Мічені вакцини мутованого вірусу бичачої вірусної діареї
Номер патенту: 95619
Опубліковано: 25.08.2011
Автори: Шеппард Майкл Дж., Зібарт Габріель, Хуанг Чічі, Као Ксюемей
Формула / Реферат
1. Мутований вірус бичачої вірусної діареї, що містить щонайменше одну амінокислотну мутацію геліказного домену, де мутація знаходиться в межах геліказного домену NS3 і забезпечує зменшення зв'язування або втрату розпізнавання моноклональним антитілом, створеним проти NS3 з вірусу бичачої вірусної діареї дикого типу, але де зберігається вірусна РНК реплікація та генерування інфекційного вірусу.
2. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, де NS3 антитіло вибирають з групи, що складається з 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 та 24.8.
3. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, де вірусна вакцина містить одну амінокислотну мутацію геліказного домену.
4. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, що містить мутацію геліказного домену у петлі IGR.
5. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 4, що містить мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку 1841 SEQ ID NО: 1.
6. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 4, що містить мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку 1843 SEQ ID NО: 1.
7. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 4, що містить мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку 1845 SEQ ID NО: 1.
8. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, що містить мутацію геліказного домену у петлі КНР.
9. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 8, що містить мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку 1867 SEQ ID NО: 1.
10 Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 8, що містить мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку 1868 SEQ ID NО: 1.
11. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 8, що містить мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку 1869 SEQ ID NО: 1.
12. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, що містить мутацію геліказного домену у петлі SES SEQ ID NО: 1.
13. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 12, що містить мутацію геліказного домену у петлі SES на амінокислотному залишку 1939 SEQ ID NО: 1.
14. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 12, що містить мутацію геліказного домену у петлі SES на амінокислотному залишку 1942 SEQ ID NО: 1.
15. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, де вірус містить дві, три або чотири амінокислотні мутації геліказного домену.
16. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 15, що містить дві мутації геліказного домену.
17. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 16, де дві мутації геліказного домену розташовані у петлі IGR.
18. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 17, де дві мутації геліказного домену у петлі IGR розташовані на амінокислотних залишках 1843 та 1845 SEQ ID NО: 1.
19. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 16, де дві мутації геліказного домену розташовані у петлі SES.
20. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 19, де дві мутації геліказного домену у петлі SES розташовані на амінокислотних залишках 1939 та 1942 SEQ ID NО: 1.
21. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 15, що містить три мутації геліказного домену.
22. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 21, де три мутації геліказного домену розташовані у петлі КНР.
23. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 22, де три мутації геліказного домену у петлі КНР розташовані на амінокислотних залишках 1867, 1868 та 1869 SEQ ID NО: 1.
24. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 21, що містить три мутації геліказного домену у петлі IGR, у петлі КНР та петлі SES, розташовані на амінокислотних залишках 1845, 1868 та 1939 SEQ ID NО: 1.
25. Мічена вакцина вірусу бичачої вірусної діареї, що містить мутований вірус бичачої діареї за п. 1 або 2.
26. In vitro спосіб диференціації тварини, інфікованої вірусом бичачої діареї, від тварини, вакцинованої вакциною за п. 25, де вказаний спосіб включає одержання тестової проби від тестової тварини;
детекцію вірусу бичачої вірусної діареї у вказаній тестовій пробі, та
визначення того, чи містить вірус бичачої діареї мутацію.
27. Спосіб за п. 26, де у вказаному способі детекції вірусу бичачої вірусної діареї використовують щонайменше одне моноклональне антитіло.
28. Спосіб за п. 26, де амінокислотною мутацією геліказного домену міченої вакцини є геліказний домен NS3.
29. Спосіб за п. 27, що включає стадії:
а) додавання міченого антитіла, здатного до детекції вірусу бичачої вірусної діареї дикого типу або здатного до детекції мутованого вірусу бичачої вірусної діареї, до тестової проби, де тестова проба містить рідину організму, взяту від тварини,
б) вимірювання афінності зв'язування вказаного міченого антитіла з вказаним вірусом бичачої вірусної діареї дикого типу або з вказаним мутованим вірусом бичачої вірусної діареї шляхом контактування щонайменше одного моноклонального антитіла з вказаним вірусом бичачої вірусної діареї дикого типу або вказаним мутованим вірусом бичачої вірусної діареї, та
в) визначення статусу вакцінації, якщо тварина отримала мутований вірус бичачої вірусної діареї, шляхом порівняння результатів афінності зв'язування з використанням моноклонального антитіла до вірусу BVDV дикого типу або BVDV, що містить мутацію з межах геліказного домену NS3.
30. Спосіб за п. 27, що включає стадії:
додавання першого міченого антитіла, направленого на домен, інший, ніж мутований NS3, та додавання другого міченого антитіла, направленого на мутовану частину NS3.
31. Спосіб за п. 30, де перше антитіло направлено на вірус дикого типу.
32. Спосіб за п. 30, де друге антитіло направлено на мутовану частину NS3.
33. Спосіб за п. 32, де друге антитіло направлено проти NS3 та його вибирають з групи, що складається з 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 та 24.8.
34. Спосіб за п. 32, де друге антитіло, що направлено щонайменше на одну мутовану частину NS3, вибирають з групи, що складається з петлі IGR, петлі КНР та петлі SES.
35. Спосіб за п. 34, де мутований вірус бичачої вірусної діареї, що містить щонайменше одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку, вибирають з групи, що складається з 1841, 1843 та 1845 SEQ ID NО: 1.
36. Спосіб за п. 34, де мутований вірус бичачої вірусної діареї, що містить щонайменше одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку, вибирають з групи, що складається з 1867, 1868 та 1869 SEQ ID NО: 1.
37. Спосіб за п. 34, де мутований вірус бичачої вірусної діареї, що містить щонайменше одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі SES на амінокислотному залишку, вибирають з групи, що складається з 1939 та 1942 SEQ ID NО: 1.
38. Спосіб за п. 34, де мутований вірус бичачої вірусної діареї містить щонайменше одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі IGR, у петлі КНР та у петлі SES на амінокислотних залишках 1845, 1868 та 1939 SEQ ID NО: 1.
39. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, де вірус вибирають з групи, що містить R1843A, К1845А, RK1843/45A, К1867А, КНР1867/68/69А, Е1939А, R1942A, ER1939/42A і К1845А-Н1868А-Е1939А.
