Спосіб зменшення концентрації вільних fc-частин в рідині, що містить fc-вмісний білок

Реферат: Даний винахід належить до способу зменшення концентрації вільних Fc-частинок в рідині, що містить Fc-вмісний білок, який включає піддавання вказаної рідини катіонообмінній хроматографії та застосування катіонообмінної хроматографії для зменшення концентрації вільних Fc-частинок в композиції, що містить Fc-вмісний білок. UA 99262 C2 (12) UA 99262 C2 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід належить до галузі очищення білків. Більш конкретно, він стосується очищення Fc-вмісних білків за допомогою катіонообмінної хроматографії, зокрема, для зменшення кількості вільних Fc-частин в препараті Fc-вмісного білка. Білки стали комерційно важливими як лікарські засоби, які зазвичай називають «біологічними засобами». Одним з найважливіших завдань є розвиток економічних і ефективних способів для очищення білків в комерційному масштабі. Хоча багато способів доступні тепер для великомасштабного одержання білків, неочищені продукти, такі як супернатанти культур клітин, містять не тільки бажаний продукт, але також домішки (забруднення), які важко відділити від бажаного продукту. Хоча супернатанти культур клітин, що експресують рекомбінантні білкові продукти, можуть містити менше забруднень, якщо ці клітини вирощуються в безсироватковому середовищі, білки клітини-хазяїна (НСР) все ще вимагають елімінації під час процесу очищення. Крім того, органи охорони здоров'я вимагають високих стандартів чистоти для білків, призначених для введення людині. Відомий ряд хроматографічних систем, які широко застосовні для очищення білків. Системи іонообмінній хроматографії використовуються для розділення білків передусім на основі відмінностей в заряді. Аніонообмінники можуть класифікуватися як слабкі або сильні. Зарядженою групою на слабкому аніонообміннику є слабка основа, яка стає депротонованою і, отже, втрачає свій заряд при високому рН. ДЕАЕ-сефароза є прикладом слабого аніонообмінника, де аміногрупа може бути позитивно зарядженою нижче рН ~ 9 і поступово втрачає свій заряд при більш високих величинах рН. Діетиламіноетил (ДЕАЕ) або діетил(2-гідроксипропіл)аміноетил (QAE) мають, наприклад, хлорид як протиіон. З іншого боку, сильний аніонообмінник містить сильну основу, яка залишається позитивно зарядженою протягом діапазону рН, що зазвичай використовується для іонообмінній хроматографії (рН 1-14). Q-сефароза (Q означає четвертинний амоній) є прикладом сильного аніонообмінника. Катіонообмінники можуть бути також класифіковані як слабкі або сильні. Сильний катіонообмінник містить сильну кислоту (наприклад, сульфопропільну групу), яка залишається зарядженою від рН 1 до 14; тоді як слабкий катіонообмінник містить слабку кислоту (наприклад, карбоксиметильну групу), яка поступово втрачає свій заряд, коли рН зменшується нижче 4 або 5. Карбоксиметил (СМ) і сульфопропіл (SP) мають, наприклад, натрій як протиіон. Інша хроматографічна смола основана на нерозчинному гідроксильованому кальційфосфатному матриксі, званому гідроксіапатитом. Гідроксіапатитна хроматографія є способом очищення білків, який використовує нерозчинний гідроксильований фосфат кальцію (Ca5(PO4)3OH)2, який утворює як матрикс, так і ліганд. Функціональні групи складаються з пар позитивно заряджених іонів кальцію (С-сайтів) і кластерів негативно заряджених груп (Р-сайтів). Взаємодії між гідроксіапатитом і білками є комплексними і різноманітними. В одному способі взаємодії, позитивно заряджені аміногрупи на білках зв'язуються з негативно зарядженими Рсайтами, а карбоксильні групи білка взаємодіють за допомогою координаційного комплексоутворення з С-сайтами (Shepard et al., 2000). Кристалічний гідроксіапатит був першим типом гідроксіапатиту, використаним в хроматографії. Хроматографія на керамічному гідроксіапатиті (СНА) є подальшим розвитком гідроксіапатитної хроматографії. Керамічний гідроксіапатит має високий термін служби (високу міцність), хорошу здатність зв’язування білка і може бути використаний при більш високих швидкостях потоку і тиску, ніж кристалічний гідроксіапатит (Vola et al., 1993). Гідроксіапатит використовували в хроматографічному розділенні білків, нуклеїнових кислот, а також антитіл. У гідроксіапатитній хроматографії колонку врівноважують звичайним чином і наносять пробу в фосфатному буфері низької концентрації і потім адсорбовані білки елююють в градієнті концентрацій фосфатного буфера (Giovannini et al., 2000). Ще один спосіб очищення білків оснований на афінності представляючого інтерес білка відносно іншого білка, який імобілізований на хроматографічній смолі. Прикладами таких імобілізованих лігандів є білки бактеріальних клітинних стінок Білок А і Білок G, що мають специфічність відносно Fc-частини деяких імуноглобулінів. Хоча як Білок А, так і Білок G мають сильну афінність відносно IgG-антитіл, вони мають також афінності, що варіюються відносно інших класів і ізотипів імуноглобулінів. Білок А є білком в 43000 Дальтон, який продукується бактеріями Staphylococcus aureus і містить чотири сайти зв’язування з Fc-районами IgG. Білок G продукується стрептококами групи G і має два сайти зв’язування для Fc-району IgG. Обидва білки були широко охарактеризовані відносно їх афінності з різними типами імуноглобулінів. Іншим розвитком є Білок А/G, генетично сконструйований білок, який об'єднує зв'язуючі здатності Білка А і G. Білок L є наступним 1 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бактеріальним білком, що походить з Peptostreptococcus, який зв'язується з імуноглобулінами і їх фрагментами, що містять легкі ланцюги Ig (Akerstrom and Bjork, 1989). Білок А-, Білок G- і Білок-L-афінна хроматографія широко використовується для виділення і очищення антитіл. Оскільки сайти зв’язування для Білка А і білка G знаходяться в Fc-районі імуноглобуліну, Білок А- і Білок G- (або Білок А/G)-афінна хроматографія дозволяє також очищення так званих Fc-злитих білків. Білок L зв'язується з легкими ланцюгами Ig і, отже, може бути використаний для очищення антитіл, що містять легкий ланцюг. Антитіла, або імуноглобуліни (Ig) складаються з легких ланцюгів і важких ланцюгів, зв'язаних разом дисульфідними зв'язками. Перший домен, розташований на аміно-кінці кожного ланцюга є варіабельним в амінокислотній послідовності, забезпечуючи широкий спектр зв'язуючої специфічності антитіла. Ці домени відомі як варіабельні важкі (VH) і варіабельні легкі (VL) області. Інші домени кожного ланцюга є відносно інваріантними в амінокислотній послідовності і відомі як константні важкі (СН) і константні легкі (CL) області. Основними класами антитіл є IgА, IgD, IgЕ, IgG і IgМ; і ці класи можуть бути додатково поділені на підкласи (ізотипи). Наприклад, клас IgG має чотири підкласи, а саме, IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4. Відмінності між класами антитіл походять з відмінностей в константних областях важкого ланцюга, що містять 1-4 константних домени (СН1-СН4), залежно від класу імуноглобуліну. Між СН1- і СН2-доменами розташована так звана шарнірна область. Ця шарнірна область особливо чутлива до протеолітичного розщеплення; такий протеоліз дає два або три фрагменти залежно від точного сайту розщеплення. Частину константної області важкого ланцюга, що містить СН2і СН3-домени, називають також «Fc»-частиною імуноглобуліну. Таким чином, антитіла є Fcвмісними білками. Іншим типом Fc-вмісних білків є так звані Fc-злиті білки. Відомі декілька антитіл, які використовуються як терапевтичні білки. Прикладами рекомбінантних антитіл на ринку є, наприклад: Абциксимаб, Ритуксимаб, Базиліксимаб, Дакліцумаб, Палівіцумаб, Інфліксимаб, Трастуцумаб, Алемтуцумаб, Адалімумаб, Цетуксимаб, Ефаліцумаб, Ібритумомаб, Бевацицумаб або Омаліцумаб. Fc-злиті білки є химерними білками, що складаються з ефекторного району білка, такого як Fab-район антитіла або зв'язуючий район рецептора, злитого з Fc-районом імуноглобуліну, який часто є імуноглобуліном G (IgG). Fc-злиті білки використовуються широко як терапевтичні засоби, оскільки вони надають переваги, що надаються Fc-районом, такі як: - Можливість очищення з використанням Білок А- або Білок G-афінної хроматографії з афінностями, що варіюються згідно з ізотипом IgG. IgG1, IgG2 і IgG4 людини зв'язуються сильно з Білком А, і все IgG людини, в тому числі IgG3, зв'язуються сильно з Білком G; - Збільшений час напівжиття в системі кровообігу, оскільки Fc-район зв'язується з рецептором порятунку FcRn, який захищає від лізосомної деградації; - Залежно від медичного застосування Fc-злитого білка, можуть бути бажаними ефекторні функції Fc. Такі ефекторні функції включають в себе антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC) через взаємодії з Fc-рецепторами (FcR) і комплементзалежну цитотоксичність (CDC) за допомогою зв’язування з компонентом комплементу 1q (С1q). Ізоформи IgG виявляють різні рівні ефекторних функцій. IgG1 і IgG3 людини мають сильні ефекти ADCC і CDC, в той час як IgG2 людини виявляє слабкі ефекти ADCC і CDC. IgG4 людини виявляє слабкі ефекти ADCC і не виявляє ефекти CDC. Час напівжиття в сироватці і ефекторні функції можуть бути модульовані конструюванням Fc-району для збільшення або зменшення його зв’язування з FcRn, FcR і C1q, відповідно, залежно від терапевтичного застосування, передбачуваного для Fc-злитого білка. У ADCC, Fc-район антитіла зв'язується з Fc-рецепторами (FcR) на поверхні імунних ефекторних клітин, таких як природні клітини-кілери і макрофаги, призводячи до фагоцитозу або лізису цих клітин-мішеней. У CDC, ці антитіла вбивають клітини-мішені запуском каскаду комплементу на поверхні клітин. Ізоформи IgG виявляють різні рівні ефекторних функцій, що збільшуються в послідовності IgG4 < IgG2 < IgG1 < IgG3. IgG1 людини виявляє високі ADCC і CDC і є найбільш застосовним для терапевтичного застосування проти патогенів і ракових клітин. При деяких обставинах, наприклад, коли виснаження клітини-мішені є небажаним, може бути потрібне анулювання або зменшення ефекторних функцій. Навпаки, у випадку антитіл, призначених для застосування в онкології, збільшення ефекторних функцій може поліпшувати їх терапевтичну активність (Carter et al., 2006). Модифікація ефекторних функцій може досягатися конструюванням Fc-району або для поліпшення, або для зменшення зв’язування антитіл з FcR або факторами комплементу. 