гербіцидну активність проти широколистяних та трав'янистих видів бур'янів. Перші гербіциди, механізмом дії яких було 1 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інгібування ALS, були розроблені для їх застосування у сільському господарстві ще 30 років тому. Нині активні інгредієнти цього класу гербіцидів демонструють високу ефективність у боротьбі з бур'янами і широко застосовуються для захисту кукурудзи та злаків, а також для дводольних культур, але не для буряків. Єдиним інгібуючим ALS гербіцидом, який нині є відомим як такий, що може застосовуватися для післясходового внесення для буряків, є Debut®. Цей гербіцид (який містить трифлусульфурон-метил як активний інгредієнт плюс специфічні сполуки для рецептування) розщеплюється рослиною буряка, перш, ніж зможе інгібувати ендогенний ALS фермент буряка, але він має серйозні пропуски у боротьбі з бур'янами на площах вирощування буряка. З часу запровадження інгібуючих ALS гербіцидів у сільському господарстві спостерігалося, що сприйнятливі види рослин, включаючи природні бур'яни, іноді розвивають спонтанну толерантність до цього класу гербіцидів. Окремі заміни пар нуклеотидів у певних сайтах гена ALS зазвичай ведуть до більш або менш резистентних різновидів ферменту ALS, які демонструють різні рівні інгібування через інгібуючі ALS гербіциди. Таким чином, рослини, які надають мутантні алелі ALS, демонструють різний рівень толерантності до інгібуючих ALS гербіцидів, залежно від хімічної структури інгібуючого ALS гербіциду та місця точкової мутації у гені ALS. Наприклад, у публікації Hattori et al. (1995), Mol. Gen. Genet. 246: 419-425, описується односпрямована мутація у кодоні Trp 557 лінії клітин Brassica napus (згідно з нумерацією послідовності Arabidopsis thaliana, яка застосовується в літературі, з метою порівняння всіх мутантів ALS/AHAS вона відповідає позиції "574") – що дорівнює позиції 569 послідовності ALS буряка. Ці автори спостерігали резистентність до кількох представників підкласів інгібуючих ALS гербіцидів, таких, як сульфонілсечовини, імідазолінони та тріазолпіримідини. Були описані мутанти буряка, які забезпечують точкову мутацію в кодоні Ala 122, які ведуть до певної толерантності до імідазолінонів підкласу інгібуючих ALS гербіцидів (документ WO 98/02526), яка все ж є недостатньою для боротьби з бур'янами у програмах сільськогосподарського застосування. Не містилось відомостей про перехресну толерантність до інших класів інгібуючих ALS гербіцидів при застосуванні цього мутанта. Крім того, рослини буряка, які забезпечують другу точкову мутацію у кодоні Pro 197 продемонстрували помірну толерантність до інгібуючих ALS гербіцидів, які належать до підкласу сульфонілсечовинних гербіцидів. Також було описано подвійні мутанти, що складаються з цих двох (документ WO 98/02527). Однак жоден з цих мутантів не було застосовано для впровадження на ринок сортів буряків, оскільки рівень толерантності до інгібуючих ALS гербіцидів у цих мутантах був недостатньо високим для агрономічного застосування. У публікації Stougaard et al. (1990), J. Cell Biochem., Suppl. 14E, 310, описується виділення мутантів ALS у культурі тетраплоїдних клітин цукрового буряка. Було виділено два різні ALS гени (ALS I та ALS II), які відрізнялися лише в амінокислотній позиції 37. Мутант 1 містив у його ALS I гені 2 мутації, а мутант 2 містив 3 мутації в його ALS II гені. Після відокремлення мутацій для визначення конкретної мутації, яка має забезпечувати резистентність до інгібітора ALS, було виявлено, що ALS, синтезована з рекомбінантної E. coli, була резистентною до гербіцидів, якщо містила точкову мутацію в кодоні Trp 574 (згідно з нумерацією послідовності Arabidopsis thaliana, яка застосовується в літературі, з метою порівняння всіх мутантів ALS) – що дорівнює позиції 569 послідовності ALS буряка, що веде до заміни амінокислоти "Trp" на амінокислоту "Leu". Автори Stougaard et al. не продемонстрували на цукровому буряку, що мутація у позиції 569 будь-якого з ALS генів цукрового буряка є достатньою для досягнення прийнятного рівня толерантності до інгібуючих ALS гербіцидів. Крім того, Stougaard et al. не регенерували і не розглядали рослини цукрового буряка, які включають мутації, включаючи мутацію Trp → Leu у позиції 569 ALS цукрового буряка. На основі цих відомостей Stougaard et al. побудували вектори трансформації рослин, які містили різні ALS гени, для застосування у трансформації рослин. Однак до нинішнього часу цими або іншими авторами протягом наступних понад 20 років більше не повідомлялося ніяких даних, зокрема, стосовно впливу застосування інгібуючих ALS гербіцидів до рослин та/або сільськогосподарських площ, з включенням цієї мутації у рослини буряка звичайного, або піддані генній інженерії, або мутовані. У документі WO 99/57965 в цілому описуються резистентні до сульфонілсечовини рослини цукрового буряка та способи їх одержання шляхом мутагенезу, викликаного EMS (етилметансульфонатом). Однак, крім дослідження, необхідного для одержання таких мутантів, у цій публікації не представлено таких рослин і не описується конкретне розташування у гені ALS, яке може бути пов'язане з одержанням мутантів, толерантних до інгібуючих ALS гербіцидів, а також не 2 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розкривається будь-який спосіб їх агрономічного застосування. Крім того, існує висока ймовірність, що при використанні такої високомутагенної сполуки, як EMS, можуть відбуватися різні інші мутації в будь-якому іншому місці геному, які можуть призводити до порушень, аж до нефертильності та/або уповільнення росту одержаних таким чином рослин. Крім того, через хімічну взаємодію з ДНК застосування EMS може мати пропуски у викликанні специфічних мутацій на зразок перетворення триплету TGG на TTG, оскільки EMS завжди перетворює гуанозин на аденозин. У деяких видах бур'янів, таких, як Amaranthus, мутація Trp 574 Leu може бути виявлена у популяціях рослин, які багаторазово піддавалися дії інгібуючих ALS гербіцидів. Ці мутанти Trp 574 Leu демонструють високий рівень толерантності до кількох хімічних класів інгібуючих ALS гербіцидів, таких, як ті, що є вибраними з групи, до якої належать сульфонілсечовини та сульфоніламінокарбонілтріазолінони. У документі WO 2008/124495 описуються подвійні та потрійні ALS мутанти. Згідно з документом WO 2009/046334, забезпечувалися специфічні мутації у гені ALS. Однак придатні для агрономічного застосування толерантні до гербіцидів мутанти буряка звичайного, які містять такі мутації згідно з документом WO 2009/046334, до цього часу не було одержано. Більш того, зважаючи на те, що, наприклад, з цукрового буряка виробляється близько 20 % цукру у світі, існує висока потреба у наявності рослин цукрового буряка, які б мали перевагу росту порівняно з високоактивними бур'янами. Таким чином, існує висока потреба у наявності нетрансгенних стосовно ALS гена рослин буряка звичайного, включаючи рослини цукрового буряка, які є толерантними до інгібуючих ALS гербіцидів. Отже, існує потреба у таких нетрансгенних рослинах буряка звичайного, зокрема, рослинах цукрового буряка, які були б толерантними до інгібуючих ALS гербіцидів на придатному для агрономічного застосування рівні інгібуючих ALS гербіцидів. Таким чином, технічна проблема полягає у виконанні цієї потреби. Даний винахід стосується цієї потреби, а отже, забезпечує як розв'язання технічної проблеми толерантної до інгібуючих ALS гербіцидів рослини буряка звичайного та її частин, які включають мутацію ендогенного гена ацетолактатсинтази (ALS), причому ALS ген кодує поліпептид ALS, який містить амінокислоту, відмінну від триптофану, у позиції 569 поліпептиду ALS. Насіння згідно з даним винаходом було депоновано у NCIMB (Національній колекції промислових, харчових та морських бактерій), Aberdeen, Великобританія, під номером NCIMB 41705 12 березня 2010 р. При застосуванні різних способів селекції можуть бути розроблені високоврожайні комерційні сорти, які мають високу конкурентоспроможність на всіх відповідних ринках, з додатковою стійкою толерантністю до інгібуючих ALS гербіцидів шляхом використання первісно одержаних мутантних рослин. Слід зазначити, що у контексті даного опису форми однини також можуть означати множину, якщо чітко не вказано іншого. Таким чином, наприклад, посилання на "реагент" передбачає один або кілька таких різних реагентів, а посилання на "спосіб" передбачає посилання на рівноцінні етапи та способи, відомі спеціалістам уданій галузі, які можуть бути модифіковані або заміщені способами, описаними авторами цього винаходу. Усі публікації та патенти, наведені в цьому описі є включеними шляхом посилання у повному обсязі. Якщо включені шляхом посилання матеріали суперечать або є несумісними з цим описом, цей опис має пріоритет перед будь-яким з цих матеріалів. Якщо спеціально не вказано іншого, термін "принаймні", вжитий перед переліком елементів, слід розуміти як такий, що стосується кожного елемента з переліку. Спеціалісти у даній галузі визнають або шляхом звичних експериментів зможуть переконатись у можливості багатьох рівноцінних варіантів втілення описаного винаходу. Ці рівноцінні варіанти охоплюються обсягом даного винаходу. В усьому тексті цього опису та у представленій нижче формулі винаходу, якщо контекстом не вимагається іншого, слово "включати" та його варіанти, такі, як "включає" та "включаючи", слід розуміти як таке, що означає включення цілого числа або етапу, або групи цілих чисел або етапів, але не виключення будь-якого цілого числа або етапу, або групи цілих чисел або етапів. Слово "включати" та його варіанти з одного боку і слово "містити" та його аналогічні варіанти з іншого боку можуть вживатися взаємозамінно без надання переваги жодному з них. Згідно з даним винаходом, одержували рослини буряка, які включають змінений ендогенний ALS ген (також відомий як "AHAS" ген), який має точкову мутацію в кодоні Trp 569 (для буряка звичайного контрольна амінокислотна послідовність ALS, показана як SEQ ID NO: 2; це дорівнює позиції 574 контрольної