Текст
1. Мутований вірус бичачої вірусної діареї, що містить щонайменше одну амінокислотну мутацію геліказного домену, де мутація знаходиться в межах геліказного домену NS3 і забезпечує зменшення зв'язування або втрату розпізнавання моноклональним антитілом, створеним проти NS3 з вірусу бичачої вірусної діареї дикого типу, але де зберігається вірусна РНК реплікація та генерування інфекційного вірусу. 2. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, де NS3 антитіло вибирають з групи, що складається з 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 та 24.8. 3. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, де вірусна вакцина містить одну амінокислотну мутацію геліказного домену. 4. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, що містить мутацію геліказного домену у петлі IGR. 5. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 4, що містить мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку 1841 SEQ ID NО: 1. 6. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 4, що містить мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку 1843 SEQ ID NО: 1. 7. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 4, що містить мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку 1845 SEQ ID NО: 1. 8. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, що містить мутацію геліказного домену у петлі КНР. 9. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 8, що містить мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку 1867 SEQ ID NО: 1. 10 Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 8, що містить мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку 1868 SEQ ID NО: 1. 11. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 8, що містить мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку 1869 SEQ ID NО: 1. 12. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, що містить мутацію геліказного домену у петлі SES SEQ ID NО: 1. UA (21) a200807756 (22) 24.11.2006 (24) 25.08.2011 (86) PCT/IB2006/003412, 24.11.2006 (31) 60/748,312 (32) 07.12.2005 (33) US (46) 25.08.2011, Бюл.№ 16, 2011 р. (72) ХУАНГ ЧІЧІ, US, ШЕППАРД МАЙКЛ ДЖ., AU, КАО КСЮЕМЕЙ, US, ЗІБАРТ ГАБРІЕЛЬ, US (73) ПФАЙЗЕР ПРОДАКТС ІНК., US (56) US6001613 A, 14.12.1999. US2003165520 A1, 04.09.2003. PASICK JOHN: "APPLICATION OF DIVA VACCINES AND THEIR COMPANION DIAGNOSTIC TESTS TO FOREIGN ANIMAL DISEASE ERADICATION" ANIMAL HEALTH RESEARCH REVIEWS, CABI PUBLISHING, GB, vol. 5, no. 2, December 2004 (2004-12), pages 257-262. GRASSMANN C. W. ET AL.: "Assignment of the multifunctional NS3 protein of bovine viral diarrhea virus during RNA replication: an in vivo and in vitro study." JOURNAL OF VIROLOGY NOV 1999, vol. 73, no. 11, November 1999 (1999-11), pages 9196-9205. DEREGT D. ET AL.: "Mapping of two antigenic domains on the NS3 protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus" VETERINARY MICROBIOLOGY, AMSTERDAM, NL, vol. 108, no. 1-2, 15 June 2005 (2005-06-15), pages 13-22. GU B. ET AL.: "The RNA helicase and nucleotide triphosphatase activities of the bovine viral diarrhea virus NS3 protein are essential for viral replication." JOURNAL OF VIROLOGY FEB 2000, vol. 74, no. 4, February 2000 (2000-02), pages 1794-1800. LACKNER T. ET AL.: "Temporal modulation of an autoprotease is crucial for replication and pathogenicity of an RNA virus." JOURNAL OF VIROLOGY OCT 2004, vol. 78, no. 19, October 2004 (2004-10), pages 10765-10775. GRAHAM D. A. ET AL.: "Antibody responses of naive cattle to two inactivated bovine viral diarrhoea virus vaccines, measured by indirect and blocking ELISAS and virus neutralisation." THE VETERINARY RECORD 28 JUN 2003, vol. 152, no. 26, 28 June 2003 (2003-06-28), pages 795-800. 2 (19) 1 3 13. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 12, що містить мутацію геліказного домену у петлі SES на амінокислотному залишку 1939 SEQ ID NО: 1. 14. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 12, що містить мутацію геліказного домену у петлі SES на амінокислотному залишку 1942 SEQ ID NО: 1. 15. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, де вірус містить дві, три або чотири амінокислотні мутації геліказного домену. 16. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 15, що містить дві мутації геліказного домену. 17. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 16, де дві мутації геліказного домену розташовані у петлі IGR. 18. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 17, де дві мутації геліказного домену у петлі IGR розташовані на амінокислотних залишках 1843 та 1845 SEQ ID NО: 1. 19. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 16, де дві мутації геліказного домену розташовані у петлі SES. 20. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 19, де дві мутації геліказного домену у петлі SES розташовані на амінокислотних залишках 1939 та 1942 SEQ ID NО: 1. 21. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 15, що містить три мутації геліказного домену. 22. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 21, де три мутації геліказного домену розташовані у петлі КНР. 23. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 22, де три мутації геліказного домену у петлі КНР розташовані на амінокислотних залишках 1867, 1868 та 1869 SEQ ID NО: 1. 24. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 21, що містить три мутації геліказного домену у петлі IGR, у петлі КНР та петлі SES, розташовані на амінокислотних залишках 1845, 1868 та 1939 SEQ ID NО: 1. 25. Мічена вакцина вірусу бичачої вірусної діареї, що містить мутований вірус бичачої діареї за п. 1 або 2. 26. In vitro спосіб диференціації тварини, інфікованої вірусом бичачої діареї, від тварини, вакцинованої вакциною за п. 25, де вказаний спосіб включає одержання тестової проби від тестової тварини; детекцію вірусу бичачої вірусної діареї у вказаній тестовій пробі, та визначення того, чи містить вірус бичачої діареї мутацію. 27. Спосіб за п. 26, де у вказаному способі детекції вірусу бичачої вірусної діареї використовують щонайменше одне моноклональне антитіло. 28. Спосіб за п. 26, де амінокислотною мутацією геліказного домену міченої вакцини є геліказний домен NS3. 29. Спосіб за п. 27, що включає стадії: а) додавання міченого антитіла, здатного до детекції вірусу бичачої вірусної діареї дикого типу або 95619 4 здатного до детекції мутованого вірусу бичачої вірусної діареї, до тестової проби, де тестова проба містить рідину організму, взяту від тварини, б) вимірювання афінності зв'язування вказаного міченого антитіла з вказаним вірусом бичачої вірусної діареї дикого типу або з вказаним мутованим вірусом бичачої вірусної діареї шляхом контактування щонайменше одного моноклонального антитіла з вказаним вірусом бичачої вірусної діареї дикого типу або вказаним мутованим вірусом бичачої вірусної діареї, та в) визначення статусу вакцінації, якщо тварина отримала мутований вірус бичачої вірусної діареї, шляхом порівняння результатів афінності зв'язування з використанням моноклонального антитіла до вірусу BVDV дикого типу або BVDV, що містить мутацію з межах геліказного домену NS3. 30. Спосіб за п. 27, що включає стадії: додавання першого міченого антитіла, направленого на домен, інший, ніж мутований NS3, та додавання другого міченого антитіла, направленого на мутовану частину NS3. 31. Спосіб за п. 30, де перше антитіло направлено на вірус дикого типу. 32. Спосіб за п. 30, де друге антитіло направлено на мутовану частину NS3. 33. Спосіб за п. 32, де друге антитіло направлено проти NS3 та його вибирають з групи, що складається з 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 та 24.8. 34. Спосіб за п. 32, де друге антитіло, що направлено щонайменше на одну мутовану частину NS3, вибирають з групи, що складається з петлі IGR, петлі КНР та петлі SES. 35. Спосіб за п. 34, де мутований вірус бичачої вірусної діареї, що містить щонайменше одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку, вибирають з групи, що складається з 1841, 1843 та 1845 SEQ ID NО: 1. 