2 UA 99262 C2 5 10 15 Зв’язування IgG з активуючими (FcRI, FcRIIa, FcRIIIa і FcRIIIb) і інгібувальними (FcRIIb) FcR або першим компонентом комплементу (C1q) залежить від залишків, локалізованих в шарнірній ділянці і СН2-домені. Два райони СН2-домену вирішальними для FcR і зв’язування С1q комплементу і мають унікальні послідовності в IgG2 і IgG4. Наприклад, заміна залишків IgG2 в положеннях 233-236 в IgG1 сильно зменшувала ADCC і CDC (Armour et al., 1999 і Shields et al., 2001). Численні мутації були зроблені в СН2-домені IgG і їх дію на ADCC і CDC випробовували in vitro (Shields et al., 2001, Idusogie et al., 2001 і 2000, Steurer et al., 1995). Зокрема, повідомлялося, що мутація аланіну в Е333 збільшувала як ADCC, так і CDC (Idusogie et al., 2001 і 2000). Збільшення часу напівжиття терапевтичного антитіла є іншим шляхом для поліпшення його ефективності, що робить можливими більш високі рівні в кровотоці, менш часте введення і зменшені дози. Це може бути досягнуте посиленням зв’язування Fc-району з FcR новонародженого (FcRn). FcRn, який експресується на поверхні ендотеліальних клітин, зв'язує IgG рН-залежним чином і захищає його від деградації. Було показано, що декілька мутацій, розташованих на кордоні між доменами СН2 і СН3, збільшують час напівжиття IgG1 (Hinton et al., 2004 і Vaccaro et al., 2005). Наступна таблиця 1 підсумовує деякі відомі мутації Fc-району IgG (взяті з веб-сайту Invivogen). 20 Таблиця 1 Сконструйований Ізотип IgG Мутації Fc hIgG1e1 IgG1 T250Q/M428L людини Властивості Потенційні переваги Застосування Збільшений час напівжиття в плазмі Збільшений час напівжиття в плазмі hIgG1e2 IgG1 людини hIgG1e4 IgG1 людини E233P/L234V/ Зменшені L235A/ΔG236 + ADCC і CDC A327G/A330S/ P331S E333A Збільшені ADCC і CDC hIgG2e1 30 M252Y/S254T/ T256E + H433K/N434F hIgG1e3 25 IgG1 людини IgG2 людини K322A Зменшена CDC Поліпшена локалізація відносно мішені; збільшена ефективність; зменшена доза або частота введення Поліпшена локалізація відносно мішені; збільшена ефективність; зменшена доза або частота введення Зменшені побічні дії Вакцинація; терапевтичне застосування Вакцинація; терапевтичне застосування Терапевтичне застосування без делеції клітин Збільшена Терапевтичне ефективність застосування без делеції клітин Зменшені побічні дії Вакцинація; терапевтичне застосування У класі Fc-злитих білках, що мають терапевтичну застосовність, Fc-райони були злиті з позаклітинними доменами деяких рецепторів, що належать до суперсімейства рецепторів фактора некрозу пухлин (TNF-R) (Locksley et al., 2001, Bodmer et al., 2002, Bossen et al., 2006). Відмітною ознакою членів суперсімейства TNFR є присутність цистеїн-багатих псевдоповторів у позаклітинному домені, описаних, наприклад, Naismith and Sprang, 1998. Два рецептора TNF, p55 (TNFR1) і p75 TNFR (TNFR2) є прикладами таких членів суперсімейства TNFR. Етанерцепт є Fc-злитим білком, що містить розчинну частину TNFR р75 (наприклад, WO91/03553, WO 94/06476). Під товарною назвою Enbrel®, він продається для лікування ендометріозу, інфекції вірусу гепатиту С, інфекції ВІЛ, псоріатичного артриту, псоріазу, ревматоїдного артриту, астми, анкілозувального спондиліту, серцевої недостатності, 3 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 реакції трансплантат проти хазяїна, пневмофіброзу, хвороби Кроні. Ленерцепт є злитим білком, що містить позаклітинні компоненти TNF-рецептора р55 людини і Fc-частину IgG людини, і призначений для потенційного лікування важкого сепсису і розсіяного склерозу. OX40 є також членом суперсімейства TNFR. Були одержані злиті білки OX40-IgG1 і OX40hIG4mut для лікування запальних і аутоімунних захворювань, такі як хвороба Кроні. Fc-злитий білок BAFF-R, також званий BR3, названий BR3-Fc, є розчинним рецепторомпасткою з серії інгібіторів BAFF (В-клітинного активуючого фактора сімейства TNF), розвивається для потенційного лікування аутоімунних захворювань, таких як ревматоїдний артрит (RA) і системний червоний вовчак (SLE). BCMA є наступним рецептором, що належить до суперсімейства TNFR. Було описано, що злитий білок BCMA-Ig інгібує аутоімунне захворювання (Melchers, 2006). Іншим рецептором суперсімейства TNF-R є TACI, трансмембранний активатор і взаємодіючий з CAML агент (von Вülow and Bram, 1997; US 5969102, Gross et al., 2000), який має позаклітинний домен, що містить два цистеїн-багатих псевдоповтори. TACI зв'язує два члени сімейства лігандів фактора некрозу пухлин (TNF). Один ліганд був названий BLyS, BAFF, нейтрокін-α, TALL-1, zTNF4 або THANK (Moore et al., 1999). Інший ліганд був названий APRIL, ліганд 1 смерті TNRF або ZTNF2 (Hahne et al., J. Exp.Med. 188: 1185 (1998). Відомі також злиті білки, що містять розчинні форми рецептора TACI, злиті з Fc-районом IgG, які були названі TACI-Fc (WO 00/40716, WO 02/094852). TACI-Fc інгібує зв’язування BLyS і APRIL з В-клітинами (Xia et al., 2000). Він розробляється для лікування аутоімунних захворювань, в тому числі системного червоного вовчака (SLE), ревматоїдного артриту (RA) і гематологічних злоякісностей, а також для лікування розсіяного склерозу (MS). Крім цього, TACI-Fc розробляється для лікування множинної мієломи (MM) (Novak et al., 2004; Moreau et al., 2004) і неходжкінської лімфоми (NHL), хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL) і макроглобулінемії Вальденстрема (WM). Внаслідок терапевтичної застосовності Fc-вмісних білків, зокрема, антитіл і Fc-злитих білків, існує потреба в значних кількостях високо очищеного білка, який є достатнім для введення людині. Однією з проблем, які можуть зустрічатися під час одержання Fc-вмісних білків, є присутність «вільних Fc-частинок», тобто поліпептидних фрагментів, що походять з Fc-вмісного білка, який не містить істотної частини, що походить з варіабельної області антитіла або з іншого специфічного білка або домену, зазвичай присутнього в Fc-злитому білку. Даний винахід націлений на цю проблему. Він оснований на розвитку способу очищення для рідини, композиції або препарату Fc-вмісного білка, за допомогою якого може бути зменшена кількість вільних Fc-частинок, які можуть бути присутніми як домішка. Таким чином, цей винахід стосується способу зменшення концентрації вільних Fc-частинок в рідині, що містить Fc-вмісний білок, причому цей спосіб передбачає піддавання вказаної рідини катіонообмінній хроматографії. У другому аспекті, цей винахід стосується застосування катіонообмінної хроматографії для зменшення вільного Fc в препараті Fc-вмісного білка. У третьому аспекті, цей винахід стосується очищеного Fc-вмісного білка, що містить менше 5% або менше 2% або менше 1% або менше 0,5% або менше 0,2% або менше 0,1% вільних Fcчастинок. Короткий опис фігур Фіг. 1 показує невідновний забарвлений сріблом електрофорез в ДСН-ПААГ різних фракцій, що походять з катіонообмінній хроматографії, описаної в прикладі 2. Доріжка 1: маркери молекулярної маси, Доріжка 2: очищений ТАСI-Fc, Доріжка 3: нанесений препарат, Доріжка 4: промивання 2, Доріжка 5: елюат 2, Доріжка 6: промивання 3, Доріжка 7: елюат 3, Доріжка 8: промивання 1, Доріжка 9: елюат 1, Доріжка 10: очищений вільний Fc. Фіг. 2 показує хроматографічний профіль катіонообмінної хроматографії, описаної в прикладі 2. Короткий опис списку послідовностей SEQ ID NO: 1 є цистеїновою послідовністю-фінгерпринтом (багатим цистеїном псевдоповтором), загальним для членів суперсімейства TNFR; SEQ ID NO: 2 є повнорозмірною послідовністю рецептора TACI людини (наприклад, описаною в WO 98/39361); SEQ ID NO: 3 є прикладом Fc-послідовності людини цього винаходу (наприклад, описаної в WO 02/094852); 4 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 SEQ ID NO: 4 є переважним Fc-злитим білком цього винаходу, що містить послідовності, зроблені з позаклітинної частини TACI і Fc-частини людини (наприклад, описаним в WO 02/094852); SEQ ID NO: 5 є полінуклеотидом, що кодує поліпептид SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 6 є полінуклеотидом, що кодує поліпептид SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 7 є полінуклеотидом, що кодує поліпептид SEQ ID NO: 4. Докладний опис винаходу Даний винахід оснований на відкритті, що катіонообмінна хроматографія може зменшувати кількість або ступінь вільних Fc-частинок, які можуть бути присутнім в рідині або композиції Fcвмісного білка. Таким чином, цей винахід стосується способу зменшення концентрації вільних Fc-частинок в рідині, що містить Fc-вмісний білок, причому цей спосіб передбачає піддавання вказаної рідини катіонообмінній хроматографії. Рідиною, що містить Fc-вмісний білок, може бути будь-яка композиція або будь-який препарат, така як, наприклад, біологічна рідина, одержана з людини або тварини, або рідина, одержана з культури клітин, така як, наприклад, супернатант культури клітин. Цією рідиною може бути також рідина, одержана з іншої стадії очищення, така як, наприклад, елюат або рідина, що проходить зі стадії захоплення або будь-якої іншої відповідної стадії очищення, як описано більш детально нижче. Термін «Fc-вмісний білок», в даному контексті, стосується будь-якого білка, що має щонайменше один константний домен імуноглобуліну, вибраний з СН1-, шарнірного, СН2-, СН3-, СН4-домену або їх комбінації, і, переважно, шарнірного домену, СН2- і СН3-домену. Цей константний домен імуноглобуліну може бути зроблений з будь-якого з IgG, IgА, IgЕ, IgМ або їх комбінації або їх ізотипу. Переважно, він зроблений з IgG, наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Більш переважно, він є IgG1. Fc-вмісний білок цього винаходу може бути мономером або димером. Fc-вмісний білок може бути також "псевдодимером" (іноді званим «мономером»), що містить димерну Fcчастину (наприклад, димер з двох зв'язаних дисульфідним містком конструкцій шарнір-CH2CH3), з яких тільки одна злита з додатковою частиною молекули, такою як варіабельний домен імуноглобуліну, лігандзв’язувальний і необов'язково інгібуючий фрагмент рецептора, або будьякий інший білок. Прикладом такого псевдодимеру є Fc-злитий білок, що має інтерферон-, злитий з однією з двох конструкцій шарнірна часть-СН2-СН3 IgG, наприклад, такий, як описаний в WO 2005/001025. Fc-вмісний білок може бути гетеродимером, що містить дві різні частини, що не є імуноглобуліном, або варіабельні домени імуноглобуліну, або гомодимером, що містить дві копії єдиної частини не імуноглобуліну або варіабельного домену імуноглобуліну. Відповідно до даного винаходу, Fc-частина Fc-вмісного білка може бути також модифікована для модуляції ефекторних функцій. Наприклад, можуть бути введені наступні мутації Fc, згідно з положеннями EU-індексів (Kabat et al., 1991), якщо ця Fc-частина молекули зроблена з IgG1: T250Q/M428L M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F E233P/L234V/L235A/ΔG236 + A327G/A330S/P331S E333A; K322A. Додатковими Fc-мутаціями можуть бути, наприклад, заміни в положеннях EU-індексів, вибраних з 330, 331, 234 або 235, або їх комбінації. Амінокислотна заміна в EU-індексположенні 297, розташованому в домені СН2, також може бути введена в Fc-частину в контексті даного винаходу, з елімінацією потенційного сайту приєднання N-зв'язаного вуглеводу. Крім того, залишок цистеїну в EU-індекс-положенні 220 може бути також замінений залишком серину, що виключає залишок цистеїну, який зазвичай утворює дисульфідні зв’язки з константною областю легкого ланцюга імуноглобуліну. Згідно з даним винаходом, переважно, Fc-частина містить SEQ ID NO: 3 або складається з SEQ ID NO: 3 або кодується полінуклеотидом, що містить SEQ ID NO: 6. У переважному варіанті здійснення, Fc-вмісний білок містить варіабельну область імуноглобуліну, наприклад, один або декілька варіабельних доменів важкого ланцюга і/або один або декілька варіабельних доменів легкого ланцюга. Переважно, це антитіло містить один або два варіабельних доменів важкого ланцюга. Більш переважно, це антитіло додатково містить один або два варіабельних домени легкого ланцюга. Переважно, цей Fc-вмісний білок є антитілом. 