послідовності Arabidopsis thaliana, як показано у SEQ ID NO: 3 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6), і цієї точкової мутації досягали через кілька циклів селекції на спеціально вибраних інгібуючих ALS гербіцидах. Через те, що рослини B. vulgaris згідно з даним винаходом одержували шляхом виділення спонтанних клітин мутантних рослин, які були прямо регенеровані до повністю фертильних рослин буряка, які мають точкову мутацію, як описується авторами більш детально. Ці рослини є нетрансгенними стосовно ALS гена. Крім того, самі рослини згідно з даним винаходом, а також їхнє потомство є фертильними, а отже, можуть використовуватися з метою розведення без будь-яких додаткових маніпуляцій, які можуть спричинювати стрес, викликаний подальшими змінами генетичного середовища. Такі рослини, одержані згідно з застосовуваною авторами цього винаходу процедурою селекції, можуть безпосередньо використовуватися з метою виведення сортів та/або гібридів буряка, які забезпечують агрономічно ефективний рівень толерантності до інгібуючих ALS гербіцидів, що, таким чином, дозволяє на новому рівні застосовувати заходи боротьби з бур'янами на площах вирощування буряка. У контексті даного опису термін "трансгенний" означає, що ген – який може бути взятий з того самого або іншого виду – було включено у рослину через відповідний біологічний носій, такий, як Agrobacterium tumefaciens, або будь-яким іншим фізичним способом, таким, як трансформація протопластів або бомбардування частинками, і цей ген здатен експресуватися в новому середовищі, тобто, у генетично модифікованому організмі (ГМО). Згідно з вищенаведеним визначенням, термін "нетрансгенний" означає прямо протилежне, тобто, відсутність включення відповідного гена через відповідний біологічний носій, або будьяким іншим фізичним способом. Однак мутований ген може бути перенесений через запилення, природним шляхом або через процес селекції, для створення іншої рослини, яка не є трансгенною стосовно цього конкретного гена. "Ендогенний" ген означає ген рослини, який не було включено у рослину через застосування технологій генної інженерії. У контексті даного опису термін "послідовність" означає нуклеотидну(і) послідовність (послідовності), полінуклеотид(и), нуклеїновокислотну(і) послідовність (послідовності), нуклеїнову(і) кислоту(и), молекулу нуклеїнової кислоти, пептиди, поліпептиди та білки, залежно від контексту, в якому вжито термін "послідовність". Терміни "нуклеотидна(і) послідовність (послідовності)", "полінуклеотид(и)", "нуклеїновокислотна(і) послідовність (послідовності)”, "нуклеїнова(і) кислота(и)", "молекула нуклеїнової кислоти" у контексті даного опису вживаються взаємозамінно і стосуються нуклеотидів, або рибонуклеотидів, або дезоксирибонуклеотидів, або їх комбінації, у полімерній нерозгалуженій формі будь-якої довжини. До нуклеїновокислотних послідовностей належать ДНК, кДНК, геномні ДНК, РНК, синтетичні форми та змішані полімери, смислові та антисмислові ланцюги, або ж вони можуть містити неприродні або дериватизовані нуклеїнові основи, як може бути легко визначено спеціалістами у даній галузі. Вжитий у контексті даного опису термін "поліпептид" або "білок" (обидва терміни у контексті даного опису вживаються взаємозамінно) означає пептид, білок або поліпептид, який охоплює амінокислотні ланцюги певної довжини, причому амінокислотні залишки з'єднуються ковалентними пептидними зв'язками. Однак винахід також охоплює пептидоміметики таких білків/поліпептидів, у яких амінокислоту(и) та/або пептидний(і) зв'язок (зв'язки) замінено функціональними аналогами, а також відмінні від 20-ген-кодованих амінокислоти, такі, як селеноцистеїн. Пептиди, олігопептиди та білки можуть називатися поліпептидами. Термін "поліпептид" також стосується і не виключає модифікацій поліпептиду, наприклад, глікозилування, ацетилування, фосфорилування і т. ін. Такі модифікації належним чином описуються у навчальних посібниках та більш детальних монографіях, а також у дослідницькій літературі. Поліпептид (або білок) у контексті цього опису в оптимальному варіанті означає поліпептид ALS (або білок ALS) B. vulgaris [SEQ ID NO: 2]. Амінокислотні заміщення охоплюють амінокислотні зміни, в яких амінокислота є заміненою на інший природний амінокислотний залишок. Такі заміщення можуть бути класифіковані як "консервативні", у яких амінокислотний залишок, який міститься у білку ALS дикого типу, є заміненим на іншу природну амінокислоту з подібними характеристиками, наприклад Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln або Phe↔Trp↔Tyr. Заміщення, які охоплюються даним винаходом, також можуть бути "неконсервативними", при яких амінокислотний залишок, присутній у білку ALS дикого типу, є заміщеним амінокислотою з іншими властивостями, такою, як природна амінокислота з іншої групи (наприклад, заміщення зарядженої або гідрофобної амінокислоти аланіном). Термін "подібні амінокислоти" у контексті даного опису означає амінокислоти, які мають подібні амінокислотні бокові ланцюги, тобто, амінокислоти, які мають 4 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 полярні, неполярні або практично нейтральні бокові ланцюги. "Неподібні амінокислоти" у контексті даного опису означають амінокислоти, які мають різні амінокислотні бокові ланцюги, наприклад, амінокислота з полярним боковим ланцюгом не є подібною до амінокислоти з неполярним боковим ланцюгом. Полярні бокові ланцюги зазвичай є присутніми на поверхні білка, де вони можуть взаємодіяти з водним середовищем, яке міститься у клітинах ("гідрофільні" амінокислоти). З іншого боку, "неполярні" амінокислоти зазвичай містяться у центрі білка, де вони можуть взаємодіяти з подібними неполярними сусідніми амінокислотами ("гідрофобними" амінокислотами"). Прикладами амінокислот, які мають полярні бокові ланцюги, є аргінін, аспарагін, аспартат, цистеїн, глутамін, глутамат, гістидин, лізин, серин та треонін (усі є гідрофільними, за винятком цистеїну, який є гідрофобним). Прикладами амінокислот, які мають неполярні бокові ланцюги, є аланін, гліцин, ізолейцин, лейцин, метіонін, фенілаланін, пролін та триптофан (усі є гідрофобними, за винятком гліцину, який є нейтральним). В цілому при застосуванні термінів ALS, ALSL, AHAS або AHASL спеціалістам у даній галузі відомо, на основі загальних знань та контексту, чи мається на увазі нуклеотидна послідовність або нуклеїнова кислота, чи амінокислотна послідовність або поліпептид, відповідно. У контексті даного опису термін "ген" означає полімерну форму нуклеотидів будь-якої довжини, або рибонуклеотидів, або дезоксирибонуклеотидів. Термін включає дво- та одноланцюгові ДНК та РНК. Він також охоплює відомі типи модифікацій, наприклад, метилування, "кепи", заміщення одного або кількох з природних нуклеотидів аналогом. В оптимальному варіанті ген включає кодуючу послідовність, яка кодує визначений поліпептид. "Кодуюча послідовність" є нуклеотидною послідовністю, яка транскрибується в мРНК і/або транслюється у поліпептид, коли є поміщеною або перебуває під контролем відповідних регуляторних послідовностей. Межі кодуючої послідовності визначають за старт-кодоном трансляції на 5’-кінці та стоп-кодоном трансляції на 3’-кінці. Кодуюча послідовність може включати, крім іншого, мРНК, кДНК, рекомбінантні нуклеїновокислотні послідовності або геномну ДНК, і при цьому за певних обставин можуть бути присутні інтрони. У контексті цього опису термін "буряк звичайний" (Beta vulgaris) скорочено вказується як "B. vulgaris". Крім того, в описі вживається термін "буряк". Вищезгадані терміни вживаються взаємозамінно, і їх слід розуміти як такі, що повністю охоплюють культурні форми буряка звичайного, визначені у публікації Ford-Lloyd (2005) Sources of genetic variation, Genus Beta. In: Biancardi E, Campbell L G, Skaracis G N, De Biaggi M (eds) Genetics and Breeding of Sugar Beet. Science Publishers, Enfield (NH), USA, pp 25-33. Подібним чином, наприклад, термін "Arabidopsis thaliana" скорочено вказується як "A. thaliana". Обидва терміни вживаються взаємозамінно. Термін "позиція", вжитий згідно з даним винаходом, означає або позицію амінокислоти в описаній авторами амінокислотній послідовності, або позицію нуклеотиду в описаній авторами нуклеотидній послідовності. Термін "відповідний" у контексті даного опису також передбачає, що позиція не лише визначається кількістю попередніх нуклеотидів / амінокислот. Позиція даного нуклеотиду згідно з даним винаходом, який може бути заміщений, може змінюватися через делеції або додаткові нуклеотиди у будь-якому місці 5’-нетрансльованої ділянки (UTR) ALS, включаючи промоторні та/або будь-які інші регуляторні послідовності або ген (включаючи екзони та інтрони). Подібним чином позиція даної амінокислоти згідно з даним винаходом, яка може бути заміщена, може змінюватися через делецію або додавання амінокислот у буд-якому іншому місці поліпептиду ALS. Таким чином, під "відповідною позицією" згідно з даним винаходом слід розуміти, що нуклеотиди / амінокислоти можуть відрізнятися за вказаним номером, але все одно можуть мати подібні сусідні нуклеотиди / амінокислоти. Вищезгадані нуклеотиди / амінокислоти, які можуть бути замінені, видалені або додані, також охоплюються терміном "відповідна позиція". Для того, щоб визначити, чи відповідає нуклеотидний залишок або амінокислотний залишок у даній нуклеотидній / амінокислотній послідовності ALS певній позиції у нуклеотидній послідовності SEQ ID NO: 1 або амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 2, спеціаліст у даній галузі може застосовувати засоби та способи, добре відомі спеціалістам у даній галузі, наприклад, вирівнювання, ручні або за допомогою комп'ютерних програм, таких, як BLAST (Altschul et al. (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403-410), тобто, Basic Local Alignment Search Tool, або ClustalW (Thompson et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673-4680), або будьякої іншої прийнятної програми, яка є прийнятною для створення лінійних послідовностей. SEQ ID NO: 1 представляє нуклеотидну послідовність, яка кодує ALS дикого типу буряка звичайного. SEQ ID NO: 2 представляє амінокислотну послідовність буряка звичайного, яка походить від SEQ ID NO: 1. 