36. Спосіб за п. 34, де мутований вірус бичачої вірусної діареї, що містить щонайменше одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку, вибирають з групи, що складається з 1867, 1868 та 1869 SEQ ID NО: 1. 37. Спосіб за п. 34, де мутований вірус бичачої вірусної діареї, що містить щонайменше одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі SES на амінокислотному залишку, вибирають з групи, що складається з 1939 та 1942 SEQ ID NО: 1. 38. Спосіб за п. 34, де мутований вірус бичачої вірусної діареї містить щонайменше одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі IGR, у петлі КНР та у петлі SES на амінокислотних залишках 1845, 1868 та 1939 SEQ ID NО: 1. 39. Мутований вірус бичачої вірусної діареї за п. 1, де вірус вибирають з групи, що містить R1843A, К1845А, RK1843/45A, К1867А, КНР1867/68/69А, Е1939А, R1942A, ER1939/42A і К1845А-Н1868АЕ1939А. 5 Вірус бичачої вірусної діареї (вірус BVD, або BVDV) є невеликим РНК вірусом роду Pestivirus, сімейства Flaviviridae. Він є близькородинним до вірусів, що є збудниками граничної хвороби овець та класичної свинячої чуми свиней. Захворювання, викликані BVDV, є широко розповсюдженими, та можуть спричинити значні економічні втрати. Інфікування BVDV може призвести до проблем розведення великої рогатої худоби, та може спричинити викиди чи передчасні пологи. BVDV здатний до схрещування із плацентою вагітних тварин, та може спричинити народження персістентно інфікованого (РІ) потомства, імунотолерантного до вірусу та персістентно інфікованого вірусом протягом усього життя. (Malmquist, J. Am. Vet. Med. Assoc.152:763-768 (1968); Ross, et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 188:618-619 (1986)). Інфікована худоба може також проявляти симптоми "вірусної діареї", що характеризується підвищеною температурою, діареєю, кашлем та виразками слизової оболонки органів харчування (Olafson, et al., Cornell Vet.36:205-213 (1946); Ramsey, et al., North Am.Vet.34:629-633 (1953)). Ці персистивно інфіковані тварини є джерелом розповсюдження вірусу у стаді та подальших спалахів вірусної діареї, Dtsch. Tieraerztl. Wschr. 81:481-487 (1974)) та дуже схильні до інфікування мікроорганізмами, що відповідають за спричинення кишкових захворювань або пневмонії (Barber, et al., Vet .Rec.117:459-464 (1985)). Віруси BVD класифікують на два біологічні види. Ті, що відносяться до біологічного виду "ср", викликають цитопатогенну дію на культивовані клітини, тоді як віруси біологічного виду "nср" її не викликають (Gillespie, et al., Cornell Vet. 50:73-79 (1960)). Крім того, визнано два основні генотипи (тип 1 та 2), обидва з яких, як було показано, спричиняють багату кількість клінічних синдромів (Pellerin, et al., Virology 203:260-268 (1994); Ridpath, et al., Virology 205:66-74 (1994)). Вібріони BVD мають діаметр 40-60 нм. Нуклеокапсид BVDV складається з однієї молекули РНК та капсидного протеїну С. Нуклеокапсид знаходиться в оточенні ліпідної мембрани, на якій закріплено два глікопrns ротеїни, Е1 та Е2. Третій глікопротеїн, E , вільно зв'язаний із оболонкою. Геном BVDV має довжину у, приблизно, 12,5 kb, та містить одну відкриту рамку зчитування, розташовану між 5' та 3' нетрансльованими регіонами (NTRs) (Collett, et al., Virology165:191-199 (1988)). Поліпротеїн, приблизно, 438kD був трансльований з цієї відкритої рамки зчитування, та був підданий дії клітинної та вірусної протеази у, щонайменше, одинадцяти вірусних структурних та неструктурних (NS) протеїнах (Tautz, et al., J. Virol.71:5415-5422 (1997); Xu, et al., J. Virol.71:5312-5322 (1997); Elbers, et al., J. Virol.70:4131-4135 (1996); та Wiskerchen, et al., Virology 184:341-350 (1991)). Геномний порядок pro rns BVDV становить p20/N , p14/C, gp48/E , gp25/E1, gp53/E2, p54/NS2, p80/NS3, p10/NS4A, p32/NS4B, pro p58/NS5A та p75/NS5B. P20/N (Stark, et al., J. Virol. 67:7088-7093 (1993); Wiskerchen, et al., Virol.65:4508-4514 (1991)) є цис-діючою, папаїн 95619 6 подібною протеазою, що самовиділяється з інших синтезованих поліпротеїнів. Капсидний протеїн (С), що також має назву р14, є основним протеїном, та функціонує при упаковці геномної РНК та утворенні оболонкового віріону. Р14/С консервативний у різних пестівірусах. Три оболонкові проrns теїни, gp48/E , gp25/E1 та gp53/E2, є у високому rns ступені гликолізовані. E утворює гомодимери, ковалентно зв'язані дисульфід ними містками. Відсутність гідрофобного мембранного фіксуючого rns регіону свідчить, що E вільно зв'язаний із оболоrns нкою. E призводить до утворення високих титрів антитіл у інфікованої великої рогатої худоби, але анти сироватки мають обмежену віруснейтралізуючу активність. Було знайдено, що Е1 у вібріонах ковалентно зв'язаний із gр53/Е2 через дисульфідні зв'язки. Е1 містить два гідрофобні регіони, що слугують якорем для протеїну у мембрані, та сигнальним пептидом для ініціювання транслокації. Е1 не викликає істотного відклику антитіла у інфікованої худоби, що свідчить про те, що він може не бути розташований на поверхні віріону. Подібно до Е1, Е2 також має мембранний фіксуючий регіон при його С-кінці. На відміну від Е1, проте, Е2 є дуже антигенним, будучи одним з найбільш імунодомінантних протеїнів BVDV. Антитіла, що зв'язують Е2, можуть ефективно нейтралізувати вірусну інфекцію, що свідчить про те, що він може бути включений у вірусний вхід. Область поліпротеїну, що розташована нижче структурних протеїнів, кодує не структурні протеїни, та на неї діють два вірусні протеолітичні ферменти. NS2NS3 сполучення розщепляється під дією цинкзалежної протеази, кодованої у NS2. На С-кінцеву частину поліпротеїну BVDV, що кодує NS3, NS4A, NS4B, NS5A та NS5B, діє серін протеаза, кодована N-кінцевим доменом NS3. NS3 є іншим основним імуногеном BVDV, оскільки в інфікованій худобі розвивається сильний гуморальний відклик на нього. Навпаки, в інших не структурних протеїнах сироваткові антитіла не були знайдені у BVDVінфікованої худоби, та тільки слабкий гуморальний імунний відклик на NS4A може бути детектований. NS3 знаходять виключно у цитопатичних ізолятах BVDV, а регіон, що кодує протеїн, є одним з найбільш консервативних у геномі BVDV, виходячи з порівняння підвидів BVDV та інших пестивірусів. С-кінцева частина NS3 кодує РНК-залежну NTPase/геліказу, та, виходячи з порівнянь послідовностей високо консервативних фрагментів геліказних амінокислот, геліказа BVDV була класифікована на геліказне суперсімейство-2 (SF2). У цьому суперсімействі є подібні протеїни з поті-, флаві-, та пестівірусів, включаючи вірусну NS3 геліказу холери свиней (класичної чуми свиней), та РНК гелікази з інших флавівірусів, таких, як вірус Західного Нилу, вірус жовтої лихоманки, вірус гепатиту С (HCV) та вірус японського енцефаліту. Молекулярна структура протезного та геліказного доменів HCV NS3 була вирішена (Yao, et al Nat Struct Biol.4:463-7 (1997); Jin and Peterson, Arch Bioxchem Biophys323:47-53 (1995)). Протеазний домен має подвійне β-вільне згортання що розпо 7 всюджена серед членів хемотрипсін серін протеазного сімейства. Геліказний домен містить два структурно подібні β-α-β-субдомени, а третій субдомен, що складається з семи спіралей та трьох коротких β ланцюгів, зазвичай, має назву геліказного α-спирального субдомену. Нуклеозидний трифосфат (ΝΤΡ) та РНК-зв'язуючі сайти, а також сайт геліказної активності, розташовані на поверхні, тоді як сайт протеазної активності ні, та орієнтований у напрямку геліказного домену. Протеазні та геліказні домени зв'язані ковалентно коротким розташованим на поверхні ланцюгом, та взаємо2 діють на великій площі поверхні (~900 Å ). Сайт геліказної активності, проте, орієнтований від цієї області взаємодії. Серед доступних на даний час вакцин BVDV, є такі, що містять хімічно-інактивований вірус дикого типу (McClurkin, et al., Arch. Virol.58:119 (1978); Femelius, et al., Am. J. Vet. Res. 33:1421-1431 (1972); та Kolar, et al., Am. J. Vet. Res.33:1415-1420 (1972)). Ці вакцини, типово, потребують введення у багатократних дозах, та призводять до короткотривалого імунного відклику; вони також не захищають від ембріональної трансмісії вірусу (Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract.11:615-625 (1995)). У овець, повідомлялося про субодиничну