5 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін «антитіло» стосується імуноглобуліну або його фрагмента і включає в себе будьякий поліпептид, що містить антигензв’язувальний сайт. Цей термін включає в себе, але не обмежуються ними, поліклональні, моноклональні, моноспецифічні, поліспецифічні, неспецифічні, гуманізовані антитіла, антитіла людини, химерні, одноланцюжкові, синтетичні, рекомбінантні, гібридні, мутовані, трансплантовані або генеровані in vitro антитіла. Це антитіло може бути вибране з будь-якого з відомих ізотипів антитіл, наприклад, IgА, Ig, IgD, IgЕ, IgМ. Це антитіло може бути мономером, димером або мультимером, таким як триммер або пентамер. Прикладами антитіл, які можуть бути очищені відповідно до даного винаходу, є Абциксимаб, Ритуксимаб, Базиліксимаб, Дакліцумаб, Палівіцумаб, Інфліксимаб, Трастуцумаб, Алемтуцумаб, Адалімумаб, Цетуксимаб, Ефаліцумаб, Ібритумомаб, Бевацицумаб або Омаліцумаб. Додатковими прикладами антитіл, які можуть бути піддані катіонообмінній хроматографії відповідно до даного винаходу, є антитіла проти CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80, CD86, CD147, CD164, IL-2-рецептора, IL-4-рецептора, IL-6-рецептора, IL-12-рецептора, субодиниць IL-18-рецептор (IL-18R-альфа, IL-18R-бета), TACI, BCMA, BAFF-R, EGF-рецептора, VEGF-рецептора, інтегрину 47, інтегрину VLA4, інтегринів B2, TRAIL-рецепторів 1, 2, 3 і 4, RANK, ліганду RANK, адгезійної молекули епітеліальних клітин (EpCAM), молекули 3 міжклітинної адгезії (ICAM-3), CTLA4, Fc-гамма-I, II або III-рецептора, HLA-DR 10 бета, антигену HLA-DR, L-селектину. Антитіла, направлені проти TNF, Blys або інтерферону- є додатковими прикладами антитіл, що представляють терапевтичний інтерес. Fc-злиті білки є також Fc-вмісними білками, які, переважно, піддають способу цього винаходу. Термін "Fc-злитий білок", в даному контексті, означає білки, зокрема, терапевтичні білки, що містять зроблену з імуноглобуліну частину молекули, яка буде називатися тут "Fcчастиною", і частину молекули, зроблену з другого, білка, що не є імуноглобуліном, яка буде називатися тут “терапевтичною частиною молекули", незалежно від того, передбачається або не передбачається лікування захворювання. Терапевтичні Fc-злиті білки, тобто Fc-злиті білки, призначені для лікування або попередження захворювання тварини або, переважно, для лікування людини або введення людині, особливо придатні для очищення відповідно до цього винаходу. Будь-який Fc-злитий білок може бути очищений відповідно до даного винаходу, наприклад, інтерферон--вмісний злитий білок. Переважно, спосіб цього винаходу є способом очищення Fc-злитого білка, що містить лігандзв’язувальний фрагмент, такий як весь позаклітинний домен або частина позаклітинного домену члена суперсімейства рецепторів фактора некрозу пухлин (TNFR). Терапевтичною частиною Fc-злитого білка може бути наприклад, ЕРО, ТРО, гормон росту, інтерферон-альфа, інтерферон-бета, інтерферон-гамма, PDGF-бета, VEGF, IL-1-альфа, IL-1бета, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, IL-18-зв'язуючий білок, TGF-бета, TGF-альфа або TNF-бета або їх похідні. Терапевтична частина молекули цього винаходу може бути також зроблена з рецептора, наприклад, трансмембранного рецептора, може бути, переважно, зроблена з позаклітинного домену рецептора і, зокрема, лігандзв’язувального і необов'язково інгібувального фрагмента позаклітинної частини або домену конкретного рецептора. Прикладами представляючих інтерес рецепторів є CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80, CD86, CD147, CD164, IL-2-рецептор, IL-4-рецептор, IL-6рецептор, IL-12-рецептор, субодиниці IL-18-рецептора (IL-18R-альфа, IL-18R-бета), EGFрецептор, VEGF-рецептор, інтегрин альфа 4/бета 7, інтегрин VLA4, інтегрини B2, TRAILрецептори 1, 2, 3 і 4, RANK, ліганд RANK, адгезійна молекула епітеліальних клітин (EpCAM), молекула 3 міжклітинної адгезії (ICAM-3), CTLA4 (який є цитотоксичним Т-лімфоцитасоційованим антигеном), Fc-гамма-1-рецептор, HLA-DR 10 бета, антигенний HLA-DR, Lселектин. Високо переважним є те, що терапевтична частина молекули цього винаходу зроблена з рецептора, що належить до суперсімейства TNFR. Ця терапевтична частина молекули може бути, наприклад, позаклітинним доменом TNFR1 (p55), TNFR2 (p75), OX40, остеопротегерином, CD27, CD30, CD40, RANK, DR3, Fas-лігандом, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TAIL-R4, NGFR, AITR, BAFFR, BCMA, TACI або може бути зроблена з них. Згідно з даним винаходом, ця терапевтична частина молекули, зроблена з члена суперсімейства TNFR, переважно, містить весь позаклітинний домен цього члена TNFR або частину позаклітинного домену цього члена TNFR і, більш переважно, містить лігандзв’язувальний фрагмент такого члена TNFR. 6 UA 99262 C2 5 10 15 Наступна таблиця 5 містить список членів суперсімейства TNFR, з яких може бути зроблена терапевтична частина молекули відповідно до даного винаходу, і їх відповідні ліганди. “Лігандзв’язувальний фрагмент" члена цього сімейства TNFR може бути легко визначений кваліфікованим в даній галузі фахівцем, наприклад, в простому аналізі in vitro, вимірюванням зв’язування між білковим фрагментом цього рецептора і відповідним лігандом. Таким аналізом може бути, наприклад, простий сендвіч-аналіз in vitro типу RIA або ELISA, в якому один з цих білків, наприклад, фрагмент рецептора, імобілізують з носієм (наприклад, планшетом ELISA) і інкубують, після відповідного блокування сайтів зв’язування білка на цьому носії, з другим білком, наприклад, лігандом. Після інкубування, зв’язування ліганду детектують, наприклад, з використанням радіоактивного мічення, в сцинтиляційному лічильнику. Зв’язування ліганду може бути також визначене з міченим антитілом або першим лігандспецифічним антитілом і другим, міченим антитілом, направленим проти константної частини першого антитіла. Таким чином, зв’язування ліганду може бути легко визначене, залежно від мітки, що використовується, наприклад, в кольоровій реакції. Переважно, спосіб даного винаходу призначений для очищення Fc-злитого білка, що містить терапевтичну частину молекули, зроблену з члена суперсімейства TNFR, вибраного з членів суперсімейства TNFR, наведених в списку в таблиці 5. Таблиця 5 Суперсімейство TNFR (згідно з Locksley et al., 2001 і Bossen et al., 2006) Член суперсімейства TNFR NGFR EDAR XEDAR CD40 Fas Ox40 AITR GITR CD30 CD40 HveA 4-1BB TNFR2 LT-бетаR DR3 CD27 TNFR1 LTBR RANK TACI BCMA BAFF-R TRAILR1 TRAILR2 TRAILR3 TRAILR4Fn14 OPG DR4 DR5 DcR1 DcR2 DcR3 Ліганд NGF EDA-A1 EDA-A2 CD40L FasL OX40L AITRL GITRL CD30L CD40L LIGHT, LT-альфа 4-1BBL TNF-альфа, LT-альфа, LT-альфа-бета LIGHT, LT-альфа, LT-альфа-бета TL1A CD27L TNF-альфа, LT-альфа, LT-альфа-бета LT-бета RANKL BlyS, APRIL BlyS, APRIL BAFF (= BlyS) TRAIL TRAIL TRAIL TRAIL TWEAK RANKL, TRAIL TRAIL TRAIL TRAIL TRAIL FasL, LIGHT, TL1A 7 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У переважному варіанті здійснення, Fc-злитий білок містить терапевтичну частину, вибрану з позаклітинного домену TNFR1, TNFR2 або їх TNF-зв'язуючого і необов'язково інгібувального фрагмента. У наступному переважному варіанті здійснення, Fc-злитий білок містить терапевтичну частину, вибрану з позаклітинного домену BAFF-R, BCMA або TACI або їх фрагмента, що зв’язує щонайменше один з Blys або APRIL. Один аналіз для тестування здатності зв’язування з Blys або APRIL описаний, наприклад, в Hymowitz et al., 2006. Ще в одному переважному варіанті здійснення, терапевтична частина Fc-злитого білка містить багатий цистеїном псевдоповтор SEQ ID NO: 1. Переважно, ця терапевтична частина молекули зроблена з TACI. TACI є, переважно, TACI людини. SEQ ID NO: 2 відповідає амінокислотній послідовності повнорозмірного рецептора TACI (також вхід SwissProt 014836). Більш переважно, ця терапевтична частина молекули містить розчинну частину TACI, переважно, зроблену з позаклітинного домену TACI. Переважно, зроблена з TACI терапевтична частина молекули містить щонайменше амінокислоти 33-67 SEQ ID NO:2 і/або амінокислоти 70-104 SEQ ID NO:2. В одному переважному варіанті здійснення, позаклітинний домен TACI, включений в терапевтичну частину згідно з даним винаходом, містить амінокислоти (або складається з них) 1-166 SEQ ID NO: 2, або амінокислоти 30-166 SEQ ID NO: 2, або амінокислоти 30-119 SEQ ID NO: 2, або амінокислоти 30-110 SEQ ID NO: 2. Всі з цих терапевтичних частин молекул є переважними для одержання Fc-злитого білка для очищення за способом цього винаходу, і комбінуються з Fcчастинами, описаними детально вище, і, зокрема, з Fc-частиною молекули, що містить SEQ ID NO: 3 або що складається з SEQ ID NO: 3. Один високо переважний Fc-злитий білок, що підлягає очищенню з використанням даного винаходу, містить SEQ ID NO: 4 або складається з SEQ ID NO: 4 або кодується полінуклеотидом SEQ ID NO: 7. Таким чином, надзвичайно переважно, щоб Fc-злитий білок містив поліпептид, вибраний з a. амінокислот 34-66 SEQ ID NO: 2; b. амінокислот 71-104 SEQ ID NO: 2; с. амінокислот 34-104 SEQ ID NO: 2; d. амінокислот 30-110 SEQ ID NO: 2; е. SEQ ID NO: 3; f. SEQ ID NO: 4; g. поліпептиду, що кодується полінуклеотидом, який гібридизується з комплементом SEQ ID NO: 5 або 6 або 7 за умов високої жорсткості; і h. мутеїну будь-якого із (с), (d), (е) або (f), що має щонайменше 80% або 85% або 90% або 95% ідентичність послідовності з поліпептидом (с), (d), (е) або (f); причому цей поліпептид зв'язується щонайменше з одним з Blys або APRIL. Термін “вільні Fc-частини", “вільна Fc-частина" або просто “вільний Fc" в даному контексті, включає в себе будь-яку частину Fc-вмісного білка, що підлягає очищенню відповідно до даного винаходу, яке зроблене з константного домену або константних доменів імуноглобуліну, але не містить повні додаткові домени. Таким чином, якщо Fc-вмісний білок містить варіабельні домени імуноглобуліну, вільний Fc не містить істотних частин варіабельних доменів. Якщо Fcвмісний білок є Fc-злитим білком, вільний Fc не містить істотних частин терапевтичної частини цього Fc-злитого білка. Вільний Fc може містити димери шарнірної області, домени CH2 і CH3 IgG, які не з’єднані або не зв'язані з істотними частинами терапевтичної частини молекули або варіабельних доменів імуноглобуліну, і відповідає, наприклад, Fc-частині, яка генерується розщепленням папаїном. «Істотна частина» може бути, наприклад, не менше 80, 85, 90, 95, 98, або 99% повнорозмірного варіабельного домену або терапевтичної частини молекули, присутньої в Fc-вмісному білку. Мономери, зроблені з Fc-частини молекули, можуть також міститися в цій фракції вільного Fc. Зрозуміло, що вільний Fc може все ще містити ряд амінокислотних залишків з терапевтичної частини молекули, таких як, наприклад, одну - п'ятдесят або одну - двадцять або одну - десять або одну - п'ять амінокислот або одну або дві