5 UA 113721 C2 5 10 15 20 Відповідним чином, кодон у позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 1 кодує амінокислоту у позиції 569 (тобто, амінокислоту "Trp" згідно з трилітерним кодом або "W" згідно з однолітерним кодом) SEQ ID NO: 2. В альтернативному варіанті, для того, щоб визначити, чи відповідає нуклеотидний залишок або амінокислотний залишок у даній нуклеотидній / амінокислотній послідовності ALS певній позиції у нуклеотидній послідовності SEQ ID NO: 1, може використовуватися нуклеотидна послідовність, яка кодує ALS дикого типу A. thaliana, яку показано у SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 6 представляє амінокислотну послідовність A. thaliana, яка походить від SEQ ID NO: 5. Відповідним чином, кодон у позиції 1720-1722 нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 5 кодує амінокислоту у позиції 574 (тобто, амінокислоту "Trp" згідно з трилітерним кодом або "W" згідно з однолітерним кодом) SEQ ID NO. 6. Якщо нуклеотидна послідовність ALS дикого типу A. thaliana, показана у SEQ ID NO: 5, застосовується як контрольна послідовність (як описується у більшості літературних джерел, а отже, застосовується для полегшення порівняння з такими відомими послідовностями), кодон, який кодує амінокислоту, відмінну від триптофану, перебуває у позиції, що відповідає позиції 1720-1722 нуклеотидної послідовності ALS гена A. thaliana, показаній у SEQ ID NO: 5. Однак SEQ ID NO: 1 віддають перевагу як контрольній нуклеотидній послідовності, а SEQ ID NO: 2 віддають перевагу як контрольній амінокислотній послідовності в усіх наступних описах. Представлена нижче таблиця являє собою огляд контрольних послідовностей, які застосовують при визначенні позиції точкової мутації у нуклеотидній послідовності або заміщення в амінокислотній послідовності: SEQ ID NO: 1 2 3 4 5 6 25 30 35 40 45 50 Тип послідовності нуклеотидна послідовність амінокислотна послідовність нуклеотидна послідовність (мутована) амінокислотна послідовність (мутована) нуклеотидна послідовність амінокислотна послідовність Вид B. vulgaris B. vulgaris B. vulgaris B. vulgaris A. thaliana A. thaliana Таким чином, у будь-якому разі рівноцінна позиція може бути визначена через вирівнювання та співставлення з контрольною послідовністю, такою, як SEQ ID NO: 1 або 5 (нуклеотидна послідовність) або SEQ ID NO: 2 або 6 (амінокислотна послідовність). З огляду на розбіжності між ALS геном дикого типу B. vulgaris та ALS геном, який міститься у рослині B. vulgaris згідно з даним винаходом, ALS ген (або полінуклеотидна чи нуклеотидна послідовність), що міститься в рослині B. vulgaris згідно з даним винаходом, також може вважатися "мутантним ALS геном", "мутантним ALS алелем", "мутантним ALS полінуклеотидом" і т. ін. Таким чином, в у сьому тексті цього опису терміни "мутантний алель", "мутантний ALS алель", "мутантний ALS ген" або "мутантний ALS полінуклеотид" вживаються взаємозамінно. Якщо не вказано іншого, ці терміни стосуються нуклеотидної послідовності, яка включає кодон, який кодує амінокислоту, відмінну від триптофану, у позиції, яка відповідає позиції 17051707 нуклеотидної послідовності ALS гена B. vulgaris, показаної у SEQ ID NO: 1. Якщо йдеться про контрольну послідовність A. thaliana, показану у SEQ ID NO: 5, позиція кодону відповідає 1720-1722. Подібним чином ці терміни стосуються нуклеотидної послідовності, яка кодує білок ALS, який у позиції, яка відповідає позиції 569 амінокислотної послідовності білка ALS буряка звичайного, показаній у SEQ ID NO: 2, має амінокислоту, відмінну від триптофану. Якщо йдеться про контрольну послідовність A. thaliana, показану у SEQ ID NO: 6, позиція відповідає 574. "Амінокислота, відмінна від триптофану" (позначається як "Trp" у трилітерному коді або "W" у рівноцінному однолітерному коді) означає будь-яку природну амінокислоту, відмінну від триптофану. До цих природних амінокислот належать аланін (A), аргінін (R), аспарагін (N), аспартат (D), цистеїн (C), глутамін (Q), глутамат (E), гліцин (G), гістидин (H), ізолейцин (I), лейцин (L), лізин (K), метіонін (M), фенілаланін (F), пролін (P), серин (S), треонін (T), тирозин (Y) або валін (V). Однак в оптимальному варіанті амінокислота, відмінна від триптофану (що належить до групи нейтрально-полярних амінокислот), є амінокислотою з фізико-хімічними властивостями, відмінними від властивостей триптофану, тобто, належить до будь-якої з амінокислот, які виявляють нейтрально-неполярні, кислотні або основні властивості. У ще кращому варіанті амінокислоту, відмінну від триптофану, вибирають з групи, до якої належать аланін, гліцин, 6 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ізолейцин, лейцин, метіонін, фенілаланін, пролін, валін та аргінін. У ще кращому варіанті вищезгадана амінокислота є нейтрально-неполярною амінокислотою, такою, як аланін, гліцин, ізолейцин, лейцин, метіонін, фенілаланін, пролін або валін. Особливу перевагу серед вищезгаданих амінокислот віддають таким, як аланін, гліцин, ізолейцин, лейцин, валін. Ще кращими вважаються гліцин та лейцин. Найбільшу перевагу віддають лейцинові. Натомість, якщо не вказано іншого, терміни "алель дикого типу, " "ALS алель дикого типу", "ALS ген дикого типу" або "полінуклеотид ALS дикого типу" стосуються нуклеотидної послідовності, яка кодує білок ALS, у якому відсутнє W569 заміщення відносно SEQ ID NO: 2 (або W574 заміщення відносно SEQ ID NO: 6). Ці терміни також стосуються нуклеотидної послідовності, яка у позиції, що відповідає позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності ALS гена B. Vulgaris, показаної у SEQ ID NO: 1, включає кодон, який кодує амінокислоту, відмінну від триптофану. Такий "алель дикого типу", "ALS алель дикого типу", "ALS ген дикого типу" або "полінуклеотид ALS дикого типу" необов'язково може включати мутації, відмінні від мутації, що викликає W569 заміщення. По суті, якщо йдеться про ALS ген, єдина розбіжність між рослиною B. vulgaris дикого типу та рослиною B. vulgaris згідно з даним винаходом в оптимальному варіанті (і головним чином) полягає в тому, що у зазначеній позиції (зокрема, у позиції, яка відповідає позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності ALS гена B. Vulgaris, показаній у SEQ ID NO: 1), рослина B. vulgaris згідно з даним винаходом включає кодон, який кодує амінокислоту, відмінну від триптофану, в оптимальному варіанті кодон кодує амінокислоту, як вказано у будь-яких інших розділах цього опису. Однак, як було згадано вище, можуть бути наявними інші розбіжності, такі, як додаткові мутації, між ALS алелем дикого типу та мутантним ALS алелем, як вказується авторами. Втім, ці додаткові розбіжності не є релевантними за наявності розбіжностей, які пояснювалися вище. Отже, W569 заміщення (або W574 заміщення, якщо амінокислотну послідовність ALS A. thaliana згідно з SEQ ID NO: 6 використовують як контрольну) є результатом зміни кодону в позиції, яка відповідає позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності, показаної у SEQ ID NO: 1 (або у позиції, яка відповідає позиції 1720-1722 нуклеотидної послідовності, показаної у SEQ ID NO: 5, відповідно). В оптимальному варіанті заміщення у позиції 569 є W→L заміщенням, де "L" кодується будьяким з кодонів "CTT", "CTC", "CTA", "CTG", "TTA" або "TTG". У найкращому варіанті заміщення у позиції 569 є W→L заміщенням через трансверсію нуклеотиду "G" у позиції, яка відповідає позиції 1706 нуклеотидної послідовності, показаної у SEQ ID NO: 1 (або у позиції, яка відповідає позиції 1721 нуклеотидної послідовності, показаної у SEQ ID NO: 5, відповідно) на нуклеотид "T". Відповідним чином, кодон у позиції, яка відповідає позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності, показаної у SEQ ID NO: 1 (або у позиції, яка відповідає позиції 1720-1722 нуклеотидної послідовності, показаної у SEQ ID NO: 5,відповідно) змінюється з "TGG" на "TTG". Якщо кодон "TGG" кодує триптофан, то кодон "TTG" кодує лейцин. Отже, у варіанті втілення, якому віддають найбільшу перевагу, даний винахід забезпечує рослину буряка звичайного, яка включає у нуклеотидній послідовності ендогенного ALS гена кодон TTG (який кодує лейцин) у позиції, яка відповідає позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності мутантного ALS гена B. Vulgaris, показаної у SEQ ID NO: 1, причому вищезгадана нуклеотидна послідовність включає SEQ ID NO: 3 (або у менш бажаному варіанті складається з неї). Рослини B. Vulgaris, які кодують поліпептид ALS, який у позиції, що відповідає позиції 569 амінокислотної послідовності білка ALS буряка звичайного, показаної у SEQ ID NO: 2, має амінокислоту, відмінну від триптофану, в оптимальному варіанті включають у нуклеотидній послідовності ендогенного ALS гена кодон, який кодує амінокислоту, відмінну від триптофану, у позиції, яка відповідає позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності ALS гена B. Vulgaris, показаної у SEQ ID NO: 1. Термін "ALS" або "AHAS" ген B. vulgaris також охоплює нуклеотидні послідовності B. Vulgaris, які є принаймні на 90, 95, 97, 98 або 99 % ідентичними нуклеотидній послідовності ALS B. vulgaris згідно з SEQ ID NO: 1 або 3, причому ці на 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 або 99 % ідентичні нуклеотидні послідовності у позиції, яка відповідає позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 1, включають кодон, який кодує амінокислоту, відмінну від триптофану. Подібним чином ці принаймні на 90, 95, 97, 98 або 99 % ідентичні нуклеотидні послідовності кодують поліпептид ALS, який у позиції, яка відповідає позиції 569 SEQ ID NO: 2, включає амінокислоту, відмінну від триптофану. Вищезгадані ідентичні нуклеотидні послідовності кодують білок ALS, який зберігає активність, як описано авторами, у ще кращому варіанті 7 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кодований таким чином поліпептид ALS є толерантним до одного або