вакцину на основі очищеного протеїну Е2 (Bruschke, et al., Vaccine15:1940-1945 (1997)). Хоча ці вакцини захищають ембріони від інфікування, захист лімітований лише гомогологічним штамом вірусу, та кореляція між титрами антитіл та захистом відсутня. Модифіковані живі вірусні (MLV) BVDV вакцини одержували із застосуванням вірусу, що був атенуйований повторним щепленням бичачих чи свинячих клітин (Coggins, et al., Cornell Vet. 51:539 (1961); and Phillips, et al., Am. J. Vet.Res.36:135 (1975)), або хімічно-спричиняємими мутаціями, що надають вірусу температурно-чутливий фенотип (Lobmann, et al., Am. J. Vet. Res. 45:2498 (1984); та Lobmann, et al., Am. J. Vet. Res. 47:557-561 (1986)). Було доведено, що однократна доза MLV BVDV вакцини надає захист від інфекції, а тривалість імунізації у вакцинованої худоби може становити роки (Coria, et al., Can. J. Con. Med. 42:239 (1978)). Крім того, повідомлялося про перехресний захист із використанням MLV вакцин (Martin, et al., у "Proceedings of the Conference of Research Workers in Animal Diseases", 75:183 (1994)). Міркування безпеки, проте, включаючи ембріональну трансмісію штаму вакцини, - є основними, що розглядають при використанні таких модифікованих живих вірусних вакцин (Bolin, Vet Clin. NorthAm. Food Anim. Pract.11:615-625 (1995)). Виходячи з вищенаведеного, очевидно, що існує потреба у нових та більш ефективних вакцинах для контролю розповсюдження BVDV. Така вакцина може бути безцінною у майбутніх державних чи регіональних програмах викорінювання BVDV, та може також бути у комбінаціях з іншими міченими вакцинами для великої рогатої худоби, являючи собою значний шаг уперед у тваринництві. Однією з таких вакцин є "мічена" вакцина. Така вакцина не має імунної детермінанти, що присутня у вірусу дикого типу. Тварини, інфіковані вірусом 95619 8 дикого типу, мають імунний відклик на "мічену" імуногенну детермінантну, тоді як неінфіковані вакциновані тварини не мають такого відклику, що є результатом відсутності детермінанти у міченій вакцині. Шляхом використання імунологічного аналізу на наявність міченої детермінанти, інфіковані тварини можуть бути відрізнені від вакцинованих неінфікованих тварин. Шляхом відбору інфікованих тварин, стада можуть, з часом, ставати вільними від BVD. Додатково до переваг від усунення загрози BVD захворювання, підтвердження відсутності BVD у стаді робить безпосередній сприятливий внесок у торгівельно-економічну ситуацію. Даний винахід стосується вірусу бичачої вірусної діареї, що містить, щонайменше, одну амінокислотну мутацію геліказного домену, де мутація у NS3 домені призводить до втрати розпізнавання моноклональним антитілом до NS3 дикого типу, але де зберігається вірусна РНК реплікація та генерування інфекційного вірусу. Даний винахід також стосується нової міченої вакцини вірусу бичачої вірусної діареї, що містить вірус бичачої вірусної діареї, який має, щонайменше, одну амінокислотну мутацію геліказного домену, де NS3 не розпізнається стандартним моноклональним антитілом до NS3, таким як, наприклад, 20.10.6;1.11.3;21.5.8; та 24.8, але де зберігається вірусна РНК реплікація та генерування інфекційного вірусу. Даний винахід також стосується аналізу для визначення того, чи була тварина вакцинована, невакцинована чи інфікована BVDV. В одному втіленні даного винаходу, забезпечується вірус бичачої вірусної діареї що містить, щонайменше, одну амінокислотну мутацію геліказного домену, де мутація у геліказному домені NS3 призводить до втрати розпізнавання моноклональним антитілом до NS3 вірусу бичачої вірусної діареї дикого типу, але де зберігається вірусна РНК реплікація та генерування інфекційного вірусу. В іншому втіленні винаходу, забезпечується вірус бичачої вірусної діареї, що містить, щонайменше, одну амінокислотну мутацію геліказного домену, де NS3 не розпізнається моноклональним антитілом до NS3, та де NS3 антитіло вибирають з групи, що складається з 20.10.6;1.11.3;21.5.8; та 24.8, але де зберігається вірусна РНК реплікація та генерування інфекційного вірусу. В іншому втіленні винаходу, вірусна вакцина містить одну амінокислотну мутацію геліказного домену. В іншому втіленні винаходу, вірусна вакцина містить мутацію геліказного домену у петлі IGR. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку 1841. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку 1843. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить мутацію геліказного домену у петлі IGR на амінокислотному залишку 1845. 9 В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить мутацію геліказного домену у петлі КНР. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку 1867. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку 1868. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить мутацію геліказного домену у петлі КНР на амінокислотному залишку 1869. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить мутацію геліказного домену у петлі SES. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить мутацію геліказного домену у петлі SES на амінокислотному залишку 1939. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить мутацію геліказного домену у петлі SES на амінокислотному залишку 1942. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить дві, три або чотири амінокислотні мутації геліказного домену. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить дві мутації геліказного домену. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить дві мутації геліказного домену у петлі IGR. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить дві мутації геліказного домену у петлі IGR на амінокислотних залишках 1843 and 1845. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить дві мутації геліказного домену у петлі SES. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить дві мутації геліказного домену у петлі SES на амінокислотних залишках 1939 and 1942. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить три мутації геліказного домену. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить три мутації геліказного домену у петлі IGR. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить три мутації геліказного домену у петлі IGR на амінокислотних залишках 1867, 1868, and 1869. В іншому втіленні винаходу, вірус бичачої вірусної діареї містить три мутації геліказного домену у IGR та SES петлях ρ на амінокислотних залишках 1845, 1868, та 1939. В одному особливо переважному втіленні даного винаходу, забезпечується мічена вакцина вірусу бичачої вірусної діареї, що містить вірус бичачої вірусної діареї, який містить, щонайменше, одну амінокислотну мутацію геліказного домену, де мутація геліказного домену NS3 призводить до втрати розпізнавання моноклональним антитілом до NS3 вірусу бичачої вірусної діареї дикого типу, але де зберігається вірусна РНК реплікація та генерування інфекційного вірусу. 95619 10 В іншому втіленні винаходу, забезпечується спосіб диференціації тварини, інфікованої вірусом бичачої діареї, від тварини, від тварини, вакцинованої вакциною вірусом бичачої діареї. У цьому втіленні, вакцина вірусу бичачої діареї є міченою вакцино, що містить, щонайменше, одну амінокислотну мутацію геліказного домену, а спосіб включає: одержання тестової пробі від тестової тварини; детекцію вірусу бичачої діареї у тестовій пробі; та визначення того, чи містить вірус бичачої діареї мутацію. В іншому втіленні винаходу, у способі детекції вірусу бичачої діареї задіють, щонайменше, одне моноклональне антитіло. Переважний спосіб включає мічену вакцину амінокислотної мутації геліказного домену у геліказному домені NS3. Наприклад, втілення цього дифереційовного аналізу може включати стадії: додавання міченого антитіла, здатного до детекції вірусу бичачої діареї дикого типу, або здатного до детекції мутованого вірусу бичачої діареї, до тестової проби, де тестова пробі містить рідину тіла тестової тварини, та; вимірювання зв'язуючої активності міченого антитіла до вірусу бичачої діареї дикого типу або до мутованого вірусу бичачої діареї шляхом контактування, щонайменше, одного моноклонального антитіла до вірусу бичачої діареї дикого типу або