окремі амінокислоти, що належать до терапевтичної частини молекули або варіабельного домену, всі ще злитих з Fc-частиною. Катіонообмінна хроматографія може бути проведена на будь-якій придатній катіонообмінній смолі, такій як, наприклад, слабкі або сильні катіонообмінники, як пояснюється вище в розділі Рівень техніки цього винаходу. Переважно, катіонообмінну хроматографію проводять на сильній катіонообмінній смолі. Більш переважно, катіонообмінний матеріал містить зшитий метакрилат, модифікований SO3 8 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 групами. Колонка, комерційно доступна під товарною назвою Fractogel EMD SO 3 (з Merck), є прикладом катіонообмінної смоли, яка особливо придатна в контексті даного способу. Переважно, рідину або композицію, що містить Fc-вмісний білок, наносять на катіонообмінну колонку при рН щонайменше на одну одиницю більш низькому, ніж ізоелектрична точка (рI) вказаного Fc-злитого білка. Переважно, після нанесення цю колонку промивають буфером, що має провідність 6-10 мС/см і рН 5,5-7,5. Цей буфер може, наприклад, мати провідність 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8 або 9,9 мС/см. Більш переважно, провідність знаходиться в діапазонах від 7,6 до 9,2, тобто 8,4 ± 0,8 мС/см. Цю стадію промивання, переважно, проводять при рН в діапазоні від 5,5 до 7,5, переважно, від 6,0 до 7,0. рН цього буфера може бути, наприклад, рівний 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 або 7,5. У наступному переважному варіанті здійснення, стадію промивання проводять в буфері, що містить 60-140, переважно, 70-130, більш переважно, 75-125 мМ фосфат натрію. Цей буфер може містити 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135 або 140 мМ фосфат натрію. У додатковому переважному варіанті здійснення, цю катіонообмінну колонку елююють при рН в діапазоні від 7,0 до 8,5, переважно, 7,25-7,3 або 7,35 або 7,4 або 7,45 або 7,5 або 7,55 або 7,6 або 7,65 або 7,7 або 7,75 або 7,8 або 7,85 або 7,9 або 7,95 або 8,0 або 8,05 або 8,1 або 8,15 або 8,2 або 8,25 або 8,3 або 8,35 або 8,4 або 8,45 або 8,5. Елюція може, переважно, бути проведена при провідності в діапазоні від 15 до 22 мС/см. Наприклад, провідність може бути вибрана з 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22 мС/см. Переважним буфером для елюції є фосфатний буфер. Відповідно до даного винаходу, катіонообмінна хроматографія може бути, переважно, використана для елімінації або зменшення вільного Fc в 5-15-кратному діапазоні. Таким чином, може бути досягнуте зменшення концентрації вільного Fc в рідини, препараті або композиції, що містять Fc-вмісний білок, до менше 20% або менше 15% або менше 10% або менше 5% або менше 2% або менше 1% або менше 0,8% або менше 0,5% або менше 0,3% або менше 0,2% або менше 0,1% загальної концентрації білка. У переважному варіанті здійснення, катіонообмінна хроматографія може бути використана в способі очищення, що має одну або декілька додаткових стадій, переважно, вибраних з афінної хроматографії, аніонообмінної хроматографії і гідроксіапатитної хроматографії. У високо переважному варіанті здійснення, спосіб даного винаходу використовують як другу стадію схеми очищення Fc-вмісного білка, що включає в себе наступні стадії: a. піддавання рідини, що містить вказаний Fc-вмісний білок Білок А- або Білок G- або Білок L-афінній хроматографії; b. піддавання елюату зі стадії (а) катіонообмінній хроматографії; с. піддавання елюату зі стадії (b) аніонообмінній хроматографії; і d. піддавання прохідної фракції стадії (с) гідроксіапатитній хроматографії і збір елюату для одержання очищеного Fc-вмісного білка. Відповідно до даного винаходу, рідину, що містить Fc-вмісний білок, спочатку піддають Білок А- або Білок G- або Білок L або Білок А/G-афінній хроматографії. Ця рідина може бути, переважно, матеріалом культури клітин, наприклад, солюбілізованими клітинами, більш переважно, супернатантом культури клітин. Термін “супернатант культури клітин" належить в даному контексті, до середовища, в якому культивуються клітини і в яке секретуються білки, за умови, що вони містять відповідні клітинні сигнали, так звані сигнальні пептиди. Переважно, експресуючі Fc-вмісний білок клітини культивують в умовах безсироваткового культивування. Так, переважно, супернатант культури клітин позбавлений компонентів сироватки тварин. Найбільш переважно, середовище культури клітин є середовищем з певним хімічним складом. Білок А, G, А/G або L, що використовується для афінної хроматографії, може бути, наприклад, рекомбінантним. Він може бути також модифікований для поліпшення його властивостей (наприклад, як в смолі, званій MabSelect SuRe, комерційно доступній з GE Healthcare). У переважному варіанті здійснення, стадію (а) проводять на смолі, що містить зшиту агарозу, модифіковану рекомбінантним Білком А. Колонка, комерційно доступна під назвою Mabselect Xtra (з GE Healthcare), є прикладом афінної смоли, яка особливо придатна для стадії (а) цього способу. 9 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Білок А- або Білок G- або Білок L-афінна хроматографія використовується, переважно, як стадія захоплення і, отже, служить для очищення Fc-вмісного білка, зокрема, елімінації білків клітини-хазяїна і агрегатів Fc-вмісного білка, і для концентрування препарату Fc-вмісного білка. Термін “агрегати", в даному контексті, стосується агрегатів білка і включає в себе мультимери (такі як димери, тетрамери або агрегати більш високого порядку) Fc-вмісного білка, що підлягає очищенню, і можуть призводити, наприклад, до високомолекулярних агрегатів. Афінна хроматографія має додаткову перевагу зменшення рівня агрегатів в 2-4 рази. З використанням Білок А- або G- або А/G- або L-афінної хроматографії рівні білків клітинихазяїна можуть бути зменшені в 100-300 разів. У переважному варіанті здійснення цього винаходу, елюцію в стадії (а) проводять при рН в діапазоні 2,8-4,5, переважно, 3,0-4,2, більш переважно, при 3,5, 3,55, 3,6, 3,65, 3,7, 3,75, 3,8, 3,85, 3,9, 3,95, 4,0, 4,05, 4,1 або 4,15. Елюція в стадії (a) може також бути проведена градієнтом pH, переважно, градієнтом pH від 4,5 до 2,8. У наступному переважному варіанті здійснення, елюцію в стадії (а) проводять в буфері, вибраному з ацетату натрію або цитрату натрію. Відповідні концентрації буфера вибрані, наприклад, з 50 мМ або 100 мМ або 150 мМ або 200 мМ або 250 мМ. Згідно з даним винаходом, елюат з Білок А- або Білок G- або білок А/G- або Білок Lхроматографії піддають катіонообмінній хроматографії, описаній детально вище. Переважно, елюат катіонообмінної хроматографії, тобто стадії (b), розбавляють або діалізують у придатний буфер для нанесення перед нанесенням його на аніонообмінну колонку. Аніонообмінну колонку, переважно, також врівноважують буфером для нанесення. Переважний рН для буфера нанесення є щонайменше на одну одиницю більш низьким, ніж рI. Відповідні величини рН знаходяться в діапазоні від 6,0 до 8,5, переважно, від 7,0 до 8,0, наприклад, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95 або 8,0. Переважна провідність для буфера для нанесення знаходиться в діапазоні 3,0 4,6 мС/см. Придатним буфером для врівноваження/нанесення може бути, наприклад, фосфат натрію при концентрації в діапазоні від 5 до 35, переважно, від 20 до 30 мМ. Наприклад, концентрація буфера може бути 10, 15, 20, 25, 30 мМ. У межах даного винаходу, рідину, що протікає (також звану рідиною, що проскакує) аніонообмінної хроматографії, що містить представляючий інтерес Fc-вмісний білок, збирають. Стадія (с) цього способу даного винаходу додатково зменшує агрегати в 3-5 разів і білки клітини-хазяїна в 30-70 разів. Згідно з даним винаходом, прохідну рідину аніонообмінної хроматографії стадії (с) використовують потім для додаткового очищення гідроксіапатитною хроматографією. Будь-яка гідроксіапатитна смола може бути використана для проведення стадії (d) способу за даним винаходом. У переважному варіанті здійснення, стадію (d) проводять на керамічній гідроксіапатитній колонці, такій як гідроксіапатитна смола типу I або типу II. Гідроксіапатитна смола може мати частинки будь-якого розміру, наприклад, 20, 40 або 80 мкм. У високо переважному варіанті здійснення, ця керамічна гідроксіапатитна смола містить частинки, що мають розмір 40 мкм. Гідроксіапатитною смолою, яка особливо придатна для стадії (d) цього способу, є колонка, комерційно доступна під назвою Керамічний гідроксіапатит Типу I СНТ, 40 мкм. У переважному варіанті здійснення, прохідну рідину зі стадії (с) безпосередньо наносять на гідроксіапатитну смолу, тобто без попереднього розведення або діалізу у придатний буфер для нанесення. Нанесення, переважно, проводять при pH 6,5-7,5, наприклад, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,1, 7,2, 7,3 або 7,4, і, переважно, 7,0. У наступному переважному варіанті здійснення, елюцію в стадії (d) проводять в присутності фосфату натрію в діапазоні від 2 до 10 мМ, переважно, в діапазоні від 1,75 до 5,25 мМ, наприклад, при 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5 мМ. Ще в одному переважному варіанті здійснення, елюцію в стадії (d) проводять при рН в діапазоні від 6,0 до 7,0, наприклад, при 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9. В іншому переважному варіанті здійснення, елюцію в стадії (d) проводять в присутності хлориду натрію в діапазоні від 0,4 до 1 M, переважно, при 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 M, найбільш переважно, при 0,6 M. Згідно з даним винаходом, збирають елюат гідроксіапатитної хроматографії, що містить остаточно очищений препарат Fc-вмісного білка. Придатними матеріалами матрикса, тобто матеріалами-носіями для хроматографічних смол, що використовуються в стадіях (а) - (с), які можуть бути використані в зв'язку з даним винаходом, може бути, наприклад, агароза (сефароза, супероза), декстран (сефадекс), 10 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 поліпропілен, метакрилат-целюлоза, полістирол/смінілбензол, або т.п. Ці матеріали смол можуть бути присутніми в різних зшитих формах, залежно від конкретного застосування. Об'єм смоли, довжина і діаметр колонки, що використовується, а також динамічна місткість ішвидкість потоку залежать від декількох параметрів, таких як об'єм рідини, що обробляється, концентрація білка в рідині, що піддається способу цього винаходу, і т.