кількох інгібуючих ALS гербіцидів, як описано авторами. Вищезазначений термін також охоплює алельні варіанти та гомологи, які кодують поліпептид ALS, який в оптимальному варіанті є толерантним до одного або кількох інгібуючих ALS гербіцидів, як описано авторами. Для того, щоб визначити, чи має нуклеїновокислотна послідовність певний ступінь ідентичності з нуклеотидними послідовностями згідно з даним винаходом, спеціаліст у даній галузі може застосовувати засоби та способи, добре відомі спеціалістам у даній галузі, наприклад, вирівнювання, ручні або за допомогою комп'ютерних програм, таких, як ті, що вказуються нижче у зв'язку з визначенням терміну "гібридизація" та ступенями гомології. Наприклад, може застосовуватися BLAST, тобто, Basic Local Alignment Search Tool (Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), для пошуку місцевих збігів послідовностей. BLAST забезпечує вирівнювання як нуклеотидних, так і амінокислотних послідовностей для визначення подібності послідовностей. Через місцевий характер вирівнювання програма BLAST є особливо придатною для визначення точних збігів або для розпізнавання подібних послідовностей. Основною одиницею результату роботи алгоритму BLAST є пара сегментів з високою подібністю (Highscoring Segment Pair – HSP). HSP складається з двох фрагментів послідовності довільної, але однакової довжини, збіг яких у цьому місці є максимальним, і для яких показник збігу дорівнює пороговому або критичному показникові, встановленому користувачем, або перевищує його. Підхід з застосуванням BLAST передбачено для пошуку HSP між послідовністю запиту та послідовністю бази даних для оцінки статистичної значущості будь-яких виявлених збігів і для повідомлення лише про ті збіги, які відповідають вибраному користувачем порогові значущості. Параметр E визначає статистично значущий поріг для збігів послідовності зі звітною базою даних. E представляє верхню межу очікуваної частоти ймовірності HSP (або набору HSP) у межах пошуку в усій базі даних. Будь-яка послідовність бази даних, збіг якої відповідає E, повідомляється у результаті виконання програми. Аналогічні комп'ютерні технології з застосуванням BLAST (Altschul (1997), loc. cit.; Altschul (1993), loc. cit.; Altschul (1990), loc. cit.) використовують для пошуку ідентичних або споріднених молекул у базах даних нуклеотидів, таких, як GenBank або EMBL. Цей аналіз є значно швидшим, ніж гібридизація на основі багатошарових мембран. Крім того, чутливість комп'ютерного пошуку може бути змінена для визначення категорії будь-якої відповідності як точної або подібної. Основою цього пошуку є показник добутку, що визначається як: % ідентичності послідовності x % максимальний показник BLAST 100 з врахуванням як ступеня подібності між двома послідовностями, так і довжини збігу послідовностей. Наприклад, при показнику добутку 40 відповідність має точність у межах похибки 1-2 %; а при 70 відповідність є точною. Подібні молекули зазвичай розпізнають шляхом відбору молекул з низькими показниками добутку від 15 до 40, хоча нижчі показники можуть визначати споріднені молекули. Термін "поліпептид ALS" або "AHAS" B. vulgaris також охоплює амінокислотні послідовності, які є принаймні на 90, 95, 97, 98 або 99 % ідентичними амінокислотній послідовності ALS згідно з SEQ ID NO: 2 або 4, причому ці принаймні на 90, 95, 97, 98 або 99 % ідентичні амінокислотні послідовності у позиції, яка відповідає позиції 569 SEQ ID NO: 2, включають амінокислоту, відмінну від триптофану. Вищезгадані ідентичні амінокислотні послідовності зберігають активність ALS, як описано авторами, у ще кращому варіанті поліпептид ALS є толерантним до інгібуючих ALS гербіцидів, як описано авторами. Активність ALS у разі необхідності може бути виміряна згідно з аналізом, описаним у публікації Singh (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88:4572-4576. Однак вказані авторами нуклеотидні послідовності ALS, які кодують поліпептид ALS, в оптимальному варіанті забезпечують толерантність до одного або кількох інгібуючих ALS гербіцидів (або, навпаки, меншу чутливість до інгібуючого ALS гербіциду), як описано авторами. Це відбувається через точкову мутацію, що веде до заміщення амінокислот, як описано авторами. Відповідним чином, толерантність до інгібуючого ALS гербіциду (або, навпаки, менша чутливість до інгібуючого ALS гербіциду) може вимірюватися шляхом порівняння активності ALS, одержаної з екстрактів клітин рослин, які містять мутовану послідовність ALS, та рослин з відсутністю мутованої послідовності ALS у присутності інгібуючого ALS гербіциду, як описується, наприклад, у публікації Singh et al (1988) [J. Chromatogr., 444, 251-261]. Однак ще кращий аналіз активності для поліпептиду ALS, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка включає кодон, який кодує амінокислоту, відмінну від триптофану у позиції, 8 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 яка відповідає позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності ALS гена B. Vulgaris, показаної у SEQ ID NO: 1, може здійснюватися таким чином: Кодуючу послідовність дикого типу буряка звичайного та мутантної рослини B. vulgaris клонують, наприклад, у вектори Novagen pET-32a(+) і вектори трансформують, наприклад, в AD494 Escherichia coli згідно з інструкціями виробника. Бактерії в оптимальному варіанті вирощують при 37 °C у середовищі під тиском відбору, наприклад, в LB-середовищі, яке містить 100 мг/л карбеніциліну та 25 мг/л канаміцину, стимулюють, використовуючи, наприклад, 1 мM ізопропіл-β-D-тіогалактопіранозиду при оптимальному OD600 приблизно 0,6, культивують протягом приблизно 16 годин, в оптимальному варіанті при 18 °C і збирають шляхом центрифугування. Згустки бактерій ресуспендують у 100 мM буфера з фосфату натрію, pH 7,0, який містить 0,1 мM тіамінпірофосфату, 1 мM MgCl 2 та 1 мкM FAD, у концентрації 1 г сирої маси на 25 мл буфера і руйнують шляхом ультразвукової обробки. Неочищений білковий екстракт, одержаний після центрифугування, використовують для вимірювання активності ALS. Після цього здійснюють аналізи ALS, наприклад, у 96-лункових мікротитрувальних планшетах, застосовуючи модифікацію процедури, описаної у публікації Ray (1984), Plant Physiol., 75, 827-831. Реакційна суміш в оптимальному варіанті містить 20 мM буфера з фосфату калію, pH 7,0, 20 мM пірувату натрію, 0,45 мM тіамінпірофосфату, 0,45 мM MgCl 2, 9 мкM FAD, фермент ALS та інгібітори ALS у різних концентраціях у кінцевому об'ємі приблизно 90 мкл. Аналізи починають шляхом додавання ферменту і завершують в оптимальному варіанті після 75 хв інкубації при 30 °C шляхом додавання 40 мкл 0,5 M H2SO4. Приблизно через 60 хв при кімнатній температурі додають приблизно 80 мкл розчину 1,4 % α-нафтолу та 0,14 % креатину в 0,7 M NaOH і після додаткових приблизно 45 хв інкубації при кімнатній температурі визначають оптичну густину при 540 нм. Показники pI50 для інгібування ALS визначали, як описано у публікації Ray (1984)), Plant Physiol., 75, 827-831, застосовуючи програму апроксимації кривих по точках XLFit Excel, додаткова версія 4.3.1, від ID Business Solutions Limited, Guildford, Великобританія. При використанні рослин активність ALS в оптимальному варіанті визначають в екстрактах клітин або екстрактах листя дикого типу та екстрактах клітин або екстрактах листя одержаного мутанта B. vulgaris у присутності інгібуючих ALS гербіцидів у різних концентраціях, в оптимальному варіанті – сульфонілсечовинних гербіцидів або сульфоніламінокарбонілтріазолінонових гербіцидів, у ще кращому варіанті – у присутності інгібуючого ALS гербіциду "форамсульфурон" у різних концентраціях. Таким чином, ALS в оптимальному варіанті видобувають з листя цукрового буряка або культур тканин цукрового буряка, як описано у публікації Ray (1984) in Plant Physiol 75: 827-831. В оптимальному варіанті рослини B. vulgaris згідно з даним винаходом є менш чутливими до інгібітора ALS, у ще кращому варіанті вони є принаймні у 100 разів менш чутливими, у ще кращому варіанті – у 500 разів, у ще кращому варіанті – у 1000 разів, і у найкращому варіанті – у 2000 разів. І навпаки, менш чутливі у контексті цього опису можуть розглядатись як "більш толерантні" або "більш резистентні". Подібним чином "більш толерантні" або "більш резистентні" можуть, у свою чергу, розглядатись як "менш чутливі". Наприклад, рослини B. vulgaris згідно з даним винаходом, зокрема, рослина B. Vulgaris, описана у супровідних Прикладах, є принаймні у 2000 разів менш чутливими до інгібуючого ALS гербіциду форамсульфурону (належить до підкласу інгібіторів ALS "сульфонілсечовинні гербіциди") порівняно з ферментом дикого типу. В оптимальному варіанті рослини B. vulgaris згідно з даним винаходом є менш чутливими різних представників інгібуючих ALS гербіцидів, таких, як сульфонілсечовинні гербіциди, сульфоніламіно-карбонілтріазолінонові гербіциди та імідазолінонові гербіциди. В оптимальному варіанті вибирають сульфонілсечовинні гербіциди та сульфоніламінокарбонілтріазолінонові гербіциди, до яких вищезгадані рослини є менш чутливими. У варіанті, якому віддають особливу перевагу, рослини B. vulgaris згідно з даним винаходом є менш чутливими до інгібуючого ALS гербіциду форамсульфурону (сульфонілсечовинний гербіцид), окремо або у комбінації з одним або кількома іншими інгібуючими ALS гербіцидами, або з підкласу сульфонілсечовинних гербіцидів, або з будь-якого іншого підкласу інгібуючих ALS гербіцидів. Отже, рослини B. vulgaris згідно з даним винаходом, які в оптимальному варіанті є менш чутливими до інгібуючого ALS гербіциду, так само можуть характеризуватись як "більш толерантні до інгібітора ALS" (тобто, толерантні до інгібітора ALS рослини). Таким чином, "толерантна до інгібітора ALS" рослина означає рослину, зокрема, рослину B. Vulgaris, яка є більш толерантною до принаймні одного інгібуючого ALS гербіциду на рівні, який зазвичай інгібує ріст нормальної рослини дикого типу, в оптимальному варіанті інгібуючий ALS 9 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гербіцид стримує ріст