Спосіб визначення концентрації амізону в біологічній рідині

Спосіб визначення концентрації' амізону в біологічних рідинах, який включає додавання до біо Корисна модель відноситься аналітичних методів в біохімії, а саме до методів визначення амізону (препарат з групи ненаркотичних анапьгетиків, який розроблено та виробляється в Рівень техніки На цей момент в літературі не існує відомостей щодо визначення амізону у біологічних рідинах будь-яким методом, у тому числі і методом високоефективної рідинної хроматографії. Але розробка нових лікарських форм цього препарату, багаточисельні дослідження використання амізону у інших галузях медицини (наприклад, як противірусний засіб) потребують визначення концентрації амізону з метою вивчення його розподілу по органах, та дослідження параметрів його фармакокінетики, що у свою чергу є необхідним для відпрацьовування частоти призначення препарату і величини його дози. Саме для цього І призначений запропонований метод. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити метод визначення концентрації амізону у біологічній рідині Амізон за хімічною структурою є четвертинною амонієвою сполукою - це сіль М-метил-4бензилкарбамідопиридинію. Цілком природно, що найпростіший метод визначення амізону методом високоефективної рідинної хроматографії має передбачати застосування іонообмінної колонки. Але ці колонки поширені відносно слабо, та за ціною вони набагато дорожчі, ніж традиційні зво логічної рідини ацетонітрилу, струшування та центрифугування, після чого відбирають надосадову рідину, до якої додають хлороформ, після повторного струшування та центрифугування верхній рідкий шар відбирають та вводять у хроматографічну колонку, заповнену зворотнофазною насадкою, причому елюент містить іон-парну до амізону речовину - гептансульфонову кислоту - у кількості до Імг/мл. ротньофазні, з привитою фазою С8-С18. Оскільки метод, що розробляється, призначений для відносно широкого кола невеликих лабораторій, тому він базується на застосуванні стандартних CS-C18 ко-лонок. Це стає можливим завдяки використанню такої модифікації зворотньофазної хроматографії як іон-парна хроматографія, інших шляхів тут бути не може внаслідок сильної хемосорбції (спеціально дезактивовані фази С18 не розглядаються внаслідок їх малої поширеності). Метод значно спрощується завдяки заміні міжфазної екстракції (рідина-рідина або у твердофазному патроні) на однофазну екстракцію у ацето нітрил Завдяки тому, що ацетонітрил є ефективним білокосаджуючим агентом, його застосування дозволяє уникнути цілої низки операцій - екстрагування, видалення розчинника, реелюювання. Виключення цієї низки операцій, у свою чергу, зводить втрати амізону під час пробопідготовки практично до нуля. Зниження концентрації амізону у рідині, яка вводится в колонку, не є критичним, чому сприяють велика чутливість сучасних хроматографічних детекторів. Натомість значно скорочується час виконання аналізу у порівнянні з традиційними хроматографічними методиками. До 0,5мл сироватки крові додавали 1,5мл ацетонітрилу. Проба енергійно струшувалась 4767 протягом однієї хвилини. Після цього пробу центрифугували при 1000об/хв протягом 10хв. Надосадову рідину зливають, а до неї додають 3,5-4,0мп хлороформу Суміш рідин енергійно струшувалась протягом ЗО секунд, після чого рідини розділялися центрифугуванням при 3000об/хв протягом 10-20 хвилин. Верхній рідкий шар відбирали та фільтрували на мембранному фторопластовому фільтрі МФФКГ-3 (НПФ "Біохром") з розміром пор 0,45мкм. Кількісне визначення амізону проводили на високоефективному рідинному хроматографі НР1100 "Leonardo" на колонці розмірами 150x2,1мм, заповненій твердою фазою Zorbax Eclipse XDBС8 з розміром гранул 5мкм. В колонку вводили 20мкл відфільтрованої рідини Застосовано ізократичне елюювання зі складом мобільної" фази (за об'ємом) - 60% 0,04М фосфатного буферу рН=3,0, який містить гептан сул ьфонову кислоту у кількості 0,1мг/мл, та 40% метанолу. Швидкість елюювання - 150мкл/хв, температура колонки 20°С. Детектування амізону проводилось при довжині хвилі 268нм. За цих умов час виходу амізону з колонки складав 7,09хв. В діапазоні концентрацій амізону від 0,1 до 50мкг/мл зберігається пропорційна залежність, між площею хроматографічного піку та кількістю препарату в пробі. Комп'ютерна верстка Н Лисенко Концентрація препарату визначалася методом зовнішнього стандарту. Як стандарт використовувались зразки сироватки крові, до яких додавалася певна кількість препарату. Стандартні зразки піддавалися такій самій обробці, як і зразки, як підлягали визначенню вмісту амізону Додатково було визначено рівень втрат амізону в процесі пробопідготовки. Для цього рівні кількості розчину амізону додавалися до певних об'ємів сироватки та води. Частину водних розчинів піддавали повному циклу пробопідготовки (як і розчини амізону у сироватці), а частина водних розчинів вводилася до колонки безпосередньо (лише після фільтрування - з метою запобігти пошкодженню колонки) Було продемонстровано, що втрати амізону в процесі пробопідготовки не перевищують 1-3%. Нами були досліджені також метрологічні параметри методу визначення амізону. Виявилось, що пропонований нами метод, відрізняється точністю, достатньою відтворюваністю та високою чутливістю. Так, при визначенні амізону, доданого до сироватки у концентраціях від 0,50 до 4,00мкг/мл (серіями по 5 паралельних проб), величина відносної похибки середнього результату не перевищувала 3,5% для довірчого інтервалу Р=0,95. Нижня межа визначення амізону складала 80 г/мл (відношення "сигнал/шум" >10). Підписне Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601