д. Визначення цих параметрів для кожної стадії знаходиться в межах середньої кваліфікації фахівця в даній галузі. У переважному варіанті здійснення даного способу очищення, виконують одну або декілька стадій ультрафільтрації. Ультрафільтрація застосовна для видалення малих органічних молекул і солей в елюатах, що походять з попередніх хроматографічних стадій, для врівноваження Fc-вмісного білка в загальному буфері або для концентрування Fc-вмісного білка до бажаної концентрації. Така ультрафільтрація може, наприклад, виконуватися на ультрафільтраційних мембранах, з часами, що дозволяють видалення компонентів, які мають молекулярну масу нижче 5, 10, 15, 20, 25, 30 або більше за кДа. Переважно, ультрафільтрацію проводять між стадіями (b) і (с), і/або після стадії (d). Більш переважно, проводять дві стадії ультрафільтрації, одну між стадіями (b) і (с) і одну після стадії (d). Якщо білок, очищений відповідно до цього способу даного винаходу, призначений для введення людям, корисно включити одну або декілька стадій видалення вірусів в цьому способі. Переважно, стадію фільтрації для видалення вірусів проводять після стадії (d). Більш переважно, цією стадією фільтрації для видалення вірусу є стадія нанофільтрації, де цей фільтр має номінальний розмір пір 20 нм. Спосіб за даним винаходом і, зокрема, стадії (a), (с), (d), в комбінації з нанофільтрацією ефективно елімінує вірусне навантаження до об'єднаної LRV (log-величини зменшення) до приблизно 15-25. Для полегшення зберігання або транспортування, наприклад, цей матеріал може бути замороженим і відтавати до і/або після будь-якої стадії очищення цього винаходу. Згідно з даним винаходом, рекомбінантний Fc-злитий білок може продукуватися в еукаріотичній системі експресії, такій як клітини дріжджів, комахи або ссавця, що призводить до глікозильованих Fc-вмісних білків. Згідно з даним винаходом, найбільш переважно, експресувати Fc-вмісний білок в клітинах ссавців, таких як клітинні лінії тварин, або в клітинних лініях людини. Клітини яєчника Китайського хом’ячка (СНО) або клітинна лінія мієломи миші NS0 є прикладами клітинних ліній, які є особливо придатними для експресії Fc-вмісного білка, що підлягає очищенню. Цей Fcвмісний білок може також, переважно, продукуватися в клітинних лініях людини, таких як, наприклад, клітинна лінія фібросаркоми НТ1080 людини, клітинна лінія ретинобластоми людини PERC6 або клітинна лінія ембріональної нирки людини 293 або перманентна клітинна лінія амніоцитів, як описано, наприклад, в ЕР 1230354. Якщо Fc-злитий білок, що підлягає очищенню, експресується клітинами ссавців, що секретують його, вихідним матеріалом способу очищення цього винаходу є супернатант культури клітин, також званий збором клітин або неочищеним збором. Якщо клітини культивують в середовищі, що містить сироватку тварини, супернатант цієї культури клітин також містить сироваткові білки як забруднення. Переважно, експресуючі і секретуючі Fc-вмісний білок клітини культивують в безсироваткових умовах. Fc-вмісний білок може також продукуватися в середовищі з визначеним хімічним складом. У цьому випадку, вихідним матеріалом способу очищення є супернатант без сироваткової культури клітин, який містить в основному білки клітин-хазяїнів як забруднення. Якщо до середовища культури клітин додають фактори росту, такі як інсулін, ці білки будуть також елімінуватися під час процесу очищення. Для створення розчинних, секретованих Fc-вмісних білків, які вивільняються в супернатант культури клітин, використовують або природний сигнальний пептид терапевтичної частини Fcвмісного білка, або, переважно, гетерологічний сигнальний пептид, тобто сигнальний пептид, зроблений з іншого секретованого білка, що є ефективним в цій конкретній системі експресії, такій як, наприклад, сигнальний пептид бичачого або людського гормону росту, або сигнальний пептид імуноглобуліну. Як згадувалося вище, переважним Fc-вмісним білком для очищення згідно з даним винаходом, є Fc-вмісний білок, що має терапевтичну частину молекули, зроблену з TACI людини (SEQ ID NO: 2), і, зокрема, з його позаклітинного домену (амінокислоти 1-165 SEQ ID NO: 2). Переважний фрагмент містить амінокислоти 30-110 SEQ ID NO: 2. У подальшому описі, терапевтичні частини, зроблені з позаклітинного домену TACI, будуть називатися “розчинним TACI" або “sTACI". Переважна Fc-частина молекули містить SEQ ID NO: 3, що призводить до 11 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Fc-злитого білка SEQ ID NO: 4, в подальшому описі званому “TACI-Fc". Термін TACI-Fc, в даному контексті, включає в себе також мутеїни TACI-Fc. Термін "мутеїни", в даному контексті, стосується аналогів sTACI або TACI-Fc, в яких один або декілька з амінокислотних залишків sTACI або TACI-Fc замінені іншими амінокислотними залишками або делетовані, або один або декілька амінокислотних залишків додані до первинної послідовності sTACI або TACI-Fc без істотної зміни активності одержаних продуктів в порівнянні з первинними sTACI або TACI-Fc. Ці мутеїни одержують відомими способами синтезу і/або сайт-направленого мутагенезу, або будь-яким іншим способом, придатним для цього. Мутеїни відповідно до даного винаходу включають в себе білки, що кодуються нуклеїновою кислотою, такою як ДНК або РНК, яка гібридизується з комплементом ДНК або РНК, який кодує sTACI або TACI-Fc відповідно до будь-якого з SEQ ID NO: 2 або 4 за жорстких умов. Одним прикладом ДНК-послідовності, що кодує TACI-Fc, є SEQ ID NO: 7. Термін "жорсткі умови" стосується гібридизації і подальших умов промивання, які фахівці із звичайною кваліфікацією в даній галузі зазвичай називають «жорсткими». Див. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N. Y., §§6.3 and 6.4 (1987, 1992). Без обмеження, приклади жорстких умов включають в себе умови промивання, на 12-20ºC нижче розрахованої Tm гібрида, що досліджується, наприклад, в 2 × SSC і 0,5% ДСН протягом 5 хвилин, 2 × SSC і 0,1% ДСН протягом 15 хвилин; 0,1 × SSC і 0,5% ДСН при 37°С протягом 30-60 хвилин і потім 0,1 × SSC і 0,5% ДСН при 68°С протягом 30-60 хвилин. Фахівці із звичайною кваліфікацією в даній галузі розуміють, що умови жорсткості залежать також від довжини ДНКпослідовностей, олігонуклеотидних зондів (наприклад, 10-40 основ) або змішаних олігонуклеотидних зондів. Якщо використовуються змішані зонди, переважно, використовувати хлорид тетраметиламонію (TMAC) замість SSC. Див. Ausubel, supra. В іншому варіанті здійснення, будь-який такий мутеїн має щонайменше 50%, щонайменше 60%, щонайменше 70%, щонайменше 75%, щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90% або щонайменше 95% ідентичність або гомологію з вихідним білком. Ідентичність відображає спорідненість між двома або більше поліпептидними послідовностями або двома або більше полінуклеотидними послідовностями, що визначається порівнянням цих послідовностей. Зазвичай, ідентичністю називають точну відповідність нуклеотиду нуклеотиду або амінокислоти амінокислоті двох полінуклеотидів або двох поліпептидних послідовностей, відповідно, протягом довжини послідовностей, що порівнюються. Для послідовностей, де немає точної відповідності, може бути визначена “%-ва ідентичність". Зазвичай, ці дві послідовності, що порівнюються, зіставляють для одержання максимальної кореляції між цими послідовностями. Це може включати в себе інсертування «гепів» в будь-яку одну з послідовностей або в обидві послідовності для збільшення міри зіставлення. %-ва ідентичність може бути визначена протягом всієї довжини кожної з послідовностей (так зване глобальне зіставлення), що порівнюються, що особливо зручно для послідовностей однієї і тієї ж довжини, або протягом коротких визначених довжин (так зване локальне зіставлення), яке особливо зручне для послідовностей нерівної довжини. Способи для порівняння ідентичності і гомології двох або декількох послідовностей добре відомі в даній галузі. Так, наприклад, програми, доступні в пакеті Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J et al., 1984), наприклад, програми BESTFIT і GAP, можуть бути використані для визначення %-вої ідентичності між двома полінуклеотидами і %-вої гомології між двома поліпептидними послідовностями. BESTFIT використовує алгоритм "локальної гомології" Smith and Waterman (1981 р.) і знаходить найкращий єдиний район схожості між двома послідовностями. Інші програми для визначення ідентичності і/або схожості між послідовностями також відомі в даній галузі, наприклад, сімейство програм BLAST (Altschul SF et al, 1990, Altschul SF et al, 1997, доступне через домашню сторінку NCBI в www.ncbi.nlm.nih.gov), і FASTA (Pearson WR, 1990). Будь-який такий мутеїн, переважно, має послідовність амінокислот, достатньо «дублікатну» відносно послідовності sTACI або TACI-Fc, щоб мати по суті однакову лігандзв’язувальну активність з активністю білка SEQ ID NO: 2 або 4. Наприклад, однією активністю TACI є його здатність зв’язування з Blys або APRIL (Hymowitz et al., 2006). Можна вважати, що, поки цей мутеїн має істотну зв'язуючу APRIL або Blys активність, він має по суті однакову активність у відношенні TACI. Таким чином, кваліфікований в даній галузі фахівець може легко визначити, чи має будь-який конкретний мутеїн по суті ту ж саму активність, що і білок SEQ ID NO: 2 або 4, за допомогою рутинного експериментування. 12 UA 99262 C2 5 10 Переважні зміни для мутеїнів згідно з цим винаходом є змінами, які відомі як «консервативні» заміни. Консервативні амінокислотні заміни sTACI або TACI-Fc можуть включати в себе синонімічні амінокислоти в групі, які мають досить схожі фізико-хімічні властивості, щоб заміна між членами цієї групи зберігала біологічну функцію цієї молекули (Grantham, 1974). Ясно, що інсерції і делеції амінокислот можуть бути також зроблені у вищеописаних послідовностях без зміни їх функції, зокрема, якщо ці інсерції або делеції включають в себе тільки невелику кількість амінокислот, наприклад, менше тридцяти, менше двадцяти або, переважно, менше десяти, і не видаляють або не замінюють амінокислоти, які вирішальними для функціональної конформації, наприклад, залишки цистеїну. Білки і мутеїни, що продукуються такими делеціями і/або інсерціями, входять в сферу дії даного винаходу. Переважно, цими консервативними групами амінокислот є групи, визначені в таблиці 2. Більш переважно, групами синонімічних амінокислот є групи, визначені в таблиці 3; і, найбільш переважно, групами синонімічних амінокислот є групи, визначені в таблиці 4. Таблиця 2 Переважні групи синонімічних амінокислот Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser, Thr, Gly, Asn Arg, Gln, Lys, Glu, His Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Gly, Thr, Pro, Ala Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Gln, Asp, Ser, Asn Glu, Gln, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp 15 Таблиця 3 Більш переважні групи синонімічних амінокислот Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Синонімічна група Ser His, Lys, Arg Leu, Ile, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro, Ala Val, Met, Ile Gly Ile, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Phe, Tyr Cys, Ser His, Gln, Arg Glu, Gln, His 13 UA 99262 C2 Asn Lys Asp, Asn Lys, Arg Продовження таблиці 3 Більш переважні групи синонімічних амінокислот Амінокислота Asp Glu Met Trp Синонімічна група Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp Таблиця 4 Найбільш переважні групи синонімічних амінокислот Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp 5 10 15 20 Синонімічна група Ser Arg Leu, Ile, Met Pro Thr Ala Val Gly Ile, Met, Leu Phe Tyr Cys, Ser His Gln Asn Lys Asp Glu Met, Ile, Leu Met Функціональне похідне може бути одержане з Fc-злитого білка, очищеного відповідно до даного винаходу. «Функціональні похідні», в даному контексті, включають в себе похідні Fcвмісного білка, що підлягають очищенню відповідно до даного винаходу, які можуть бути одержані з функціональних груп, які зустрічаються у вигляді бічних ланцюгів на цих залишках, або N- або С-кінцевих груп, способами, відомими в даній галузі, і включені в даний винахід, поки вони залишаються фармацевтично прийнятними, тобто вони не руйнують активність цього білка, яка є по суті однаковою з цією активністю немодифікованого Fc-вмісного білка, вказаного вище, і не надають токсичні властивості композиціям, які його містять. Функціональні похідні Fc-вмісного білка можуть бути, наприклад, кон’юговані з полімерами для поліпшення властивостей цього білка, таких як стабільність, час напівжиття, біодоступність, переносимість організмом людини або імуногенність. Для досягнення цієї мети Fc-вмісний білок може бути зв'язаний, наприклад, з поліетиленгліколем (ПЕГ). ПЕГілювання може бути проведене відомими способами, описаними, наприклад, в WO 92/13095. Функціональні похідні можуть також включати в себе, наприклад, аліфатичні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, утворені реакцією з аміаком або з первинними або вторинними амінами, N-ацилпохідні вільних аміногруп амінокислотних залишків, утворені з ацильними частинами молекул (наприклад, алканоїльною або карбоциклічною ароїльною групами) або О-ацилпохідні вільних гідроксильних груп (наприклад, гідроксильних груп серильних або треонільних залишків), утворені з ацильними частинами молекул. 