нормальної рослини або рослини дикого типу. Вищезгадана нормальна рослина або рослина дикого типу не включає у нуклеотидній послідовності будь-якого алеля ендогенного ALS гена кодон, який кодує амінокислоту, відмінну від триптофану, у позиції, яка відповідає позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності ALS гена B. Vulgaris, показаної у SEQ ID NO: 1. Вищезгадана нуклеотидна послідовність в цілому також може характеризуватись як "толерантна до інгібуючого ALS гербіциду" нуклеотидна послідовність. Під "толерантною до інгібуючого ALS гербіциду нуклеотидною послідовністю" слід розуміти молекулу нуклеїнової кислоти, яка включає нуклеотидну послідовність, яка включає принаймні мутацію, яка в результаті забезпечує кодон, який кодує амінокислоту, відмінну від триптофану, відносно білка ALS, який не має у позиції, яка відповідає позиції 569 амінокислотної послідовності білка ALS B. Vulgaris, показаної у SEQ ID NO: 2, амінокислоти, відмінної від триптофану, причому вищезгадана принаймні одна мутація в результаті забезпечує експресію білка ALS, менш чутливого до інгібуючого ALS гербіциду. У разі "толерантного до гербіциду білка ALS" слід розуміти, що такий білок ALS демонструє вищу активність ALS відносно активності ALS білка ALS дикого типу у присутності принаймні одного інгібуючого ALS гербіциду, який перешкоджає активності ALS, і при концентрації або рівні вищезгаданого гербіциду, який інгібує активність ALS білка ALS дикого типу. Подібним чином терміни "інгібуючий(і) ALS гербіцид(и)" або просто "інгібітор(и) ALS" вживаються взаємозамінно. У контексті даного опису "інгібуючий ALS гербіцид" або "інгібітор ALS" не обмежується одним гербіцидом, який перешкоджає активності ферменту ALS. Таким чином, якщо іншого не вказано і не випливає з контексту, "інгібуючий ALS гербіцид" або "інгібітор ALS" може бути одним гербіцидом або сумішшю двох, трьох, чотирьох або більшої кількості гербіцидів, відомих спеціалістам у даній галузі, в оптимальному варіанті – таких, як зазначено в цьому описі, кожен з яких перешкоджає активності ферменту ALS. Несподівано було виявлено, що навіть одна точкова мутація згідно з даним винаходом забезпечує агрономічно ефективний і стійкий рівень толерантності до інгібуючих ALS гербіцидів у рослинах B. Vulgaris, а також у їхньому потомстві, зокрема, при встановленні гомозиготності. Порівняно з толерантними до гербіцидів рослинами буряка звичайного з однаковим генетичним середовищем, у яких така мутація є присутньою лише гетерозиготно, толерантна до гербіцидів рослини буряка звичайного, яка є гомозиготною щодо мутації, демонструє вищий агрономічний рівень толерантності до інгібуючих ALS гербіцидів. Отже, даний винахід стосується толерантної до інгібуючих ALS гербіцидів рослини буряка звичайного, яка має мутацію ендогенного гена ацетолактатсинтази (ALS), причому ALS ген кодує поліпептид ALS, який містить амінокислоту, відмінну від триптофану, у позиції 569 поліпептиду ALS. Відповідна мутація може бути присутньою гетерозиготно і в оптимальному варіанті може бути єдиною мутацією ALS гена. У ще кращому варіанті відповідна мутація може бути гомозиготно присутньою, і у найкращому варіанті відповідна мутація є гомозиготно присутньою як єдина мутація ендогенного ALS гена. Також не варто очікувати, що лише одна мутація ALS гена у буряку звичайному має бути достатньою, оскільки, наприклад, у документі WO 2010/037061 вказано, що подвійні або потрійні мутанти у гені ALS є необхідними для надання агрономічно ефективної толерантності до інгібуючих ALS гербіцидів. Отже, рослини B. vulgaris та їх частини, які є гетерозиготними щодо мутації, є менш бажаними, але вони все ж охоплюються даним винаходом і можуть бути достатніми для певних режимів внесення та/або певних навколишніх умов. Також даний винахід охоплює рослини, які містять принаймні в одному алелі ендогенного ALS гена кодон, який кодує амінокислоту, відмінну від триптофану, в оптимальному варіанті – лейцин у позиції, яка відповідає позиції 1705-1707 нуклеотидної послідовності ALS гена B. vulgaris, показаній у SEQ ID NO: 1, і містять один (у разі диплоїдії) або кілька додаткових алелів (у разі поліплоїдії), які мають одну або кілька додаткових мутацій в ендогенному ALS гені. Відповідним чином, у контексті цього опису термін "гетерозиготний" або "гетерозиготно" означає, що рослина згідно з даним винаходом має різні алелі у конкретному локусі, зокрема, у локусі ALS гена. "Гомозиготний" або "гомозиготно" означає, що рослина згідно з даним винаходом має дві копії одного алеля на різних ланцюгах ДНК, зокрема, у локусі ALS гена. У контексті даного опису, якщо чітко не вказано іншого, термін "рослина" означає рослину на будь-якій стадії розвитку. В оптимальному варіанті рослина буряка звичайного згідно з даним винаходом є ортоплоїдною або анортоплоїдною. Ортоплоїдна рослина в оптимальному варіанті може бути 10 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гаплоїдною, диплоїдною, тетраплоїдною, гексаплоїдною, октаплоїдною, декаплоїдною або додекаплоїдною, тоді, як анортоплоїдна рослина в оптимальному варіанті може бути триплоїдною або пентаплоїдною. Частини рослин можуть приєднуватися або відокремлюватися від цілої інтактної рослини. До таких частин, крім інших, належать органи, тканини та клітини рослини, в оптимальному варіанті – насіння. Відповідним чином, рослина B. vulgaris згідно з даним винаходом є нетрансгенною стосовно ендогенного ALS гена. Звичайно, чужорідні гени можуть бути перенесені у рослину або шляхом генної інженерії, або традиційними способами, такими, як схрещування. Вищезгадані гени можуть бути генами, які надають толерантності до гербіцидів, в оптимальному варіанті – толерантності до гербіцидів, відмінної від толерантності до інгібуючих ALS гербіцидів, генами, які поліпшують врожайність, генами, які поліпшують резистентність до біологічних організмів, та/або генами, пов'язаними з модифікацією складу. В іншому аспекті даний винахід стосується способу одержання рослини буряка звичайного та її частин, який включає такі етапи: -7 (a) піддавання калюсів, в оптимальному варіанті – з цукрового буряка, дії приблизно 10 M-9 10 M інгібуючого ALS гербіциду, в оптимальному варіанті – форамсульфурону; -6 (b) відбір колоній клітин, які можуть рости у присутності до 3  10 M інгібуючого ALS гербіциду, в оптимальному варіанті – форамсульфурону [CAS RN 173159-57-4]; (c) регенерація пагонів у присутності інгібуючого ALS гербіциду, в оптимальному варіанті – форамсульфурону; (d) відбір регенерованих паростків за допомогою інгібуючого ALS гербіциду, в оптимальному варіанті – форамсульфурону, йодосульфурон-метил-натрію [CAS RN 144550-36-7] та/або їх суміші, причому доза форамсульфурону в оптимальному варіанті є еквівалентною 7-70 г a.i./га, і доза йодосульфурон-метил-натрію в оптимальному варіанті є еквівалентною 1-10 г a.i./га. В іншому аспекті регенеровані паростки,одержані згідно з вищезазначеними процесами (a) до (d), можуть використовуватися для подальшого одержання рослин буряка звичайного шляхом застосування таких етапів з (e) по (m): (e) вегетативне розмноження окремих паростків з етапу (d) для збереження різних позитивних варіантів шляхом створення лінії клітин (клону) кожного толерантного до інгібуючих ALS гербіцидів паростка; (f) довготривале зберігання кожного створеного клону у вегетативному стані; (g) перенесення клонованих рослин кожного клону з місця довготривалого зберігання до теплиці; (h) яровизація та адаптація у яровизаційних камерах для викликання цвітіння; (i) перенесення яровизованих рослин до приміщень для вирощування (з регулюванням температури та світла); (j) відбір рослин з найкращим летом пилку з клонів з найкращим цвітінням для схрещування з кастрованими рослинами елітної, але чутливої до інгібуючого ALS гербіциду лінії для подолання негативного впливу соматоклонального варіанта на генеративну фертильність (чоловічу та жіночу) паростків з етапу (d); (k) зворотне схрещування з елітною лінією до відновлення фертильності та досягнення самозапиленими гетерозиготними рослинами гомозиготного стану; (l) одержання тест-кросів з чутливим до інгібуючого ALS гербіциду партнером та самозапиленого насіння кожної підданої зворотному схрещуванню лінії для оцінки у польових умовах; (m) внесення агрономічно прийнятних доз різних інгібуючих ALS гербіцидів для відбору найбільш ефективної лінії, в оптимальному варіанті – у її гомозиготному стані. Лінії, одержані згідно з вищезазначеними етапами з (a) по (m), складають основу для виведення комерційних сортів через дотримання процедур, відомих серед селекціонерів, із залученням технологій молекулярної селекції (такими, як схрещування з використанням маркера або відбір з використанням маркера) для прискорення процесів та забезпечення належного відбору рослин або для одержання мутації в її гомозиготній формі, або, у разі наявності однієї або кількох мутацій у різних місцях кодуючого ендогенного ALS гена, для виконання належного відбору гетерозиготних рослин, які містять принаймні в одному з алелів W569 мутацію згідно з даним винаходом (огляд міститься у публікації Bertrand C.Y. et al. (2008), Phil. Trans. R. Soc, B., 363, 557-572). Калюси одержують, застосовуючи засоби та способи, загальновідомі серед спеціалістів у даній галузі, наприклад, як описано у супровідних Прикладах. 