мутованого вірусу бичачої діареї; та визначення статусу вакцинації тестової тварини шляхом порівняння результатів визначення афінності зв'язування з використанням моноклонального антитіла, направленого на BVDV дикого типу, та результатів визначення афінності зв'язування з використанням моноклонального антитіла направленого на BVDV з мутованим NS3. Переважний спосіб включає додавання міченого першого антитіла, направленого на домен, інший ніж мутований NS3; та додавання міченого другого антитіла, направленого на мутовану частину NS3. В одному втіленні даного способу, перше антитіло направлено на вірус дикого типу. В іншому втіленні даного способу, друге антитіло направлено на мутовану частину NS3. В іншому втіленні даного способу, друге антитіло направлено на NS3, та його вибирають з групи, що складається з 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8; та 24.8. В іншому втіленні даного способу, друге антитіло, що направлено на, щонайменше, одну мутовану частину NS3, вибирають з групи, що складається з петлі IGR, петлі КНР, та петлі SES. В іншому втіленні даного способу, вірус бичачої вірусної діареї, що містить щонайменше, одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі IGR при амінокислотному залишку, вибирають з групи, що складається з 1841, 1843, та 1845. В іншому втіленні даного способу, вірус бичачої вірусної діареї, що містить, щонайменше, одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі 11 КНР при амінокислотному залишку, вибирають з групи, що складається з 1867, 1868, та 1869. В іншому втіленні даного способу, вірус бичачої вірусної діареї, що містить, щонайменше, одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі SES при амінокислотному залишку, вибирають з групи, що складається з 1939, та 1942. В іншому втіленні даного способу, вірус бичачої вірусної діареї містить, щонайменше, одну амінокислотну мутацію геліказного домену у петлі IGR та у петлі SES на амінокислотних залишках 1845, 1868, та 1939. Стислий опис креслень Ці та інші характеристики, аспекти та переваги даного винаходу проілюстровано шляхом посилання на опис, наведений нижче, та формулу та креслення, що додаються, де На Фіг. 1 наведено домени NS3. На Фіг. 2 наведено вирівнювання послідовностей геліказних доменів BVDV та HCV. На Фіг. 3 надано ілюстрацію молекулярної моделі BVDV гелікази На Фіг. 4 наведено положення сканованих мутантів На Фіг. 5 наведено область домену повного повнорозмірного прекурсору BVDV та структуру субвірусного реплікону BVDV. SEQ ID NO.1 є пептидною повнорозмірною послідовністю, непроцесованим поліпротеїном вірусу бичачої діареї. Нумерація залишків у цій послідовності відповідає мутаціям, описаним у цій заявці, наприклад, мутація, описана як "K1845А", означає що лізіновий залишок, який знаходиться у положенні 1845SEQ ID NO.1, був заміщений на аланіновий залишок; SEQ ID NO.2 є послідовністю плазмідного фрагменту ДНК, що фланкує 5'-кінець сайту клонування p15aDI для генерування ілюстративних мутантів; SEQ ID NO. 3 є послідовністю плазмідного фрагменту ДНК, що фланкує 3'-кінець сайту клонування p15aDI для генерування ілюстративних мутантів; SEQ ID NO.4 є послідовністю 5' праймеру ДНК для введення мутації І1841А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.5 є послідовністю 3' праймеру ДНК для введення мутації l1841 А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.6 є послідовністю 5' праймеру ДНК для введення мутації І1843А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.7 є послідовністю 3' праймеру ДНК для введення мутації І1843А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.8 є послідовністю 5' праймеру ДНК для введення мутації І1845А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.9 є послідовністю 3' праймеру ДНК для введення мутації І1845А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.10 є послідовністю 5' праймеру ДНК для введення мутації K1867А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.11 є послідовністю 3' праймеру ДНК для введення мутації K1867А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.12 є послідовністю 5' праймеру ДНК для введення мутації Н1868А, описаної у цій заявці; 95619 12 SEQ ID NO.13 є послідовністю 3' праймеру ДНК для введення мутації Н1868А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.14 є послідовністю 5' праймеру ДНК для введення мутації Р1869А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.15 є послідовністю 3' праймеру ДНК для введення мутації Р1869А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.16 є послідовністю 5' праймеру ДНК для введення мутації Е1939А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.17 є послідовністю 3' праймеру ДНК для введення мутації Е1939А, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.18 є послідовністю 5' праймеру ДНК для введення мутації R1942A, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.19 є послідовністю 3' праймеру ДНК для введення мутації R1942A, описаної у цій заявці; SEQ ID NO.20 є пептидною послідовністю доменів 1 (гелікази) та 2 (NTPase) NS3 області трансльованого BVDV; та SEQ ID NO.21 є пептидною послідовністю доменів 1 (гелікази) та 2 (NTPase) NS3 області трансльованого вірусу гепатиту С (HCV). Визначення До термінів, що вживаються в описі втілень даного винаходу, можуть бути застосовні наступні визначення, що замінятимуть будь-які суперечливі визначення, що містяться у кожному окремому посиланні, включеному до цієї заявки шляхом посилання. Якщо у цій заявці не визначено інше, то науково-технічні терміни, що вживаються у зв'язку із даним винаходом, матимуть значення, що, як правило, зрозумілі фахівцям у цій галузі. Крім того, якщо інше не випливає з контексту, однина має включати множину, та навпаки, множина має включати однину. Термін "амінокислота", як вживається у цій заявці, відноситься до природних чи синтетичних амінокислот, а також до аналогів амінокислот та міметиків амінокислот, функція яких подібна функції природних амінокислот. Природними амінокислотами є такі, що кодуються генетичним кодом, а також такі амінокислоти, що пізніше модифікують, наприклад, гідроксипролін, карбоксиглютамат, та О-фосфосерін. Стереоізомери (наприклад, Dамінокислоти) двадцяти незамінних амінокислот, неприродних амінокислот, таких, як α та α.дизаміщені амінокислоти, N-алкіл амінокислоти, молочна кислота та інші замінні амінокислоти можуть також бути придатними компонентами поліпептидів за даним винаходом. Приклада замінних амінокислот включають: 4-гідроксипролін, крабоксиглютамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллізін, ε-Νацетиллізін, О-фосфосерін, N-ацетилсерін, Nформілметіонін, 3-метилгистідин, 5-гідроксилізін, σ-Ν-метиларгінін, та інші подібні іміно-та амінокислоти. Аналоги амінокислот відносяться до сполук, що мають таку ж основну хімічну структуру, що й природні амінокислоти, тобто, вуглець пов'язаний з воднем, карбоксильною групкою, аміногрупою та R-групою. Ілюстративні аналоги аміноки 13 95619 слот включають, наприклад, гомосерін, норлейцин, метіонін сульфоксид, та метіонін метил сульфоній. Такі аналоги мають модифіковані R-групи (наприклад, норлейцин), або модифіковані пептидні каркаси, проте зберігають таку ж саму основну хімічну структуру, що й природні амінокислоти. Амінокислотні міметики відносяться до хімічних сполук, що мають структуру, яка відрізняється від Амінокислоти-однолітерні коди: G: V: L: А: 1: S: D: К: R: Н: F: Y: Т: С: М: Е: W: Р: N: Q: X: загальної хімічної структури амінокислот, але що функціонують аналогічно природним амінокислотам. У цій заявці амінокислоти також можуть бути наведені або під загальновідомим трилітерним кодом, або під однолітерним кодом, рекомендованим Комісією IUPAC-IUB з біохімічної номенклатури. Трилітерні коди: Gly: Val: Leu: Ala: lle: Ser: Asp: Lys: Arg: His: Phe: Tyr: Thr: Cys: Met: Glu: Trp: Pro: Asn: Gin: Xaa Термін "тваринний об'єкт", як вживається у цій заявці, призначено для включення будь-якої тварини, чутливої до інфекції BVDV, такої, як бик, свиня чи вівця. Під термінами "лікування" чи "вакцинація" мають на увазі профілактику чи зниження ризику інфікування вірулентним штамом BVDV, покращення симптомів інфекції BVDV, або прискорення видужування після інфікування BVDV. BVD "віруси", "вірусні ізоляти" або "вірусні штами", як вживається у цій заявці, відносяться до вірусів BVD, що складаються з вірусного геному, зв'язаних протеїнів та інших хімічних складових (таких, як ліпіди). Зазвичай, вірус BVD має геном у вигляді РНК. РНК може бути зворотно транскрибована у ДНК для використання у клонуванні. Таким чином, посилання, наведені у цій заявці на нуклеїновокислотні та BVD вірусні послідовності охоплюють як вірусні РНК послідовності, так і ДНК послідовності, одержані з вірусних РНК послідовностей. Для зручності, геномні послідовності BVD, як вказано у Переліку послідовностей, наведеному у цій заявці нижче, відносяться до поліпептидної послідовності, та праймерних ДНК послідовностей, що були використані для одержання ілюстративних мутацій. Відповідна РНК послідовність для кожної є легко зрозумілою для фахівців у цій галузі. Ряд вирусів типу І та типу II BVD відомий фахівцям у цій галузі та доступний, наприклад, у Американській колекції типових культур (American Type Culture Collection). 