14 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У третьому аспекті, даний винахід стосується білка, очищеного способом очищення відповідно до даного винаходу. Далі такий білок називається також «очищеним Fc-вмісним білком». Такий очищений Fc-вмісний білок є, переважно, високоочищеним Fc-вмісним білком. Високоочищений Fc-злитий білок визначають, наприклад, за присутністю єдиної смуги в забарвленому сріблом, невідновленому гелі електрофорезу в ДСН-ПААГ після нанесення білка в кількості 2 мкг на доріжку. Очищений Fc-злитий білок може бути також визначений за елюцією у вигляді єдиного піка в ВРХ. Препарат Fc-вмісного білка, одержаний з процесу очищення цього винаходу, може містити менше 20% забруднень, переважно, менше 10%, 5%, 3%, 2% або 1% забруднень, або він може бути очищений до гомогенності, тобто бути таким, що не містить будь-яких детектованих білкових забруднюючих домішок згідно з визначенням, наприклад, електрофорезом в ДСНПААГ з фарбуванням сріблом або ВРХ, як пояснено вище. Очищені Fc-вмісні білки можуть бути призначені для терапевтичного застосування, зокрема, для введення пацієнтам-людям. Якщо очищений Fc-вмісний білок вводять пацієнтам, його вводять, переважно, системно і, переважно, підшкірно або внутрішньом'язово, або місцево, тобто локально. Може бути зручним також ректальне або внутрішньооболонкове введення, залежно від конкретного медичного застосування очищеного Fc-вмісного білка. Для цієї мети, в переважному варіанті здійснення даного винаходу, очищений Fc-вмісний білок може бути приготований у вигляді фармацевтичної композиції, тобто разом з фармацевтично прийнятним носієм, ексципієнтами або т.п. Визначення “фармацевтично прийнятний" включає в себе будь-який носій, який не перешкоджає ефективності біологічної активності активного інгредієнта і який не є токсичним відносно хазяїна, якому його вводять. Наприклад, для парентерального введення цей активний білок (активні білки) можуть бути приготовані в уніфікованій (стандартній) формі для ін'єкції в таких носіях, як сольовий розчин, розчин декстрози, сироватковий альбумін і розчин Рінгера. Активні інгредієнти фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом можуть вводитися індивідууму різними способами. Способи введення включають в себе інтрадермальний, трансдермальний (наприклад, в препаратах повільного вивільнення), внутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутрішньовенний, підшкірний, пероральний, внутрішньочерепний, епідуральний, місцевий, ректальний і інтраназальний способи введення. Може бути використаний будь-який інший терапевтично ефективний спосіб введення, наприклад, абсорбція через епітеліальні або ендотеліальні тканини або за допомогою генної терапії, де пацієнту вводять (наприклад, за допомогою вектора) ДНК-молекулу, що кодує активний агент, який викликає експресію і секрецію цього активного агента in vivo. Крім того, білок (білки) цього винаходу можуть вводитися разом з іншими компонентами біологічно активних агентів, такими як фармацевтично прийнятні поверхнево-активні речовини, ексципієнти, носії, розріджувачі і наповнювачі. Для парентерального (наприклад, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового) введення, активний білок (активні білки) можуть бути приготовані у вигляді розчину, суспензії, емульсії або ліофілізованого порошку в асоціації з фармацевтично прийнятним парентеральним носієм (наприклад, водою, сольовим розчином, розчином декстрози) і домішками, які підтримують ізотонічність (наприклад, маніт) або хімічну стабільність (наприклад, консерванти і буфери). Цей препарат стерилізують способами, що зазвичай використовуються. Терапевтично ефективні кількості активного білка (активних білків) будуть залежати від багатьох змінних, в тому числі від типу Fc-вмісного білка, афінності Fc-вмісного білка відносно його ліганду, способу введення, клінічного стану пацієнта. “Терапевтично ефективна кількість" є такою кількістю, що при введенні цей Fc-вмісний білок призводить до інгібування його ліганду терапевтичної частини цього Fc-злитого білка, як пояснювався вище, і відповідно до таблиці 5 вище. Доза, що вводиться, у вигляді єдиної дози або у вигляді множинних доз, індивідууму, буде варіюватися залежно від різних факторів, що включають в себе фармацевтичні властивості Fcзлитого білка, спосіб введення, стан і характеристики пацієнта (стать, вік, масу тіла, стан здоров'я, розмір), ступінь симптомів, одночасні способи лікування, частоту введення доз і бажаний ефект. Коректування встановлених діапазонів доз і маніпулювання ними знаходиться цілком в межах кваліфікації фахівців в даній галузі, так само як і способи in vitro і in vivo визначення інгібування його ліганду терапевтичної частини Fc-злитого білка в індивідуумові. Очищений Fc-вмісний білок може бути використаний в кількості 0,001-100 мг/кг або 0,01-10 мг/кг маси тіла або 0,1-5 мг/кг маси тіла або 1-3 мг/кг маси тіла або 2 мг/кг маси тіла. 15 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У наступних переважних варіантах здійснення, очищений білок Fc-злитий білок вводять один раз на день або кожний другий день або три рази на тиждень або один раз на тиждень. Добові дози зазвичай вводять в розділених дозах або у вигляді форми затриманого вивільнення, ефективного для одержання бажаних результатів. Друге або подальше введення можуть виконуватися у вигляді дози, яка є тією ж самою, меншою або більшою, ніж вихідна або попередня доза, введена цьому індивідууму. Друге або подальше введення може виконуватися під час або до виявлення цього захворювання. Даний винахід належить також до застосування катіонообмінної хроматографії для зменшення концентрації вільних Fc-частинок в композиції, що містить Fc-вмісний білок. У переважному варіанті здійснення концентрація вільного Fc зменшується до менше 20% або менше 15% або менше 10% або менше 5% або менше 2% або менше 1% або менше 0,8% або менше 0,5% або менше 0,2% або менше 0,1% загальної концентрації білка вказаної композиції. Після повного опису цього винаходу, кваліфікованим в даній галузі фахівцям буде зрозуміло, що він може виконуватися в широкому діапазоні еквівалентних параметрів, концентрацій і умов без відхилення від ідеї і обсягу цього винаходу і без надмірного експериментування. Хоча даний винахід був описаний в зв'язку з його конкретними варіантами здійснення, буде зрозуміло, що він може бути підданий додатковим модифікаціям. Ця заявка призначена для включення будь-яких варіацій, застосувань або адаптації цього винаходу відповідно, загалом, з принципами цього винаходу і з включенням таких відхилень від даного опису, які знаходяться в межах відомої або звичайної практики в галузі, до якої належить даний винахід, і які можуть бути застосовані до основних ознак, описаних тут вище, як випливає з обсягу прикладеної формули винаходу. Всі посилання, що цитуються тут, в тому числі журнальні статті або анотації, опубліковані або неопубліковані заявки на патент США або іноземні заявки, видані США, або іноземні патенти або інші посилання, включені тут як посилання в повному вигляді, в тому числі з всіма результатами, таблицями, фігурами і текстом, представленими в цих посиланнях, що цитуються. Крім того, весь вміст цих посилань в документах, що цитуються тут, включений тут в повному вигляді. Посилання на відомі стадії способу, загальноприйняті стадії способів, відомі способи або загальноприйняті способи в жодній мірі не є визнанням того, що будь-який аспект, будь-який опис або будь-який варіант здійснення цього винаходу описаний, пояснений або висловлений як припущення у відомому рівні техніки. Попередній опис конкретних варіантів здійснення буде настільки повно виявляти основний характер цього винаходу, що інші дослідники можуть, за допомогою використання знань, що даються кваліфікацією в даній галузі (в тому числі наведеним змістом посилань, що цитуються), легко модифікують і/або адаптують для різного застосування такі конкретні варіанти здійснення, без надмірного експериментування, без відхилення від загальної концепції даного винаходу. Таким чином, передбачається, що така адаптація і модифікації знаходяться в діапазоні еквівалентів цих описаних варіантів здійснення, на основі тверджень і керівних описів, представлених в них. Повинно бути зрозуміло, що фразеологія або термінологія, що застосовується тут, служить меті описання, а не обмеження, так що ця термінологія або фразеологія даного опису повинна інтерпретуватися кваліфікованим в даній галузі фахівцем в світлі пояснень і керівництва, представлених тут, в комбінації зі знаннями фахівця із звичайною кваліфікацією в даній галузі. ПРИКЛАДИ: ОЧИЩЕННЯ РЕКОМБІНАНТНОГО TACI-Fc ЛЮДИНИ З БЕЗСИРОВАТКОВОГО СУПЕРНАТАНТУ КЛІТИН СНО Перелік скорочень BV: об'єм шару CHO: яєчник китайського хом’ячка DSP: процес нижче за потоком EDTA: етилендіамінтетраоцтова кислота ELISA: твердофазний імуносорбентний аналіз HAC: гідроксіапатитна хроматографія HCP: білок клітини-хазяїна ВРХ: високоефективна рідинна хроматографія id: внутрішній діаметр K: калій кД: кілоДальтон 16 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 MES: 2-морфоліноетансульфонова кислота Na: натрій NaAc: ацетат натрію н.в.: не визначали PA-SE-HPLC: Білок А - гель-проникна - високоефективна рідинна хроматографія м.ч.: мільйонні частинки RO: зворотний осмос к.