11 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Насіння, одержане на етапі (m), було депоновано у NCIMB (Національній колекції промислових, харчових та морських бактерій), Aberdeen, Великобританія, під номером NCIMB 41705. В іншому аспекті даний винахід стосується способу одержання толерантної до гербіцидів рослини буряка звичайного та її частин, який включає (i) мутацію ендогенного гена ацетолактатсинтази (ALS), причому ALS ген кодує поліпептид ALS, який містить амінокислоту, відмінну від триптофану, у позиції 569 поліпептиду ALS, та (ii) додаткову мутацію в ендогенному ALS гені, причому спосіб включає такі етапи: (a) одержання толерантної до інгібуючих ALS гербіцидів рослини буряка звичайного, яка включає мутацію ендогенного гена ацетолактатсинтази (ALS), причому ALS ген кодує поліпептид ALS, який містить амінокислоту, відмінну від триптофану, у позиції 569 поліпептиду ALS (батьківська рослина A); (b) схрещування батьківської рослини A з рослиною буряка звичайного (батьківська рослина B), яка містить одну або кілька додаткових мутацій в ендогенному ALS гені у позиціях, відмінних від амінокислотної позиції 569; (c) одержання потомства буряка звичайного, яке є гетерозиготним щодо мутації ALS гена амінокислотної позиції 569 і однієї або кількох інших мутацій ALS гена, які кодуються батьківською рослиною B; (d) причому процес селекції контролюють через (i) застосування схрещування з використанням маркера та/або технологій мікросеквенування і/або (ii) внесення агрономічно прийнятних доз одного або кількох інгібуючих ALS гербіцидів, до яких виведене потомство згідно з етапом (c) є толерантним. Відповідним чином, передбачається, що даний винахід також стосується рослин B. Vulgaris, які можуть бути одержані з застосуванням вищезгаданих способів виробництва. У необмежувальному прикладі рослини цукрового буряка згідно з даним винаходом одержували шляхом виконання описаного нижче необмежувального протоколу. Без прив'язування до будь-якої теорії такий самий протокол також може застосовуватися для одержання рослин B. Vulgaris, відмінних від цукрового буряка. Клітинні культури цукрового буряка одержували з сіянців диплоїдного цукрового буряка генотипу 7T9044 (як описано, наприклад, у публікації Alexander Dovzhenko, PhD Thesis, "Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.) and sugarbeet (Beta vulgaris L.)”, Ludwig-Maximilians-Universität München, Німеччина, 2001). Насіння цукрового буряка занурювали на 60 секунд у 70 %-й етанол, потім двічі промивали у стерильній воді з 0,01 % детергента, а потім інкубували протягом 1-4 годин в 1 % вилуговувачі NaOCl. Після цього насіння тричі промивали стерильною H2O і зберігали у стерильній воді до наступного дня при 4 °C. Після цього зародки відокремлювали за допомогою пінцета та скальпеля. Щойно підготовлені зародки занурювали у 0,5 % NaOCl на 30 хв, а потім тричі промивали у стерильній воді. Після останнього етапу промивання їх поміщали на безгормональне MSагарове середовище (Murashige and Skoog (1962), Physiol. Plantarum, 15, 473-497). Зародки, з яких розвинулися стерильні сіянці, використовували для закладання клітинних культур цукрового буряка, що піддаються регенерації. Сім'ядолі, а також гіпокотилі розрізали на відрізки по 2-5 мм завдовжки, a потім культивували на затвердженому агаром (0,8 %) MS-агаровому середовищі, яке містило 1 мг/л бензиламінопурину (BAP) або 0,25 мг/л тидіазурону (TDZ). Через 4 тижні культури пагонів, що розвивалися, переносили на свіже агарове середовище такого самого складу, а потім субкультивували з одномісячними інтервалами. Культури тримали при 25 °C при тьмяному світлі з циклом 12 год. / 12 год. світла/темряви. Через 7-10 днів субкультивування культури пагонів, які вирощували на середовищі, яке містило тидіазурон, утворювали калюс чіткого типу, який був швидко зростаючим, м'яким і крихким. Колір цього типу калюсу був від жовтуватого до світло-зеленого. Деякі з цих крихких калюсів незмінно продукували хлорофіловмісні примордії пагонів з зародкоподібних утворень. Ці швидко зростаючі калюси, що піддавалися регенерації, застосовували для відбору толерантних до інгібуючих ALS гербіцидів мутантів цукрового буряка. -9 Коли цей тип калюсу піддавали дії 10 M сульфонілсечовини форамсульфурону (CAS RN 173159-57-4), клітини виживали, але продукували менше, ніж 50 % біомаси їхніх сиблінгів на -8 середовищі, позбавленому інгібітора. На середовищі, яке містило 3 × 10 M форамсульфурону, -7 ріст не виявлявся. Для великомасштабних експериментів з селекції мутантів вибирали 10 M форамсульфурону. Колонії клітин, які вижили й зростали, нумерували й переносили через 4-6 12 UA 113721 C2 -7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тижнів на свіже середовище, яке містило 3 × 10 M інгібітора. Одна з цих колоній клітин була -6 здатна зростати не лише при цій концентрації інгібітора, але й у присутності 3 × 10 M форамсульфурону. З цього клону (SB574TL) регенерували пагони у присутності інгібуючого ALS гербіциду, а потім пагони переносили до MS-середовища, яке містило 0,05 мг/л нафталіноцтової кислоти (NAA). Протягом 4-12 тижнів у пагонів формувалося коріння, а потім їх переносили у стерильні тепличні контейнери, заповнені вологим стерилізованим перлітом, і поливали з неорганічними інгредієнтами MS-середовища половинної концентрації. В альтернативному варіанті паростки переносили прямо з затвердженого агаром середовища у ґрунтову суміш з вмістом перліту у теплиці. Протягом перших 10-15 днів після перенесення у ґрунт, який містить субстрат, рослини тримали у середовищі з високою вологістю повітря. Під час та після їх переведення на режим нормальної тепличної вологості повітря рослини тримали у теплиці під штучним світлом (12 год.) при 20 +-3 °C / 15+-2 °C денної/нічної температури. Через 3-5 тижнів регенеровані рослини з підготовлених раніше толерантної до форамсульфурону культури клітин (SB574TL), а також з культур клітин дикого типу обробляли форамсульфуроном, йодосульфурон-метил-натрієм (CAS RN 144550-3-7) та сумішшю обох активних інгредієнтів. Випробувані дози гербіциду були еквівалентні 7-70 г a.i./га для форамсульфурону і 1-10 г a.i./га для йодосульфурон-метил-натрію. Регенеровані рослини з цієї толерантної лінії клітин витримували навіть найвищі дози гербіцидів (форамсульфурону, йодосульфурон-метил-натрію та їхніх сумішей у співвідношенні 7:1, тоді, як рослини дикого типу гинули навіть від найнижчих доз. Потомство випробували описаним нижче способом (необмежувальним): На основі SB574TL насіння F2 та F3 експериментальних гібридів, які забезпечують алель резистентності у гетерозиготному стані, а також насіння F4 – F6, що забезпечує мутантний алель у гомозиготному стані, висівали у полі й обробляли форамсульфуроном, йодосульфуронметил-натрієм, а також сумішами обох інгібуючих ALS гербіцидів, коли у рослин розвивалися 35 листів розетки. Гомозиготні сіянці витримували суміші 35 г форамсульфурону/га + 7 г йодосульфурон-метил-натрію/га без затримки росту або будь-яких ознак видимої шкоди. У кількох випадках гетерозиготні лінії при такій кількості демонстрували ознаки уповільненого росту та певний хлороз листя, але вони відновлювалися за 3-5 тижнів, тоді, як звичайні сіянці цукрового буряка гинули від інгібуючих ALS гербіцидів. ALS-мутанти характеризували таким чином: Видобування та аналіз нуклеїновокислотної послідовності одержаного мутанта здійснювали за допомогою LGC Genomics GmbH, Берлін, Німеччина, згідно зі зміненими стандартними протоколами. Нуклеїновокислотну послідовність, одержану з мутанта цукрового буряка SB574TL, показано у SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 4 представляє відповідну амінокислотну послідовність, тоді, як SEQ ID NO: 1 одержували після секвенування послідовності рослини цукрового буряка дикого типу, яку брали як вихідний матеріал. SEQ ID NO: 2 представляє відповідну амінокислотну послідовність цукрового буряка дикого типу. Порівняння цих послідовностей виявляє лише одну мутацію у позиції 574, але більше не відбувалося ніяких змін у жодній іншій частині цього ендогенного ALS гена. SEQ ID No 1 (1) ATGGCGGCTACCTTCACAAACCCAACATTTTCCCCTTCCTCAACTCCATTAACCAAAACC SEQ ID No 3 (1) ATGGCGGCTACCTTCACAAACCCAACATTTTCCCCTTCCTCAACTCCATTAACCAAAACC SEQ ID No 1 (61) CTAAAATCCCAATCTTCCATCTCTTCAACCCTCCCCTTTTCCACCCCTCCCAAAACCCCA SEQ ID No 3 (61) CTAAAATCCCAATCTTCCATCTCTTCAACCCTCCCCTTTTCCACCCCTCCCAAAACCCCA SEQ ID No1 (121) ACTCCACTCTTTCACCGTCCCCTCCAAATCTCATCCTCCCAATCCCACAAATCATCCGCC SEQ ID No 3 (121) 13 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ACTCCACTCTTTCACCGTCCCCTCCAAATCTCATCCTCCCAATCCCACAAATCATCCGCC SEQ ID No 1 (181) ATTAAAACACAAACTCAAGCACCTTCTTCTCCAGCTATTGAAGATTCATCTTTCGTTTCT SEQ ID No 3 (181) ATTAAAACACAAACTCAAGCACCTTCTTCTCCAGCTATTGAAGATTCATCTTTCGTTTCT SEQ ID No 1 (241) CGATTTGGCCCTGATGAACCCAGAAAAGGGTCCGATGTCCTCGTTGAAGCTCTTGAGCGT SEQ ID No 3 (241) CGATTTGGCCCTGATGAACCCAGAAAAGGGTCCGATGTCCTCGTTGAAGCTCTTGAGCGT SEQ ID No 1 (301) GAAGGTGTTACCAATGTGTTTGCTTACCCTGGTGGTGCATCTATGGAAATCCACCAAGCT SEQ ID No 3 (301) GAAGGTGTTACCAATGTGTTTGCTTACCCTGGTGGTGCATCTATGGAAATCCACCAAGCT SEQ ID No 1 (361) CTCACACGCTCTAAAACCATCCGCAATGTCCTCCCTCGCCATGAACAAGGCGGGGTTTTC SEQ ID No 3 (361) CTCACACGCTCTAAAACCATCCGCAATGTCCTCCCTCGCCATGAACAAGGCGGGGTTTTC SEQ ID No 1 (421) GCCGCCGAGGGATATGCTAGAGCTACTGGAAAGGTTGGTGTCTGCATTGCGACTTCTGGT SEQ ID No 3 (421) GCCGCCGAGGGATATGCTAGAGCTACTGGAAAGGTTGGTGTCTGCATTGCGACTTCTGGT SEQ ID No 1 (481) CCTGGTGCTACCAACCTCGTATCAGGTCTTGCTGACGCTCTCCTTGATTCTGTCCCTCTT SEQ ID No 3 (481) CCTGGTGCTACCAACCTCGTATCAGGTCTTGCTGACGCTCTCCTTGATTCTGTCCCTCTT SEQ ID No 1 (541) GTTGCCATCACTGGCCAAGTTCCACGCCGTATGATTGGCACTGATGCTTTTCAGGAGACT SEQ ID No 3 (541) GTTGCCATCACTGGCCAAGTTCCACGCCGTATGATTGGCACTGATGCTTTTCAGGAGACT SEQ ID No 1 (601) CCAATTGTTGAGGTGACAAGGTCTATTACTAAGCATAATTATTTAGTTTTGGATGTAGAG SEQ ID No 3 (601) CCAATTGTTGAGGTGACAAGGTCTATTACTAAGCATAATTATTTAGTTTTGGATGTAGAG SEQ ID No 1 (661) GATATTCCTAGAATTGTTAAGGAAGCCTTTTTTTTAGCTAATTCTGGTAGGCCTGGACCT SEQ ID No 3 (661) GATATTCCTAGAATTGTTAAGGAAGCCTTTTTTTTAGCTAATTCTGGTAGGCCTGGACCT SEQ ID No 1 (721) GTTTTGATTGATCTTCCTAAAGATATTCAGCAGCAATTGGTTGTTCCTGATTGGGATAGG SEQ ID No 3 (721) 14 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 GTTTTGATTGATCTTCCTAAAGATATTCAGCAGCAATTGGTTGTTCCTGATTGGGATAGG SEQ ID No 1 (781) CCTTTTAAGTTGGGTGGGTATATGTCTAGGCTGCCAAAGTCCAAGTTTTCGACGAATGAG SEQ ID No 3 (781) CCTTTTAAGTTGGGTGGGTATATGTCTAGGCTGCCAAAGTCCAAGTTTTCGACGAATGAG SEQ ID No 1 (841) GTTGGACTTCTTGAGCAGATTGTGAGGTTGATGAGTGAGTCGAAGAAGCCTGTCTTGTAT SEQ ID No 3 (841) GTTGGACTTCTTGAGCAGATTGTGAGGTTGATGAGTGAGTCGAAGAAGCCTGTCTTGTAT SEQ ID No 1 (901) GTGGGAGGTGGGTGTTTGAATTCTAGTGAGGAGTTGAGGAGATTTGTTGAGTTGACAGGG SEQ ID No 3 (901) GTGGGAGGTGGGTGTTTGAATTCTAGTGAGGAGTTGAGGAGATTTGTTGAGTTGACAGGG