Спосіб визначення концентрації німесуліду в біологічній рідині

Винахід відноситься до аналітичних методів в біохімії, а саме до методів визначення німесуліду методом високоефективної рідинної хроматографії. Переважна більшість сучасних методів визначення концентрації німесуліду в крові належить до методів високоефективної рідинної хроматографії. Вони дають змогу контролювати параметри фармакокінетики німесуліду, і тим самим обґрунтовано здійснити підбір оптимальної дози і частоти призначення цього препарату. Саме цій меті слугує і запропонований, метод. Оскільки нижня межа терапевтичної дози німесуліду дорівнює 2,72мкг/мл, необхідно, щоб чутли вість методу складала 10% від нижньої межі терапевтичної дози, тобто була 200нг/мл. Всі відомі методи базуються приблизно на однаковій послідовності операцій. Так, спочатку проводиться виділення німесуліду з біологічної рідини екстракційними методами з використанням органічних розчинників, наприклад дихлорметану [Khaksa G., Udupa N. Rapid and sensitive method for determination of nimesulide in human plasma by high-performance liquid chromatography. //J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. - 1999. - Apr., 30.-727(1-2). P.241-244]. Подальше видалення органічного розчинника та реекстракція німесуліду займає близько 4-х годин [Jaworowicz D.J., Filipowski M.T., Boje K.M. Improved high-performance liquid chromatographic assay for nimesulide.//J. Chromatogr. В. Biomed. Sci. Appl.- 1999.- Feb. 19. - 723 (1-2). - P.293-299]. Після реекстрації проба вводиться до хроматографічної колонки, як правило, С18 (наприклад, Hypersil BDS C18 (5 microm particle size; 250х4.6 mnn)[Jaworowicz D.J. та ін., 1999], або Supelcosil LC-18 DB column [Mass spectrometric characterization and HPLC determination of the main urinary metabolites of nimesulide in man. /M. Carini, G.AIdini, R.Stefani at al// J. Pharm. Biomed. Anal.-1998. - Oct, 18(1-2). - P.201-211]. Елюєнти також не відрізняються різноманітністю використовуються переважно варіації суміші метанолу або ацетонітрилу та фосфатного або цитратного буфер у (рН3,0-5,5) причому доля органічного розчинника складає від 80 до 50%. Спектрофотометричне детектування визначення ведеться на довжині хвилі 230-240нм, причому межа визначення дорівнює 25-30нг/мл [Giachetti С., Tenconi A. Determination of nimesulide and hydroxynimesulide in human plasma by high performance liquid chromatography. // Biomed. Chromatogr. - 1998, Mar-Apr. - 12(2). - P.50-56] Проте, наведена послідовність дій має певні недоліки. Так, під час екстрагування німесуліду з подальшою реекстракцією спостерігається втрата певної кількості речовини. Причому, втрачена частка є постійною для ряда паралельних проб лише в тому випадку, коли аналіз проводиться спеціалістом вищої кваліфікації. Це не може не впливати на вартість аналізу. На вартість аналізу також впливає ускладнення процесу визначення додатковими ступенями методики, що потребує, крім того, додаткового часу. Для спрощення методики визначення німесуліду, підвищення її точності за рахунок усунення втрат речовини в процесах екстрагування-реекстрагування було запропоновано змінити методу пробопідготовки. Найбільш близьким за сукупністю ознак до винаходу є метод визначення німесуліду у біологічних рідинах з використанням екстракції до дихлорметану з подальшою реекстракцією рідиною із складом хроматографічного елюєнта (фосфа тний буфер (рН5.5)-метанол-ацетонітрил у співвідношенні 50:20:30 за об'ємом) [Khaksa G., Udupa N. Rapid and sensitive method for determination of nimesulide in human plasma by high-performance liquid chromatography //J.Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. - 1999. - Apr., 30. - 727(1-2). - P.241-244]. В основу винаходу поставлено задачу спростити та здешевити метод визначення німесуліду у біологічній рідині, скоротити час на пробопідготовку. Це стає можливим завдяки заміні міжфазної екстракції (рідина-рідина. або у твердофазному патроні) на однофазну екстракцію у ацетонітрил. Оскільки ацетонітрил є ефективним білокосаджуючим агентом, його застосування дозволяє уникнути цілої низки операцій - екстрагування, видалення розчинника, реелюювання, а це, в свою чергу, зменшує ризик втрати частини німесуліду. Зниження концентрації німесуліду у рідині, яка вводиться в колонку, не є критичним, чому сприяють велика чутливість сучасних хроматографів у поєднанні із значною терапевтичною концентрацією німесуліда в крові. 0,2мл сироватки крові підкисляли 0,02мл 1М соляної кислоти і після перемішування додавали внутрішній стандарт - 0,05мл розчину індометацину (Sigma, USA) з концентрацією 5мкг/мл, а після повторного перемішування - 0,6мл ацетонітрилу. Проба енергійно струшувалась протягом однієї хвилини. За цей час практично весь німесулід, який був зв'язаний з білковими молекулами (як було показано - до 96%) переходить в розчин. Після цього пробу центрифугували при 3000об/хв протягом 30хв. Надосадову рідину фільтрували на мембранному фторопластовому фільтрі МФФКГ-3 (НПФ "Біохром") з розміром пор 0,45мкм. Кількісне визначення німесуліду проводили на високоефективному рідинному хроматографі HP-1100 "Leonardo" на колонці розмірами 125х4мм, заповненій твердою фазою Hypersil BDS C18 з розмірами гранул 5мкм. В колонку вводили 20мкл відфільтрованої надосадової рідини. Застосовано ізократичне елюювання зі складом мобільної фази - 50% 0,03М цитратного буферу рН=3,1 і 50% ацетонітрилу, швидкість елюювання - 600мкл/хв, температура колонки 20°С. Детектування німесуліду проводилось при довжині хвилі 240нм. За цих умов час виходу німесуліду з колонки складав 5,92хв., а час виходу вн утрішнього стандарту (індометацину) - 8,45хв. В діапазоні концентрацій німесуліду від 0,2 до 50мкг/мл зберігається пропорційна залежність, між площею хроматографічного піку та кількістю препарату в пробі. Встановлено, що відношення площі піків індометацину (внутрішнього стандарту) до площі піків німесуліду є величиною сталою і дорівнює 1,77. Концентрація німесуліду в сироватці крові розраховували за наступною формулою: S ×K × K × C і C= н 1 2 Si де: Sн - пло ща піку німесуліду; Si - площа піку індометацину; К1 - калібрувальний коефіцієнт - відношення площ піків індометацину та німесуліду, взятих в рівних концентраціях (за нашими даними К1=1,77); К2 - коефіцієнт розведення - відношення об'єму проби після додавання всіх компонентів до вихідного об'єму проби (в наших умовах К2=4,35); Сі - концентрація внутрішнього стандарту в кожній пробі (Сі=5,75мкг/мл). Нами були досліджені також метрологічні параметри методу визначення німесуліду. Виявилось, що пропонований нами метод, відрізняється точністю, достатньою відтворюваністю та високою чутливістю. Так, при визначенні німесуліду, доданого до сироватки у концентраціях від 0,50 до 4,00мкг/мл (серіями по 5 паралельних проб), величина відносної похибки середнього результату не перевищувала 3,5% для довірчого інтервалу Р=0,95. Нижня межа визначення німесуліду складала 25нг/мл (відношення "сигнал/шум" >10).