т.: кімнатна температура ДСН-ПААГ: додецилсульфат натрію - поліакриламідний гель-електрофорез SE-HPLC: гель-проникна - високоефективна рідинна хроматографія Т°С: температура TMAC: хлорид тетраметиламонію УФ: ультрафіолет WFI: вода для ін'єкцій WRO водний зворотний осмос Приклад 1: Стадія захоплення: Афінне очищення на Білці А Вихідним матеріалом був просвітлений збір клону клітин СНО, що експресують TACI-Fc, які культивуються при безсироваткових умовах і що зберігаються в замороженому вигляді до використання. Стадію захоплення на колонці MabSelect Xtra™ (GE Healthcare 17-5269-03) проводили згідно з наступним протоколом, на колонці, що має висоту шару 17 див. Всі операції виконували при кімнатній температурі, за винятком розчину для нанесення, який зберігали при температурі нижче за 15°С. Реєстрували сигнал УФ при 280 нм. Дезінфікування Колонку дезінфікували щонайменше 3 колонковими об'ємами (3 BV) 0,1 М оцтова кислота + 20% етанол в зворотному потоці при 250 см/год. Цей потік зупиняли і витримували протягом 1 години. Стадія промивання Колонку промивали щонайменше 2 колонковими об'ємами (2 BV) RO води в зворотному потоці при 250 см/год. Врівноваження Колонку врівноважували щонайменше 5 колонковими об'ємами (5 BV) 25 мМ фосфат натрію + 150 мМ NaCl pH 7,0 (поки параметри провідності і рН знаходяться у вказаному діапазоні: pH 7,0 ± 0,1, провідність 18 ± 2 мС/см) в направленому вниз потоку при 450 см/год. Нанесення На колонку наносили просвітлений збір, що зберігається при температурі нижче 15°С, до місткості 15 мг загального TACI-Fc, визначеної аналізом Biacore, на мл упакованої смоли при швидкості потоку 350 см/год. Стадія промивання Цю колонку промивали щонайменше 2 колонковими об'ємами (2 BV) буфера для врівноваження при 350 см/год, потім щонайменше 4 колонковими об'ємами (4 BV) буфера для врівноваження (поки сигнал УФ не повертався до лінії фону) при 450 см/год. Елюція Цей матеріал елюювали різними буферами для елюції, як показано в таблиці I, при швидкості потоку 350 см/год. Фракцію елюату збирали від початку збільшення сигналу УФ до 6,0±0,5 BV елюції. Елюат інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі при рН нижче 4,1 (доведеного додаванням розчину лимонної кислоти, якщо необхідно) і потім рН доводили до 5,0±0,1 додаванням 32% розчину NaOH. Регенерація Колонку регенерували щонайменше 3 колонковими об'ємами (3 BV) 50 мМ NaOH + 1 M NaCl в зворотному потоці при 450 см/год, зупиняли потік на 15 хвилин і потім знов запускали цей потік при 450 см/год щонайменше протягом протікання 3 колонкових об'ємів (поки сигнал УФ не повертався до лінії фону). З цієї стадії колонка працювала в режимі зворотного потоку. Стадія промивання Колонку промивали щонайменше 2 BV RO-води при 450 см/год. Дезінфікування Колонку дезінфікували щонайменше 3 BV буфера для дезінфекції при 250 см/год, потік зупиняли і колонку інкубували протягом 60 хвилин. Кінцеві стадії промивання 17 UA 99262 C2 5 Колонку промивали щонайменше 1 BV RO-води при 250 см/год, потім щонайменше 3 BV буфера для врівноваження при 250 см/год і нарешті щонайменше 2 BV RO-води при 250 см/год. Нарешті, цю колонку зберігали після промивання щонайменше 3 BV 20% етанолу при 250 см/год. Результати Таблиця I Результати з використанням різних буферів для елюції Номер досліду 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 10 Буфер для елюції Вихід TACI-Fc (%) Агрегати (%) HCP (м.ч.) 50 мМ NaAc pH3,7 100 мМ NaAc pH3,8 200 мМ NaAc pH3,8 100 мМ NaAc pH3,7 0,2M NaAc+150 мМ NaCl pH4 100мМ NaAc pH3,7 250мМ NaAc pH3,7 100мМ Na-цитрат pH3,7 250мМ Na-цитрат pH3,7 100мМ Na-цитрат pH3,75 100мМ Na-цитрат pH3,75 100мМ NaAc pH3,85 100мМ Na-цитрат pH3,75 100мМ Na-цитрат pH3,65 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ Na-цитрат pH3,9 100 мМ Na-цитрат pH3,9 100 мМ Na Ac pH4,1 100 мМ Na-цитрат pH3,9 100 мМ NaAc pH4,1 100 мМ Na-цитрат pH3,75 100 мМ NaAc pH4,2 100 мМ Na-цитрат pH3,9 47,7 55,7 58,0 68 75,1 84,6 82,8 79,2 71,9 82,8 66,6 83,3 81,0 75,1 44,7 47,1 50,7 58,0 67,1 65,6 75,6 57,1 51,9 58 41,8 39,4 31,0 28,3 46,4 42,8 57,5 38,1 43,3 30,3 25,2 28,2 30,0 3,8 22 18,7 8,8 23 8,5 9,0 15,0 9,1 14,6 18,4 15,8 9,4 10,4 28,7 17,5 19,4 20,7 18,4 11,5 22,9 6,0 8,8 25,0 9,1 13,4 26,5 10,1 8,3 5558 не визначали не визначали не визначали не визначали 3491 3318 4710 2347 1576 664 не визначали 3490 2580 3783 3217 2349 2550 2372 2353 1807 2465 2030 1746 3029 2424 2936 3311 не визначали не визначали не визначали не визначали 2011 100 мМ Na-цитрат pH3,9 100 мМ Na-цитрат pH3,9 100 мМ Na-цитрат pH3,9 100 мМ Na-цитрат pH3,9 100 мМ Na-цитрат pH3,9 100 мМ Na-цитрат pH3,9 63,6 65,7 62,7 61,6 60,6 64,6 6,6 7,3 7,4 7,4 7,4 8,0 1749 1689 1609 1479 1623 1497 Висновки TACI-Fc5 в просвітленому зборі захоплювали безпосередньо на колонці MabSelect Xtra при динамічній місткості 15 г загального TACI-Fc5 на літр упакованої смоли при швидкості потоку 350 см/год. Умови елюції, зокрема, pH, оптимізували для максимізації витягання продукту, при забезпеченні значного зменшення рівнів агрегатів. Був вибраний буфер для елюції 0,1 М цитрат натрію pH 3,9, що дає приблизно 5-10% рівні агрегатів, в порівнянні з приблизно 25-40% в 18 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 просвітленому зборі, без спостереження каламутності. Рівні HCP були зазвичай рівні 1500-2000 м.ч. Рівні HCP вимірювали за допомогою ELISA з використанням поліклональних антитіл. Цю суміш антитіл генерували проти білків клітин-хазяїнів, одержаних з просвітленого і концентрованого супернатанту культури клітин нетрансфікованих клітин СНО. Приклад 2: Катіонообмінна хроматографія Елюат зі стадії захоплення на Білці А, діалізованих у відповідний буфер для нанесення, використовували як вихідний матеріал для катіонообмінної хроматографії. У цій стадії використовували колонку Fractogel EMD SO 3 (Merck 1.16882.0010), що має висоту шару 10 см. Може бути використана також колонка Fractogel SO3 з висотою шару 15 см. В останньому випадку динамічна місткість і швидкість потоку можуть вимагати адаптації, яка знаходиться цілком в межах звичайних знань фахівця в даній галузі. Всі операції виконували при кімнатній температурі і швидкість потоку підтримували постійною при 150 см/год. При всіх часових точках реєстрували сигнал УФ при 280 нм. Стадія промивання Колонку промивали щонайменше 1 BV WRO (водним зворотним осмосом). Дезінфікування Потім цю колонку дезінфікували щонайменше 3 BV 0,5M NaOH + 1,5 М NaCl в режимі потоку вгору. Промивання Цю колонку промивали щонайменше 4 BV WRO в режимі потоку вниз. Врівноваження Колонку врівноважували щонайменше 4 BV 100 мМ цитратом натрію pH 5,0 (або поки не досягалися бажана провідність 12±1 мС/см і рН 5,0 ± 0,1). Нанесення На колонку наносили матеріал після захоплення при рН 5,0 (pH при 5,0±0,1, провідність при 12±1 мС/см) і при місткості не більше 50 мг TACI-Fc, як визначено аналізом SE-HPLC, на мл упакованої смоли. Стадія промивання Потім колонку промивали щонайменше 5 BV 100 мМ фосфатом натрію pH 6,5. Елюція Колонку елюювали різними буферами і при різних умовах, представлених в таблицях II - IV нижче. Регенерація і дезінфікування Колонку регенерували і дезінфікували 4 BV 0,5 M NaOH + 1,5M NaCl в режимі потоку вгору. Потім потік зупиняли і витримували протягом 30 хвилин. Промивання Колонку промивали щонайменше 4 BV WRO. Зберігання Колонку зберігали щонайменше в 3 BV 20% етанолу. Результати Таблиця II Дія рН і провідність при елюції Рівні HCP в нанесеному матеріалі: 189 м.ч. pH 6,5 7,3 8,0 7,3 7,3 7,3 7,3 7,3 6,3 8,0 8,2 6,5 7,3 7,3 Провідність (мС/см) 15,0 22,5 15,0 22,5 33,0 22,5 22,5 12,0 22,5 30,0 22,5 30,0 22,5 22,5 Витягання TACI-Fc 25% 100% 95% 100% 98% 96% 97% 54% 83% 96% 97% 91% 93% 95% 19 НСР (м.ч.) 118 50 34 56 133 45 53 79 47 108 46 116 48 40 Кліренс НСР (х) 1,6 3,8 5,5 3,4 1,4 4,2 3,6 2,4 4,1 1,8 4,2 1,6 3,9 4,8 UA 99262 C2 Таблиця III показує витягання TACI-Fc і кліренс HCP при нанесенні при місткості 10 і 32 мг TACI-Fc на мл смоли і елююванні в фосфатному буфері при провідності 12-33 мС/см. Збір піка виконували від початку збільшення УФ протягом 10 ± 0,5 BV. Таблиця III Дія оптимального рН і провідність при елюції при нанесенні при місткості 10 і 32 мг TACI-Fc на мл Рівні НСР в нанесеному матеріалі: 201 м.ч. Місткість завантаження pH (мг/мл) 10 8,0 32 Провідність (мС/см) Витягання TACI-Fc HCP (м.ч.) 8,0 15,0 20,7 20,7 91% 93% 88% 67 61 54 Кліренс НСР (х) 3,0 3,3 3,7 5 Таблиця IV показує дію стадії промивання 50 або 100 або 150 мМ фосфатом натрію з рН 6,5 на витягання TACI-Fc і кліренс НСР. Таблиця IV Дія умов стадії промивання на продуктивність колонки Рівні HCP в завантаженні: 190 м.ч. і рівні агрегатів: 2,0% Концентрація фосфату в промивальному розчині (мМ) промивання (промивальний розчин) 1 промивання (промивальний розчин) 2 промивання (промивальний розчин) 3 10 15 20 25 30 35 50 100 150 Вихід TACI-Fc в НСР в Вихід TACI- Агрегати в промивальному елюаті Fc в елюате елюаті розчині (м.ч.) 0,7% 99% 2,8% 62 2,1% 98% 2,9% 59 9,1% 90% 2,7% 49 Буфер, використаний в промивальному розчині 2, що містить 100 мМ фосфат натрію рН 6,5, мав провідність 8,4 мС/см. Фіг. 1 показує забарвлений сріблом, невідновлений гель електрофорезу в ДСН-ПААГ проб, одержаних з експериментів з використанням умов тристадійного промивання, показаних в таблиці IV на кліренсі вільного Fc. Фіг. 2 показує частково співпадаючі хроматограми експериментів зі стадіями очищення з фосфатом натрію при різних концентраціях. Стадію промивання оптимізували при рН 6,5 з концентраціями фосфату натрію, що збільшуються (50-150 мМ). Як можна бачити на фігурі 1, концентрація промивального буфера 150 мМ (промивання 3, доріжка 6) призводила до втрат TACI-Fc. Концентрація промивального буфера 50 мМ (промивання 1, доріжка 8) призводила до піка чистого TACI-Fc, однак цей елюат містив сліди вільного Fc. Стадія промивання з 100 мМ фосфатом натрію pH 6,5 призводила до 98% витягання в основному піці елюції і тільки 2% втрат в цьому проманні (фіг. 2). Кліренс HCP збільшувався в 3,2 рази. Аналіз фракцій промивання і елюату за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ показав, що стадія промивання містила вільний Fc з деякою кількістю інтактного TACI-Fc при концентраціях буфера 100 мМ або більш високих (фіг. 1, доріжки 4 і 6). Концентрація 100 мМ або більше є необхідною для повного видалення вільного Fc з фракцій елюату (фіг. 1, доріжки 5 і 7). Висновки Катіонообмінну стадію вводили як другу стадію очищення після стадії захоплення. Елюат стадії захоплення був при низькому рН (5,0) і низькій провідності і міг бути безпосередньо нанесений на катіонообмінник. Була вибрана смола Fractogel EMD SO 3 із завантажувальною місткістю 50 мг/мл. Продукт не біологічно активної деградації, вільний Fc, міг бути ефективно видалений в стадії промивання 0,1 М фосфатом натрію рН 6,5. Умови елюції були оптимізовані для найкращого кліренсу HCP і високого витягання TACI-Fc (179 мМ фосфат натрію рН 8,0, провідність 20,7 мС/см). Альтернативно, елюція може бути проведена в 10 BV 20 мМ фосфату натрію і 180 мМ NaCl, рН 8,0 від початку збільшення оптичної щільності при 280 нм. Приклад 3: Аніонообмінна хроматографія 20 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 Вихідним матеріалом, що використовується для цієї стадії