SEQ ID No 1 (961) ATTCCGGTGGCTAGTACTTTGATGGGGTTGGGGTCTTACCCTTGTAATGATGAACTGTCT SEQ ID No 3 (961) ATTCCGGTGGCTAGTACTTTGATGGGGTTGGGGTCTTACCCTTGTAATGATGAACTGTCT SEQ ID No 1 (1021) CTTCATATGTTGGGGATGCACGGGACTGTTTATGCCAATTATGCGGTGGATAAGGCGGAT SEQ ID No 3 (1021) CTTCATATGTTGGGGATGCACGGGACTGTTTATGCCAATTATGCGGTGGATAAGGCGGAT SEQ ID No 1 (1081) TTGTTGCTTGCTTTCGGGGTTAGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAGCTCGAGGCGTTT SEQ ID No 3 (1081) TTGTTGCTTGCTTTCGGGGTTAGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAGCTCGAGGCGTTT SEQ ID No 1 (1141) GCTAGCCGTGCTAAGATTGTGCATATTGATATTGACTCTGCTGAGATTGGGAAGAACAAG SEQ ID No 3 (1141) GCTAGCCGTGCTAAGATTGTGCATATTGATATTGACTCTGCTGAGATTGGGAAGAACAAG SEQ ID No 1 (1201) CAGCCCCATGTGTCCATTTGTGCTGATGTTAAATTGGCATTGCGGGGTATGAATAAGATT SEQ ID No 3 (1201) CAGCCCCATGTGTCCATTTGTGCTGATGTTAAATTGGCATTGCGGGGTATGAATAAGATT SEQ ID No 1 (1261) CTGGAGTCTAGAATAGGGAAGCTGAATTTGGATTTCTCCAAGTGGAGAGAAGAATTAGGT SEQ ID No 3 (1261) CTGGAGTCTAGAATAGGGAAGCTGAATTTGGATTTCTCCAAGTGGAGAGAAGAATTAGGT SEQ ID No 1 (1321) GAGCAGAAGAAGGAATTCCCACTGAGTTTTAAGACATTTGGGGATGCAATTCCTCCACAA SEQ ID No 3 (1321) 15 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 GAGCAGAAGAAGGAATTCCCACTGAGTTTTAAGACATTTGGGGATGCAATTCCTCCACAA SEQ ID No 1 (1381) TATGCCATTCAGGTGCTTGATGAGTTGACCAATGGTAATGCTATTATAAGTACTGGTGTT SEQ ID No 3 (1381) TATGCCATTCAGGTGCTTGATGAGTTGACCAATGGTAATGCTATTATAAGTACTGGTGTT SEQ ID No 1 (1441) GGGCAGCACCAAATGTGGGCTGCGCAGCATTACAAGTACAGAAACCCTCGCCAATGGCTG SEQ ID No 3 (1441) GGGCAGCACCAAATGTGGGCTGCGCAGCATTACAAGTACAGAAACCCTCGCCAATGGCTG SEQ ID No 1 (1501) ACCTCTGGTGGGTTGGGGGCTATGGGGTTTGGGCTACCAGCCGCCATTGGAGCTGCAGTT SEQ ID No 3 (1501) ACCTCTGGTGGGTTGGGGGCTATGGGGTTTGGGCTACCAGCCGCCATTGGAGCTGCAGTT SEQ ID No 1 (1561) GCTCGACCAGATGCAGTGGTTGTCGATATTGATGGGGATGGCAGTTTTATTATGAATGTT SEQ ID No 3 (1561) GCTCGACCAGATGCAGTGGTTGTCGATATTGATGGGGATGGCAGTTTTATTATGAATGTT SEQ ID No 1 (1621) CAAGAGTTGGCTACAATTAGGGTGGAAAATCTCCCAGTTAAGATAATGCTGCTAAACAAT SEQ ID No 3 (1621) CAAGAGTTGGCTACAATTAGGGTGGAAAATCTCCCAGTTAAGATAATGCTGCTAAACAAT SEQ ID No 1 (1681) CAACATTTAGGTATGGTTGTCCAATGGGAAGATAGGTTCTATAAAGCTAACCGGGCACAT SEQ ID No 3 (1681) CAACATTTAGGTATGGTTGTCCAATTGGAAGATAGGTTCTATAAAGCTAACCGGGCACAT SEQ ID No 1 (1741) ACATACCTTGGAAACCCTTCCAAATCTGCTGATATCTTCCCTGATATGCTCAAATTCGCT SEQ ID No 3 (1741) ACATACCTTGGAAACCCTTCCAAATCTGCTGATATCTTCCCTGATATGCTCAAATTCGCT SEQ ID No 1 (1801) GAGGCATGTGATATTCCTTCTGCCCGTGTTAGCAACGTGGCTGATTTGAGGGCCGCCATT SEQ ID No 3 (1801) GAGGCATGTGATATTCCTTCTGCCCGTGTTAGCAACGTGGCTGATTTGAGGGCCGCCATT SEQ ID No 1 (1861) CAAACAATGTTGGATACTCCAGGGCCGTACCTGCTCGATGTGATTGTACCGCATCAAGAG SEQ ID No 3 (1861) CAAACAATGTTGGATACTCCAGGGCCGTACCTGCTCGATGTGATTGTACCGCATCAAGAG SEQ ID No 1 (1921) CATGTGTTGCCTATGATTCCAAGTGGTGCCGGTTTCAAGGATACCATTACAGAGGGTGAT SEQ ID No 3 (1921) 16 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CATGTGTTGCCTATGATTCCAAGTGGTGCCGGTTTCAAGGATACCATTACAGAGGGTGAT SEQ ID No 1 (1981) GGAAGAACCTCTTATTGA SEQ ID No 3 (1981) GGAAGAACCTCTTATTGA SEQ ID No. 2 (1) MAATFTNPTFSPSSTPLTKTLKSQSSISSTLPFSTPPKTPTPLFHRPLQISSSQSHKSSA SEQ ID No. 4 (1) MAATFTNPTFSPSSTPLTKTLKSQSSISSTLPFSTPPKTPTPLFHRPLQISSSQSHKSSA SEQ ID No. 2 (61) IKTQTQAPSSPAIEDSSFVSRFGPDEPRKGSDVLVEALEREGVTNVFAYPGGASMEIHQA SEQ ID No. 4 (61) IKTQTQAPSSPAIEDSSFVSRFGPDEPRKGSDVLVEALEREGVTNVFAYPGGASMEIHQA SEQ ID No. 2 (121) LTRSKTIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARATGKVGVCIATSGPGATNLVSGLADALLDSVPL SEQ ID No. 4 (121) LTRSKTIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARATGKVGVCIATSGPGATNLVSGLADALLDSVPL SEQ ID No. 2 (181) VAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVLDVEDIPRIVKEAFFLANSGRPGP SEQ ID No. 4 (181) VAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVLDVEDIPRIVKEAFFLANSGRPGP SEQ ID No. 2 (241) VLIDLPKDIQQQLVVPDWDRPFKLGGYMSRLPKSKFSTNEVGLLEQIVRLMSESKKPVLY SEQ ID No. 4 (241) VLIDLPKDIQQQLVVPDWDRPFKLGGYMSRLPKSKFSTNEVGLLEQIVRLMSESKKPVLY SEQ ID No. 2 (301) VGGGCLNSSEELRRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCNDELSLHMLGMHGTVYANYAVDKAD SEQ ID No. 4 (301) VGGGCLNSSEELRRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCNDELSLHMLGMHGTVYANYAVDKAD SEQ ID No. 2 (361) LLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKQPHVSICADVKLALRGMNKI SEQ ID No. 4 (361) LLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKQPHVSICADVKLALRGMNKI SEQ ID No. 2 (421) LESRIGKLNLDFSKWREELGEQKKEFPLSFKTFGDAIPPQYAIQVLDELTNGNAIISTGV SEQ ID No. 4 (421) LESRIGKLNLDFSKWREELGEQKKEFPLSFKTFGDAIPPQYAIQVLDELTNGNAIISTGV SEQ ID No. 2 (481) GQHQMWAAQHYKYRNPRQWLTSGGLGAMGFGLPAAIGAAVARPDAVVVDIDGDGSFIMNV SEQ ID No. 4 (481) 17 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 GQHQMWAAQHYKYRNPRQWLTSGGLGAMGFGLPAAIGAAVARPDAVVVDIDGDGSFIMNV SEQ ID No. 2 (541) QELATIRVENLPVKIMLLNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPSKSADIFPDMLKFA SEQ ID No. 4 (541) QELATIRVENLPVKIMLLNNQHLGMVVQLEDRFYKANRAHTYLGNPSKSADIFPDMLKFA SEQ ID No. 2 (601) EACDIPSARVSNVADLRAAIQTMLDTPGPYLLDVIVPHQEHVLPMIPSGAGFKDTITEGD SEQ ID No. 4 (601) EACDIPSARVSNVADLRAAIQTMLDTPGPYLLDVIVPHQEHVLPMIPSGAGFKDTITEGD SEQ ID No. 2 (661) GRTSYSEQ ID No. 4 (661) GRTSYВтім, в оптимальному варіанті рослини B. vulgaris згідно з даним винаходом та їх частини є придатними для агрономічного застосування. "Придатні для агрономічного застосування" означає, що рослини B. vulgaris та їх частини можуть використовуватися з агрономічними цілями. Наприклад, рослини B. vulgaris мають призначатися для використання у виробництві цукру, виробництві біологічного палива (такого, як біогаз, біобутанол), виробництві етанолу, виробництві бетаїну та/або уридину. У контексті цього опису термін "придатні для агрономічного застосування" також означає, що рослини B. vulgaris згідно з даним винаходом в оптимальному варіанті є менш чутливими до інгібуючого ALS гербіциду, у ще кращому варіанті вони є принаймні у 100 разів менш чутливими, у ще кращому варіанті – у 500 разів, у ще кращому варіанті – у 1000 разів, і у найкращому варіанті – у 2000 разів. Інгібуючий ALS гербіцид являє собою один або кілька описаних авторами гербіцидів, в оптимальному варіанті – форамсульфурон, окремо або у комбінації з одним або кількома іншими інгібуючими ALS гербіцидами, або з підкласу сульфонілсечовинних гербіцидів, або з будь-якого іншого підкласу інгібуючих ALS гербіцидів, у найкращому варіанті – форамсульфурон у комбінації з іншим сульфонілсечовинним гербіцидом та/або інгібітором ALS з підкласу сульфоніламінокарбонілтріазолінонових гербіцидів. В оптимальному варіанті придатні для агрономічного застосування рослини B. vulgaris, у найкращому варіанті – рослини цукрового буряка згідно з даним винаходом є повністю фертильними, у ще кращому варіанті – мають фертильність рослин дикого типу. Фертильність має надзвичайне значення для рослини B. vulgaris згідно з даним винаходом з точки зору придатності для агрономічного застосування. Прикладом придатної для агрономічного застосування рослини B. vulgaris є цукровий буряк. Рослина цукрового буряка згідно з даним винаходом при культивуванні на площі в один гектар (з врожайністю приблизно від 80 000 до 90 000 цукрових буряків) в оптимальному варіанті служить для виробництва принаймні 4 тонн цукру. В альтернативному варіанті рослина цукрового буряка рослина згідно з даним винаходом має містити 15-20 % цукру, у ще кращому варіанті – принаймні 17 %, щоб бути придатною для агрономічного застосування. Таким чином, рослини цукрового буряка, які мають вміст цукру 1520 %, в оптимальному варіанті – принаймні 17 %, є оптимальним варіантом втілення даного винаходу. Рослини згідно з даним винаходом можуть бути розпізнані з застосуванням будь-якого способу генотипного аналізу. Оцінка генотипну рослин включає застосування таких технологій, як електрофорез ізозимів, поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів (RFLP), випадкова ампліфікація поліморфних ДНК (RAPD), полімеразна ланцюгова реакція з довільними праймерами (AP-PCR), алель-специфічна полімеразна ланцюгова реакція (AS-PCR), фінгерпринтинг на основі ампліфікації ДНК (DAF), ампліфіковані ділянки з охарактеризованою послідовністю (SCAR), поліморфізм довжини ампліфікованих фрагментів (AFLP), прості повторювані послідовності (SSR), які також називаються "мікросателітами". До передбачених авторами додаткових композицій та способів аналізу генотипу рослин належать способи, описані у Публікації США № 2004/0171027, Публікації США № 2005/02080506 та Публікації США № 2005/0283858. Інший аспект даного винаходу стосується застосування описаної рослини буряка звичайного та/або описаних авторами придатних для збирання частин або матеріалу для розмноження для 18 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вирощування/селекції рослин буряка звичайного. Способи вирощування/селекції рослин B. Vulgaris описуються в інших розділах цього опису. Такі способи вирощування/селекції можуть застосовуватися для одержання рослин B. vulgaris згідно з даним винаходом, які також мають нові особливості, такі, як стійкість до стресів, то яких, крім інших, належать посуха, спека, холод або надмірна мінералізація і т. ін. У ще одному аспекті даний винахід передбачає застосування описаної авторами толерантної до гербіцидів рослини буряка звичайного та/або одержаних з них придатних для збирання частин або матеріалу для розмноження згідно зі способом відбору для відбору інгібуючих ALS гербіцидів. Краще розуміння даного винаходу та багатьох його переваг забезпечують представлені нижче приклади, які мають лише ілюстративне призначення і жодним чином не обмежують обсягу даного винаходу. Приклад 1: Виділення мутантів Клітинні культури цукрового буряка одержували з сіянців диплоїдного цукрового буряка генотипу 7T9044 (як описано, наприклад, у публікації Alexander Dovzhenko, PhD Thesis, "Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.) and sugarbeet (Beta vulgaris L.)”, Ludwig-Maximilians-Universität München, Німеччина, 2001). Насіння цукрового буряка занурювали на 60 секунд у 70 % етанол, потім двічі промивали у стерильній воді з 0,01 % детергента, а потім