14 Повні назви гліцин валін лейцин аланін ізолейцин серін аспарагінова кислота лізін аргінін гистідин фенілаланін тирозин треонін цистеїн метіонін глутамінова кислота триптофан пролін аспарагін глутамін невизначена амінокислота Термін "консервативні амінокислотні заміщення", як вживається у цій заявці, відноситься до заміщень, що відбуваються у сімействі амінокислот, та відносяться до їх бічних ланцюгів. Зокрема, як вживається у цій заявці, консервативне амінокислотне заміщення - заміщення, що не впливає на розпізнавання антитілом даного пептиду порівняно із одержаним пептидом дикого типу. Генетично кодовані амінокислоти, загалом, поділяють на чотири групи: (1) кислотна=аспартат, глутамат; (2) основна=лізін, аргінін, гистідин; (3) неполярна=аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан; та (4) незаряджена полярна=гліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серін, треонін, тирозин. Фенілаланін, триптофан та тирозин також разом класифікують як ароматичні амінокислоти. Відповідно, термін "неконсервативні амінокислотні заміщення", як вживається у цій заявці, відноситься до заміщень, що, ймовірно, мають різні характеристики, особливо щодо розпізнавання антитіл. Таким чином, неконсервативне амінокислотні заміщення викликатиме характерний імунний відклик, такий, як, наприклад, втрату розпізнавання антитілом до одержаного пептиду дикого типу. Термін "імуногенний", як вживається у цій заявці, означає здатність мутованого вірусу BVD дикого типу викликати імунний відклик у тварини на віруси як типу І, або типу II BVD, або на віруси як типу І та типу II BVD. Імунний відклик може бути клітинним імунним відкликом, опосередкованим, головним чином, цитотоксичними Т-клітинами, або 15 гуморальним імунним відкликом, опосередкованим, головним чином, хелперними Т-клітинами, що, у свою чергу, активує В-клітини, призводячи до продукування антитіл. Як вживається у цій заявці, термін "депротеїнізована ДНК" відноситься до плазміду, що містить нуклеотидні послідовності, що кодують агент за даним винаходом разом із коротким праймерним регіоном, для контролювання його продукування. Вона має назву "депротеїнізована" ДНК через те, що плазміди не переносяться будь-якою системою доставки. Коли такий ДНК плазмід входить у клітину-хазяїн, таку, як еукаріотна клітина, протеїни, що його кодують, транскрибуються та транслюються у клітині. Термін "плазмід", як вживається у цій заявці, відноситься до будь-якої нуклеїнової кислоти, що кодує експресовний ген та містить лінійні чи кільцеві амінокислоти та подвійно- або одноланцюгові нуклеїнові кислоти. Нуклеїновою кислотою може бути ДНК та РНК та вона може містити модифіковані нуклеотиди чи рібонулкеотиди, та може бути хімічно модифікована такими способами, як метилування або введення захисних груп або головних- чи хвостових структур. Термін "вакцина", як вживається у цій заявці, відноситься до композиції, що попереджає або зменшує ризик інфікування або що покращує симптоми інфекції. Захисний ефект складу вакцини проти патогену, зазвичай, досягається шляхом викликання у об'єкту імунного відклику, клітинноопосередкованого або гуморального імунного відклику, або її комбінації. Загально кажучи, знищена або зменшена кількість випадків інфікування BVDV, покращення симптомів, або збільшення ступеню видалення вірусів з інфікованих об'єктів є показниками захисного впливу складу вакцини. Склади вакцини за даним винаходом забезпечують захисний ефект від інфекцій, спричинених вірусами BVD. Термін "вектор", як вживається у цій заявці, означає засіб, що дозволяє або сприяє переносу нуклеїнові кислоти з одного середовища до іншого. Відповідно до даного винаходу та як приклад, деякі вектори, що використовують у рекомбінантних ДНК методиках, дозволяють нуклеїновим кислотам, таким, як сегмент ДНК (таким, як гетерологічний сегмент ДНК, наприклад, гетерологічний сегмент кДНК), бути перенесеними у клітинухазяїн чи клітину-мішень для реплікації нуклеїнових кислот та/або експресуючих протеїнів, що кодуються нуклеїновими кислотами. Приклади векторів, що застосовують у рекомбінантних ДНК методиках, включають, не обмежуючись наведеним, плазміди, хромосоми, штучні хромосоми та віруси. Наступний детальний опис забезпечується для того, щоб допомогти фахівцям у цій галузі, реалізувати даний винахід. Навіть у такому разі, цей детальний опис не має трактуватися як такий, що неналежним чином обмежує даний винахід, оскільки модифікації та варіації втілень, що обговорюються у цій заявці, можуть бути здійснені фахівцями у цій галузі, не виходячи за межі обсягу даного винаходу. 95619 16 Зміст кожного з посилань, процитованих у цій заявці, включаючи зміст посилань, процитованих у цих первісних посиланнях, включені до цієї заявки шляхом посилання. Для культивування та очищення плазміду, корисного у даному винаході, можуть бути використані стандартні процедури. Переважними прокаріотними клітинами-хазяєвами для культивування плазміду є клітинна лінія Е. coli GM2163, проте також можуть бути використані інші клітинні типи. РНК, транскрибована з плазміду, може бути введена шляхом трансфекції в еукаріотні клітинихазяєва, здатні підтримувати продукування вірусів, такі, як MDBK клітини. Вірус може бути продукований у таких клітинах-хазяєвах та відділений від них у високо-очищені формі, з використанням відомих методик відділення, таких, як центрифугування в градієнті концентрації сахарози. В одному втіленні, даний винахід забезпечує імуногенні композиції, в які включені один чи більше мутантних вірусів BVD, описаних у цій заявці. Інше втілення даного винаходу стосується ізольованих геномних нуклеїнових молекул мутантних вірусів BVD, як описано вище. Молекули нуклеїнових кислот, як вживається у цій заявці, охоплюють як РНК, так і ДНК. У цьому втіленні, ізольована геномна нуклеїнова молекула вірусу BVD містить геномну послідовність вірусу типу І, де, щонайменше, частина домену NS3 є мутованою у геліказному домені. В іншому втіленні, даний винахід забезпечує вектори, в які включена геномна нуклеїновокислотна послідовність вірусу BVD, як описано у цій заявці вище, такі вектори можуть бути введені у відповідні клітини-хазяєва, або для продукування великої кількості геномних молекул нуклеїнових кислот, або для продукування потомства мутантних вірусів BVD. Вектори можуть містить інші елементи послідовності для сприяння продукуванню, виділення та субклонування векторів; наприклад, селектовних маркерних генів та джерел реплікації, що дозволяють культивування та селекцію бактерій та клітин-хазяєв. Особливо переважним вектором за даним винаходом є p15aDI (див. Фіг. 5). Ще одне втілення даного винаходу стосується клітин-хазяєв, в яку включена геномна молекула нуклеїнової кислоти мутованого вірусу BVD за даним винаходом. "Клітини-хазяєва", як вживається у цій заявці, включають будь-які прокаріотні клітини, трансформовані у геномну молекулу нуклеїнової кислоти, що переважно забезпечується відповідним вектором, мутованого вірусу BVD. "Клітинихазяєв", як вживається у цій заявці, також включають будь-які еукаріотні клітини, інфіковані мутованим вірусом BVD, або такі, що іншим чином містять геномну молекулу нуклеїнової кислоти мутованого вірусу BDV. Переважною прокаріотною клітиною-хазяїном для культивування плазміду є клітинна лінія Е. coli GM2163, проте також можуть бути використані інші клітинні типи. Переважні еукаріотні клітини-хазяєва включають клітини ссавців, такі, як клітини MDBK (АТСС CCL22). Проте, також можуть бути використані інші культивовані клітини. Винахід також додатково включає вірус 17 нащадок, що продукується такими клітинамихазяєвами. В іншому втіленні винаходу, віруси можуть бути атенуйовані шляхом хімічної інактивації або серійних пасажей у клітинну культуру перед використанням в імуногенній композиції. Способи атенуації добре відомі фахівцям у цій галузі. Імуногенні композиції за даним винаходом можуть також включати додатковий активний інгредієнт, такий, як інші імуногенні композиції проти BVDV, наприклад, описані у патентній заявці США №. 