очищення, був елюат з катіонообмінної стадії на Fractogel SO3 (див. приклад 2), розведений або діалізований у відповідний буфер для нанесення. Цю стадію аніонообмінної хроматографії проводили на колонці SOURCE 30Q (GE Healthcare 17-1275-01) з висотою шару 10 см. У цій стадії може бути також використана колонка SOURCE 30Q з висотою шару 15 см. В останньому випадку, динамічна місткість і швидкість потоку можуть вимагати адаптації, яка знаходиться цілком в межах звичайних знань фахівця в даній галузі. Всі операції виконували при кімнатній температурі і реєстрували сигнал УФ при 280 нм. Ці стадії проводили при швидкості потоку або 150, або 200 см/год. Промивання Спочатку цю колонку промивали щонайменше 1 BV RO води при швидкості потоку 150 см/год. Дезінфікування Потім колонку дезінфікували щонайменше 3 BV 0,5 M NaOH + 1,5 M NaCl. Стадія промивання Колонку промивали щонайменше 3 BV, переважно, 4-10 BV 0,5 M фосфату Na pH 7,5 при швидкості потоку 200 см/год. Врівноваження Колонку врівноважували щонайменше 5 BV 10, 15, 20, 25 або 30 мМ фосфату натрію pH 7,5. Необов'язково, ця колонка може бути заздалегідь врівноважена 3 BV 0,5 M фосфату натрію pH 7,5. Нанесення, промивання і збір забруднювачів TACI-Fc в прохідному потоці На колонку наносили матеріал, одержаний після катіонообміну, розведений для одержання концентрації фосфату 10-30 мМ, рН 7,5 при місткості не більше 50 мг TACI-Fc, згідно з визначенням за допомогою аналізу SE-HPLC, на мл упакованої смоли, збираючи прохідний потік від початку збільшення УФ до кінця цієї стадії промивання, яку проводять в 4±0,5 BV буферу для врівноваження. Регенерація/дезінфікування Цю колонку регенерували і дезінфікували щонайменше 3 BV 0,5 M NaOH + 1,5 M NaCl в режимі зворотного потоку (поки сигнал УФ не повертається до лінії фону) при швидкості потоку 150 см/год. В кінці цієї регенерації насос зупиняли на 30 хвилин. Стадія промивання Цю колонку промивали щонайменше 3 BV RO води при швидкості потоку 200 см/год. Зберігання Цю колонку зберігали щонайменше в 3 BV 20% етанолу (об./об.). Результати Наступна таблиця V підсумовує результати, одержані з використанням способу очищення, описаного вище. 40 Таблиця V Дія концентрації фосфату, що використовується для нанесення (завантаження) Концентрація Концентрація TACIМісткість рН фосфату Витягання Fc завантаження завантаження завантаження завантаження TACI-Fc (мг/л) (мг/мл) (мМ) 7,5 30 773 39 94% 7,5 25 639 39 90% 7,5 20 651 49 90% 7,5 15 437 46 88% 7,5 10 283 не визначали 82% 45 Агрегати HCP (м.ч.) 10,4% 6,9% 5,6% 3,4% 2,8% 82,8 50,4 43,9 45,0 26,3 Висновки Аніонообмінну стадію на колонці Source 30Q в проточному режимі оптимізували для максимізації кліренсу HCP і агрегатів. Нанесення елюату з катіонообмінника, або розведеного, або діафільтрованого, в 20 мМ натрій-фосфатному буфері при рН 7,5 давало найкращий компроміс між витяганням продукту (90%) і кліренсом HCP (приблизно від 2000 м.ч. до 44 м.ч.) і 21 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 агрегатів (приблизно від 25% до 5,6%). Використовували динамічну місткість 50 мг TACI-Fc на мл упакованої смоли при швидкості потоку 150-200 см/год. Приклад 4: Гідроксіапатитна хроматографія Вихідним матеріалом, що використовується для цієї стадії очищення, був прохідний потік аніонообмінної хроматографії (див. приклад 3). Використовували CHT Ceramic Hydroxyapatite Type I (СНТ керамічний гідроксіапатит Типу I), колонку 40 мкм (Biorad 157-0040) з висотою шару 10 см. Всі операції проводили при кімнатній температурі. Швидкість потоку підтримували постійною при 175 см/год і реєстрували сигнал УФ при 280 нм. Всі розчини стерильнофільтрували і обладнання дезінфікували гідроксидом натрію перед використанням. Колонку зберігали в 0,5 M розчині NaOH, коли її не використовували. Початкові стадії промивання (промивання і попереднє врівноваження) Цю колонку промивали щонайменше 1 BV 20 мМ буфера фосфату натрію pH 7,5 і потім щонайменше 3 BV 0,5 мМ буфера фосфату натрію рН 7,5 для зниження рН. Врівноваження Колонку врівноважували щонайменше 5 BV 20 мМ фосфату натрію pH 7,5 (або поки не досягалися бажана провідність 3,0 ± 0,3 мС/см і рН 7,5 ± 0,1). Нанесення На колонку наносили прохідний потік з колонки SOURCE 30Q з доданим хлоридом кальцію до кінцевої концентрації 0,1 мМ з вихідного розчину при 0,5 М і рН доводили до 7,0 додаванням 85% ортофосфорної кислоти при місткості NMT 50 мг TACI-Fc, визначеній за допомогою аналізу SE-HPLC, на мл упакованої смоли. Можна також наносити прохідний потік з колонки SOURCE 30Q без хлориду кальцію, з доведенням до рН 7,0 на гідроксіапатитній колонці. Стадії промивання Цю колонку промивали щонайменше 4 BV 3, 4 або 5 мМ фосфатом натрію, 10 мМ MES, 0,1 мМ CaCl2 pH 6,5. У цих стадіях можна також використовувати той самий буфер без хлориду кальцію. Елюція Колонку елюювали 5, 4, 3 або 2 мМ натрій-фосфатним буфером (див. таблицю VI), 10 мМ MES, 0,1 мМ CaCl2 і 0,6, 0,7, 0,8 або 0,9 M KCl pH 6,5 (див. таблицю VII) від початку збільшення УФ для різних BV (див. таблиці VI і VII). Для елюції можна також використовувати той самий буфер без хлориду кальцію. Промивання Колонку промивали: - щонайменше 1 BV 20 мМ натрій-фосфатного буфера pH 7,5; - щонайменше 3 BV 0,5 M натрій-фосфатного буфера pH 7,5; і - щонайменше 1 BV 20 мМ натрій-фосфатного буфера pH 7,5. Зберігання Цю колонку зберігали щонайменше в 3 BV 0,5 M NaOH. Результати Таблиця VI показує дію концентрації фосфату (від 2 до 5 мМ) в буфері для елюції на кліренс агрегатів і витягання продукту. Фракції піку елюції об'єднували і аналізували за допомогою SE-HPLC на концентрацію TACI-Fc і рівні агрегатів. 22 UA 99262 C2 Таблиця VI Дія концентрації фосфату в буфері для елюції Концентрація фосфату (мМ) 5 4 3 2 5 BV елюції 12 13 14 15 16 17 18 12 13 14 15 16 17 18 12 13 14 15 16 17 18 12 13 14 15 16 17 18 Вихід TACI-Fc 73% 74% 68% 77% 77% 70% 76% 68% 67% 66% 67% 66% 66% 66% 70% 76% 73% 71% 69% 69% 70% 65% 66% 66% 68% 66% 71% 65% Агрегати 0,49% 0,52% 0,65% 0,67% 0,70% 0,73% 0,85% 0,34% 0,29% 0,36% 0,39% 0,38% 0,32% 0,40% 0,46% 0,42% 0,51% 0,52% 0,55% 0,50% 0,53% 0,19% 0,00% 0,18% 0,14% 0,17% 0,19% 0,16% Таблиця VII показує дію концентрації KCl в буфері для елюції на кліренс агрегатів і витягання продукту. Досліджували дві концентрації фосфату натрію: 2 і 3 мМ. Фракції піку елюції об'єднували і аналізували за допомогою SE-HPLC на концентрацію TACI-Fc і рівні агрегатів. 23 UA 99262 C2 Таблиця VII Дія концентрації хлориду калію в буфері для елюції Концентрація фосфату (мМ) 3 3 20 25 0,6 2 15 0,8 2 10 0,7 3 5 Концентрація KCl (М) 0,6 0,9 BV елюції Вихід TACI-Fc Агрегати 10 11 12 13 14 10 11 12 13 14 10 11 12 13 14 10 11 12 13 14 10 11 12 13 14 102% 109% 106% 105% 103% 96% 97% 98% 96% 96% 106% 110% 112% 101% 110% 71% 79% 80% 80% 81% 64% 72% 73% 70% 66% 0,48% 0,46% 0,43% 0,42% 0,43% 0,42% 0,40% 0,41% 0,40% 0,43% 0,58% 0,55% 0,57% 0,59% 0,57% 0,29% 0,28% 0,29% 0,29% 0,26% 0,27% 0,25% 0,29% 0,33% 0,24% Висновки: Гідроксіапатитна хроматографія забезпечує надійний ефективний спосіб зменшення рівнів агрегатів TACI-Fc. З використанням як вихідного матеріалу очищеного аніонообмінною хроматографією матеріалу (див. приклад 3) з рівнями агрегатів приблизно 5-8%, гідроксіапатитна хроматографія може зменшувати ці рівні до менше 0,8% з витяганням TACI-Fc 85-90%. Джерела інформації: 1. Akerstrom and Bjork, J Biol Chem. 1989 Nov 25;264(33): 19740-6 2. Altschul SF et al., J Mol Biol, 215, 403-410, 1990 3. Altschul SF et al., Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997 4. Armour KL. et al., 1999. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 29(8):2613-24 5. Bodmer et al., TIBS 27(1), 19-24 6. Boschetti, Е., Jungbauer, Sep. Sci. & Tech. 2 No. 15, Acad. Press (2000) 53 7. Boschetti et al., Genetic EnGlneering Vol. 20, No. 13, July, 2000 8. Bossen et al., JBC 281 (2), 13964-13971 9. Bram and von Bulow, US 5,969,102 (1999) 10. Bram et al., WO 98/39361 11. Carter PJ., 2006. Potent antibody therapeutics by design. Nature Reviews Immunology. Advance online publication 12. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984 13. Feng et al., Bioprocessing 2005, 1-7 14. Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000) 15. Grantham et al., Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974) 16. Gross et al., Nature 404(27), 995-999 17. Gross et al., WO 00/40716 24 UA 99262 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 18. Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279(8):6213-6 19. Hymowitz et al., JBC 280(8), 7218-7227 20. Idusogie EE. et al., 2000. Mapping of the C1q binding site on rituxan, а chimeric antibody with а human IgGI Fc. J Immunol. 164(8):4178-84 21. Idusogie EE. et al., 2001. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J Immunol. 166(4):2571-5 22. Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, З. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD 23. Kochanek et al., EP 1 230 354 24. Locksley et al., Cell 104, 487-501, 2001 25. Melchers, Ann. Rheum. Dis 2003, 62, 25-27 26. Moore et al., Science 285: 260-3 27. Moreau et al., Blood 103(8), 3148-3157 28. Naismith and Sprang, TIBS 23, 74-79, 1998 29. Novak et al., Blood 103(2), 689-694 30. Parker et al., WO 02/094852 31. Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98 32. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, and G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599 (1975) 33. Porath and B. Olin, Biochemistry 22, 1621-1630 (1983) 34. Puren et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 2;96(5):2256-61 35. Shepard, J. of Chromatography 891:93-98 (2000) 36. Shields RL. et al., 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma Rl, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgGI variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 276(9):6591-604. 37. Smith et al., WO 91/03553 38. Smith et al., WO 94/06476 39. Stanker, J. Immunological Methods 76:157-169 (1985) (10 mM to 30 mM sodium phosphate elusion gradient) 40. Steurer W. et al., 1995. Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes graft tolerance. J Immunol. 155(3): 1165-74 41. Sun et al., WO 2005/044856 42. Tarditi, J. Chromatography 599:13-20 (1992) 43. Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. Nat Biotechnol. 23(10): 1283-8 44. Vigers et al., Nature. 1997 Mar 13; 386(6621 ):190-4 45. Vedantham et al., WO 03/59935 46. Vola et al., BioTechniques 14:650-655 (1993) 47. von Bulow and Bram, Science 228: 138 (1997) 48. Xia et al., J. Exp. Med. 2000, 137-143. СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Ares Trading S.A. Спосіб очищення Fc-вмісних білків 1146 WO/PCT EP06119611.9 2006-08-28 US60/842,542 2006-09-06 7 Patentln version 3.3 1 40 Білок штучна послідовність джерело / примітка=опис штучної послідовності: консенсусна послідовність, в якій конкретні амінокислоти в положеннях З, 12, 14, 15, 18, 21, 25, 34 і 38 розділені будь-якою амінокислотою варіант 25 UA 99262 C2 (1)…(2), (4)…(11), 13, (16)… (17), (19)… (20), (22)… (24), (26)… (33), (35)… (37) и (39)… (40)