інкубували протягом 1-4 годин в 1 % вилуговувачі NaOCl. Після цього насіння тричі промивали стерильною H 2O і зберігали у стерильній H2O до наступного дня при 4 °C. Після цього зародки відокремлювали за допомогою пінцета та скальпеля. Щойно підготовлені зародки занурювали у 0,5 % NaOCl на 30 хв, а потім тричі промивали у стерильній H2O. Після останнього етапу промивання їх поміщали на безгормональне MSагарове середовище (Murashige and Skoog (1962), Physiol. Plantarum, 15, 473-497). Зародки, з яких розвинулися стерильні сіянці, використовували для закладання клітинних культур цукрового буряка, що піддаються регенерації. Сім'ядолі, а також гіпокотилі розрізали на відрізки по 2-5 мм завдовжки, а потім культивували на затвердженому агаром (0,8 %) MS-агаровому середовищі, яке містило 1 мг/л бензиламінопурину (BAP) або 0,25 мг/л тидіазурону (TDZ). Через 4 тижні культури пагонів, що розвивалися, переносили на свіже MS-агарове середовище такого самого складу, а потім субкультивували з одномісячними інтервалами. Культури тримали при 25 °C при тьмяному світлі з циклом 12 год. / 12 год. світла/темряви. Через 7-10 днів субкультивування культури пагонів, які вирощували на середовищі, яке містило тидіазурон, утворювали калюс чіткого типу, який був швидко зростаючим, м'яким і крихким. Колір цього типу калюсу був від жовтуватого до світло-зеленого. Деякі з цих крихких калюсів незмінно продукували хлорофіловмісні примордії пагонів з зародкоподібних утворень. Ці швидко зростаючі калюси, що піддавалися регенерації, застосовували для відбору толерантних до інгібуючих ALS гербіцидів мутантів цукрового буряка. -9 Коли цей тип калюсу піддавали дії 10 M інгібуючого ALS гербіциду форамсульфурону (який належить до сульфонілсечовинного підкласу, див. вище), клітини виживали, але продукували менше, ніж 50 % біомаси їхніх сиблінгів на середовищі, позбавленому інгібітора. На середовищі, -8 яке містило 3 × 10 M форамсульфурону, ріст не виявлявся. Для великомасштабних -7 експериментів з селекції мутантів вибирали, 10 M форамсульфурону. Колонії клітин, які вижили й зростали, нумерували й переносили через 4-6 тижнів на свіже середовище, яке -7 містило 3 × 10 M інгібітора. Одна з цих колоній клітин була здатна зростати не лише при цій -6 концентрації інгібітора, але й у присутності 3 × 10 M форамсульфурону. З цього клону (SB574TL) регенерували пагони у присутності інгібуючого ALS гербіциду, а потім пагони переносили до MS-середовища, яке містило 0,05 мг/л нафталіноцтової кислоти (NAA). Протягом 4-12 тижнів у пагонів формувалося коріння, а потім їх переносили у стерильні тепличні контейнери, заповнені вологим стерилізованим перлітом, і поливали з неорганічними інгредієнтами MS-середовища половинної концентрації. В альтернативному варіанті паростки переносили прямо з затвердженого агаром середовища у ґрунтову суміш з вмістом перліту у теплиці. Протягом перших 10-15 днів після перенесення у ґрунт, який містить субстрат, рослини тримали у середовищі з високою вологістю повітря. Під час та після їх переведення на режим нормальної тепличної вологості повітря рослини тримали у теплиці під штучним світлом (12 год.) при 20 +-3 °C / 15 +-2 °C денної/нічної температури. Через 3-5 тижнів регенеровані рослини з підготовлених раніше толерантної до форамсульфурону культури клітин (SB574TL), а також з культур клітин дикого типу обробляли 19 UA 113721 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 форамсульфуроном, йодосульфурон-метил-натрієм (CAS RN 144550-3-7) та сумішшю обох активних інгредієнтів. Випробувані дози гербіциду були еквівалентні 7-70 г a.i./га для форамсульфурону і 1-10 г a.i./га для йодосульфурон-метил-натрію. Регенеровані рослини з цієї толерантної лінії клітин витримували навіть найвищі дози гербіцидів (форамсульфурону, йодосульфурон-метил-натрію та їхніх сумішей у співвідношенні 7:1, тоді, як рослини дикого типу гинули навіть від найнижчих доз. Приклад 2: Випробування потомства На основі SB574TL насіння F2 та F3 експериментальних гібридів, які забезпечують алель резистентності у гетерозиготному стані, а також насіння F4 – F6 що забезпечує мутантний алель у гомозиготному стані висівали у полі й обробляли форамсульфуроном, йодосульфуронметил-натрієм, а також сумішами обох інгібуючих ALS гербіцидів, коли у рослин розвивалися 35 листів розетки. Гомозиготні сіянці витримували суміші 35 г форамсульфурону/га + 7 г йодосульфурон-метил-натрію/га без затримки росту або будь-яких ознак видимої шкоди. Гетерозиготні лінії при такій кількості демонстрували ознаки уповільненого росту та певний хлороз листя, але вони відновлювалися за 3-5 тижнів, тоді, як звичайні сіянці цукрового буряка гинули від інгібуючих ALS гербіцидів. Приклад 3: Молекулярна характеризація одержаного мутанта цукрового буряка (SB574TL) Видобування та аналіз нуклеїновокислотної послідовності одержаного мутанта здійснювали за допомогою LGC Genomics GmbH, Берлін, Німеччина, згідно зі зміненими стандартними протоколами. Нуклеїновокислотну послідовність, одержану з мутанта цукрового буряка SB574TL, показано в SEQ ID NO: 3, причому SEQ ID NO: 4 представляє відповідну амінокислотну послідовність, тоді, як SEQ ID NO: 1 одержували після секвенування послідовності рослини цукрового буряка дикого типу, яку брали як вихідний матеріал. SEQ ID NO: 2 представляє відповідну амінокислотну послідовність цукрового буряка дикого типу. Порівняння всіх цих послідовностей чітко виявляє лише одну мутацію у позиції 569, але більше не відбувалося ніяких змін у жодній іншій частині цього ендогенного ALS гена цього рослинного матеріалу цукрового буряка. Приклад 4: Вимірювання ферментної активності Кодуючі послідовності ALS гена буряка звичайного дикого типу та W574L-мутанта (SB574TL) клонували у вектори Novagen pET-32a(+) і вектори трансформували в AD494 Escherichia coli згідно з інструкціями виробника. Бактерії вирощували при 37 °C в LB-середовищі (Luria-Broth), яке містило 100 мг/л карбеніциліну та 25 мг/л канаміцину, стимулювали, використовуючи 1 мM ізопропіл-b-D-тіогалактопіранозиду при OD600 0,6, культивували протягом 16 годин при 18 °C і збирали шляхом центрифугування. Згустки бактерій ресуспендували у 100 мM буфера з фосфату натрію, pH 7,0, який містив 0,1 мM тіамінпірофосфату, 1 мM MgCl 2 та 1 мкM FAD, у концентрації 1 г сирої маси на 25 мл буфера і руйнували шляхом ультразвукової обробки. Неочищений білковий екстракт одержаний після центрифугування, використовували для вимірювання активності ALS. Аналізи ALS здійснювали у 96-лункових мікротитрувальних планшетах, застосовуючи модифікацію процедури, описаної у публікації Ray (1984). Реакційна суміш містила 20 мM буфера з фосфату калію pH 7,0, 20 мM пірувату натрію, 0,45 мM тіамінпірофосфату, 0,45 мM MgCl2, 9 мкM FAD, фермент ALS та інгібітори ALS у різних концентраціях у кінцевому об'ємі приблизно 90 мкл. Аналізи розпочинали шляхом додавання ферменту і завершували після 75 хв інкубації при 30 °C шляхом додавання 40 мкл 0,5 M H2SO4. Через 60 хв при кімнатній температурі додавали 80 мкл розчину 1,4 % α-нафтолу та 0,14 % креатину у 0,7 M NaOH і після додаткових 45 хв інкубації при кімнатній температурі визначали оптичну густину при 540 нм. Показники pI50 для інгібування ALS визначали, як описано у публікації Ray (1984), застосовуючи програму апроксимації кривих по точках XLFit Excel, додаткова версія 4.3.1, від ID Business Solutions Limited. В цілому мутантний фермент був принаймні у 2000 разів менш чутливим до інгібітора ALS форамсульфурону порівняно з ферментом дикого типу. Приклад 5: Вимірювання активності ферменту (з рослин) ALS видобували з листя цукрового буряка або культур тканин цукрового буряка, як описано у публікації Ray (1984), Plant Physiol 75:827-831. Активність ALS визначали в екстрактах листя цукрового буряка дикого типу та екстрактах листя одержаного SB574TL у присутності різних концентрацій форамсульфурону, як описано у Прикладі 4. В цілому мутантний фермент був принаймні у 2000 разів менш чутливим до інгібітора ALS форамсульфурону порівняно з ферментом дикого типу. 20 UA 113721 C2 5 10 15 Приклад 6: Польові випробування з застосуванням гомозиготних толерантних до інгібуючих ALS гербіцидів рослин цукрового буряка На основі SB574TL, насіння F4 – F6 що забезпечує мутантний алель ендогенного ALS гена у гомозиготному стані, застосовували для подальшого випробування. Насіння гомозиготних мутантних рослин SB574TL та насіння традиційного сорту KLARINA (загальнодоступні чутливі до інгібітора ALS контрольні сорти цукрового буряка не мали відповідної мутації у позиції 569 у цьому білку ALS) висівали у полі й вирощували до різних стадій росту згідно зі стандартом BBCH (визначеним у монографії „Entwicklungsstadien monound dikotyler Pflanzen", 2nd edition, 2001, ed. Uwe Meier, Biologische Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft). Після цього рослини обробляли відповідними інгібуючими ALS гербіцидами, які вказано нижче у Таблиці 1 і які є ідентичними тим, що застосовуються під час процедури відбору. Кількість води, застосовуваної у різних випадках, дорівнювала 200 л/га. Через 8, 14 та 28 днів (як вказано у Таблиці 1) після внесення (DAA) відповідного(их) інгібуючого(их) ALS гербіциду(ів) шкоду (фітотоксичність/фіто) для різних рослин цукрового буряка визначали за шкалою від 0 % до 100 %. У цьому контексті "0 %” означає "відсутність фітотоксичності/фіто", а "100 %” означає, що рослини повністю загинули. Таблиця 1 Характеристики сорту Етап внесення Показник Інтервал Внесення – Оцінка Активна речовина г a.i./га Форамсульфурон 25 г/га Форамсульфурон 50 г/га Йодосульфурон7 г/га метил-натрій Цукровий буряк KLARINA основі SB574TL BBCH 14 BBCH 14 % фіто % фіто 8 днів 8 днів на Цукровий Цукровий буряк на буряк на KLARINA KLARINA основі основі SB574TL SB574TL BBCH 14 BBCH 14 BBCH 14 BBCH 14 % фіто % фіто % фіто % фіто 14 днів 14 днів 28 днів 28 днів 85 90 0 0 83 92 0 0 86 94 0 0 90 0 9 0 100 0 20 21 UA 113721 C2 22 UA 113721 C2 23 UA 113721 C2 24 UA 113721 C2 25 UA 113721 C2 26 UA 113721 C2 27 UA 113721 C2 28