08/107,908, що розглядається на даний час, патенті США № 6,060,457, патенті США № 6,015,795, патенті США № 6,001,613, та патенті США № 5,593,873, усі з яких повністю включені до цієї заявки шляхом посилання. Крім того, імуногенні композиції за даним винаходом можуть включати один чи більше ветеринарно-придатних носіїв. Як вживається у цій заявці, "ветеринарно-придатний носій" включає будьякі та усі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, допоміжні речовини, стабілізатори, розріджувачі, консерванти, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, агенти, що уповільнюють поглинання, та інш. Розріджувачі можуть включати воду, сольовий розчин, декстрозу, етанол, гліцерин, та інш. Ізотонічні агенти можуть включати хлорид натрію, декстрозу, маннітол, сорбітол, та лактозу, серед іншого. Стабілізатори включають альбумін, серед іншого. Допоміжні речовини включають, не обмежуючись наведеним, ад'ювантну систему RIBI (Ribi inc.), галун, гель гідроксиду алюмінію, емульсії типу "олія у воді", емульсії типу "вода в олії" такі, як, наприклад, повні та неповні ад'юванти Фройнда, блок кополімери (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), ад'ювант AMPHIGEN®, сапонін, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), або інші сапонінові фракції, монофосфорильний ліпід А, аврідін ліпід-амінний ад'ювант, теплолабільний ентеротоксин з Е. соїі (рекомбінантний чи інший), токсин холери, або мірамільний дипептид, серед багатьох інших. Імунологічні композиції можуть додатково включати один чи більше імуностимулюючих агентів, таких, як, наприклад, інтерлейкіни, інтерферони та велика кількість цитокінів. Імуногенні композиції за даним винаходом можуть бути одержані у різних формах, в залежності від маршруту введення. Наприклад, імуногенні композиції можуть бути одержані у вигляді стерильних водних розчинів чи дисперсій, придатних для введення шляхом ін'єкцій, або одержаних у ліофілізованій формі з використанням ліофілізаційних методик. Ліофілізаційні імуногенні композиції, типово, зберігають при, приблизно 4° С, та вони можуть бути відновлені у стабілізаційному розчині, наприклад, сольовому розчині або HEPES, з допоміжними речовинами чи без них. Імуногенні композиції за даним винаходом можуть бути введені тваринним об'єктам для індукування імунного виклику проти вірусів BVD. Відповідно, інше втілення даного винаходу забезпечує способи стимулювання імунного відклику проти вірусів BVD, шляхом введення тваринному об'єкту 95619 18 ефективної кількості імуногенної композиції за даним винаходом, описаної вище. Відповідно за способами за даним винаходом, переважна імуногенна композиція для введення тваринним об'єктам містить мутований вірус BVD. Імуногенну композицію, що містить мутований вірус, переважно атенуйований шляхом клінічної інактивації або серійного пасажу у культурі, вводять худобі, переважно шляхом парентеральних маршрутів, хоча також можуть бути використані інші маршрути введення, такі, як, наприклад, оральне, інтраназальне, внутрішньомязове, у лімфатичну рідину, інтрадермальне, інтраперітонеальне, підшкірне, ректальне або вагінальне введення, або комбінацією маршрутів. Протоколи імунізації можуть бути оптимізовані за допомогою процедур, добре відомих з рівня техніки. Однократна доза може бути введена тваринам, або, альтернативно, можуть бути здійснені два чи більше щеплень з інтервалом від двох до десяти тижнів. Ступінь та природу імунних відкликів, що викликаються у великої рогатої худоби, можна оцінити шляхом використання різноманітних методик. Наприклад, від прищеплених тварин можна зібрати сироватки та проаналізувати у приступності антитіл, специфічних до вірусів BVD, наприклад, у традиційному аналізі нейтралізації вірусу. Детекція CTLs, що відреагували у лімфоїдних тканинах, може бути досягнута за допомогою таких аналізів, як Τ клітинна проліферація, як свідчення індукції клітинного мембранного відклику. Релевантні методики добре описані у рівні техніки, наприклад, у Coligan et al.Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons Inc. (1994). Інше втілення даного винаходу стосується складів вакцин. В одному втіленні, склади вакцин за даним винаходом містять ефективну кількість одного чи більше описаних вище мутованих вірусів BVD. Очищені мутовані віруси можна використовувати безпосередньо у складі вакцини, або мутовані віруси можуть бути додатково атенуйовані шляхом хімічної інактивації чи серійних пасажей in vitro. 6 Типово, вакцина містить, від, приблизно, 1×10 до, 8 приблизно, 1×10 частинок вірусів, з ветеринарно придатним носієм, в об'ємі від 0,5 до 5 мл. Точна кількість вірусу у складі вакцини, ефективну для забезпечення захисного ефекту, може бути визначена спеціалістом-ветеринаром. Ветеринарні придатним носії, придатні для використання у складах вакцин, можуть бути будь-якими носіями з числа тих, що описані у цій заявці вище. В іншому втіленні, склади вакцин за даним винаходом містять молекулу нуклеїнової кислоти мутованого вірусу. ДНК чи РНК молекули, що кодують весь або частину BVD вірусного геному, можуть бути використані у вакцинах. Τ-ДНК чи РНК молекула може бути присутня у "депротеїнізованій" формі або введена разом із агентом, що полегшує клітинне поглинання (наприклад, ліпосомами чи катіонними ліпідами). Типовим маршрутом введення буде внутрішньомязова ін'єкція від, приблизно, 0,1 до, приблизно, 5 мл вакцини. Загальна кількість полінуклеотиду у вакцині має, загалом, становити від, приблизно, 0,1 мкг/мл до, приблиз 19 но, 5,0 мг/мл. Полінуклеотиди можуть бути наявні як частина суспензії, розчину або емульсії, проте, зазвичай, переважними є носії на водній основі. Вакцини та процедури вакцинації, де використовують нуклеїнові кислоти (ДНК чи іРНК) були описані у рівні техніки, наприклад, у патенті США № 5,703,055, патенті США № 5,580,859, патенті США № 5,589,466, усі з яких включені до даної заявки шляхом посилання. Склади вакцин за даним винаходом можуть також містити додатковий активний інгредієнт, такий як інші склади вакцин проти BVDV, наприклад, такі, що описані у патенті США № 6,060,457, патенті США № 6,015,795, патенті США № 6,001,613, та патенті США № 5,593,873. Вакцинація може бути проведена шляхом одинарного щеплення або шляхом множинного щеплення. За бажанням, сироватки можуть бути зібрані з прищеплених тварин та проаналізовані на наявність антитіл до вірусу BVD. В іншому втіленні винаходу, вищезазначені склади вакцин за даним винаходом використовують при лікуванні інфекцій BVDV. Відповідно, даний винахід забезпечує способи лікування інфекцій у тваринних об'єктів, що були спричинені вірусами BDV, шляхом введення тварині терапевтично ефективної кількості мутованого вірусу BVD за даним винаходом. Фахівці у цій галузі можуть легко визначити, чи потребують віруси, створені методами генетичної інженерії, атенуації перед введенням. Мутований вірус за даним винаходом може бути введений безпосередньо тваринному об'єкту без додаткової атенуації. Кількість вірусу, що є терапевтично ефективною, може відрізнятися в залежності від конкретного вірусу, що використовують, стану худоби та/або ступеню інфікування, та може бути визначений ветеринаром. При здійсненні цих способів, склад вакцин за даним винаходом вводять великій рогатій худобі, переважно, парентерально, хоча також можуть бути використані інші маршрути введення, такі, як, наприклад, такі, як, наприклад, оральне, інтраназальне, внутрішньомязове, у лімфатичну рідину, інтрадермальне, інтраперітонеальне, підшкірне, ректальне або вагінальне введення, або комбінацією маршрутів. Можуть потребуватись режими буст-інєкцій, та бути визначені режими дозувань можуть для забезпечення оптимальної імунізації. Додатковий аспект даного винаходу забезпечує способи визначення атенуйованого вірусу попередньої вакцинації як джерела вірусу BVD, присутнього у тваринного суб'єкту. Мутантні віруси BVD за даним винаходом відрізняють від штамів BVD дикого типу як у геномній композиції, так і експресованих протеїнах. Таке відрізнення дозволяє диференціювати вакцинованих та інфікованих тварин, та ідентифікувати BVDV у випадку передбачених пов'язаних з вакцинацією спалахів. Наприклад, може бути визначено, чи має тварини з позитивною пробою на BVDV, за результатами деяких лабораторних тестів, вірулентний чи патогенний вірус BVD, або просто має мутантний вірус BVD за даним винаходом, що був попередньо прищеплений шляхом вакцинації. 95619 20 Для такого визначення можуть бути використані різноманітні аналізи. Наприклад, віруси можуть бути ізольовані від тваринного об'єкту з позитивною пробою на BVDV, та для визначення наявності мутантного вірусного геному BVD можуть бути використані аналізи на основі нуклеїнових кислот, як свідчення наявності вірусу BVD у попередній вакцинації. Аналізи на основі нуклеїнових кислот включають Саузерн або Нозерн блоттінг аналізи, ПЦР, та секвенування. Альтернативно, можуть бути застосовані аналізи на основі протеїнів. В аналізах на основі протеїнів, клітини чи тканини з підозрою на інфікування, можуть бути ізольовані від тваринного об'єкту з позитивною пробою на BVDV. З таких клітин чи тканин можуть бути зроблені клітинні екстракти та піддані, наприклад, Вестерн блоттінг аналізу, з використанням відповідних антитіл до вірусних протеїнів, що можуть чітко ідентифікувати наявність мутантного вірусу, що був попередньо прищеплений, у протилежність наявності вірусу BVDV дикого типу. Форми та введення Парентеральне введення Сполуки за даним винаходом можуть бути також введені безпосередньо у кровообіг, м'язи або у внутрішні органи. Придатні маршрути для парентерального введення включають внутрішньовенне, інтрааретріальне, інтраперітонеальне, інтратекальне, інтравентрикулярне, інтрауретральне, внутрішньочеревне,інтракраніальне, внтрішньомязове та підшкріне введення. Придатні засоби для паретнерального введення включають інжектори з голкою (включаючи мікроголку), інжектори без голки та методи вливання (інфузії). Паретнеральні композиції є, типово, водними розчинами, що можуть містити такі наповнювачі, як солі, вуглеводні та буферні агенти (переважно, зі значеннями рН від 3 до 9), проте, для деяких застосувань, вони можуть бути придатним чином складені як стерильні неводні розчини або сухі форми для використання у сполученні з придатним носієм, таким, як стерильна вода, що не містить пірогенів. Одержання парентеральних композицій у стерильних умовах, наприклад, шляхом ліофілізації, може бути легко здійснено із застосуванням стандартних фармацевтичних методик, добре відомих фахівцям у цій галузі. Розчинність сполук формули І, що використовують для одержання парентеральних розчинів, може бути підвищена шляхом використання відповідних способів одержання композицій, таких, як включення агентів, що підвищують розчинність. Композиції для паретнерального введення можуть бути одержані для негайного та/або модифікованого вивільнення. Композиції модифікованого вивільнення включають уповільнене, безперервне, імпульсне, контрольоване, цільове та програмоване вивільнення. Таким чином, сполуки даним винаходом можуть бути одержані як тверді, напівтверді, або тиксотропні рідини для введення як імплантовані депо із забезпеченням модифікованого вивільнення активної сполуки. Приклади таких композицій включають стенти, покриті ліка 21 ми, та мікросфери кополімеру (dl-мопочноі та гліколевої кислоти) (PGLA). Місцеве введення Сполуки за даним винаходом можуть бути введені місцево у шкіру або слизову оболонку, тобто, дермально чи трансдермально. Типові композиції для цього включають гелі, гідрогелі, лосьйони, розчини, креми, мазі, опудрюючи речовини, перев'язочні матеріали, піни, плівки, кожні пластирі, підложки, імпланти, тампони, волокна, бандажі та мікроемульсії. Також можуть бути використані ліпосоми. Типові носії включають спирт, воду, мінеральну олію, рідкий вазелін, білий вазелін, гліцерин, поліетиленгліколі та пропіленгліколь. Можуть бути включені підсилювачі проникнення див.,наприклад, Transdermal Penetration Enhancers:Applications, Limitations, and Potential J.Pharm Sci, 88 (10), 955-958,by Finnin and Morgan (October1999). Інші засоби місцевого введення включають доставку шляхом електропорації, іонтофорезу, фонофорезу, сонофорезу та ін'єкції з використанням мікроголок або ін'єкцій без голок (наприклад, Powderject™, Bioject™, та інш.). Композиції для місцевого введенні можуть бути одержані як композиції негайного та/або модифікованого вивільнення. Композиції модифікованого вивільнення включають уповільнене, безперервне, імпульсне, контрольоване, цільове та програмоване вивільнення. ВВЕДЕННЯ ШЛЯХОМ ІНГАЛЯЦІЙ/ІНТРАНАЗАЛЬНЕ ВВЕДЕННЯ Сполуки за даним винаходом можуть також бути введені інтраназально або шляхом інгаляцій, типово у формі сухого порошку (самого по собі, як суміші, наприклад, сухої суміші з лактозою, або як частинки змішаних компонентів, наприклад, у суміші з фосфоліпідами, такими, як фосфатидилхолін) з інгалятору сухого порошку або аерозолю, що розпилюють, з герметизованого контейнеру, насосу, спрею, розпилювачу (переважно, розпилювачу з використанням електрогідродінамики для одержання дрібнодисперсного туману), або небулайзеру, з використанням придатної стиснутої рідини, такої, як 1,1,1,2-тетрафторетан або 1,1,1,2,3,3,3гептафторпропан. Для інтраназільного використання, порошок може містити біоадгезивний агент, наприклад, хітозан або циклодекстрин. Герметизований контейнер, насос, спрей, розпилювач, або небулайзер містить розчин або суспензію сполук(и) за даним винаходом, що містить, наприклад, етанол, водний розчин етанолу, або придатний альтернативний агент для диспергування, солюбілізації, або збільшеного вивільнення активної речовини, стиснуту рідину (стиснуті рідини) як розчинник та, необов'язково, поверхнево-активну речовину, таку, як сорбітан тріолеат, олеїнова кислота чи оліголактонова кислота. Перед використанням опудрюючої речовини або складу суспензії, лікарський продукт мікронізують до розміру, придатного для доставки шляхом інгаляції (типово, менш, ніж 5 мікрон). Цього можна досягти будь-яким способом подрібнення, таким, як помел на спіральному насосі, помел у високо киплячому шарі, обробка надкритичних 95619 22 рідин з утворенням наночастинок, гомогенізації високого тиску або розпилювальна сушка. Капсули (зроблені, наприклад, з желатину чи гідроксипропілметилцелюлози), блістери та картриджі для використання в інгаляторі або інсуффляторі можуть бути одержані таким чином, щоб містити порошкоподібну суміш сполуки за даним винаходом, придатну порошкоподібну основу, таку, як лактоза або крохмаль та модифікатор, такий, як /-лейцин, манітол або стеарат магнію. Лактоза можу бути безводною або у формі моногідрату, переважним є другий варіант. Інші придатні наповнювачі включають декстрин, глюкозу, мальтозу, сорбітом, ксилітом, фруктозу, сахарозу та трегалозу. Придатна композиція у вигляді розчину для використання в розпилювачі з використанням електрогідродинамики з одержанням дрібнодисперсного туману, може містити від 1 мкг до 20 мг сполуки за даним винаходом на одну активізацію, а активізаційний об'єм може варіюватись від 1 мкл до 100 мкл. Типова композиція може містити сполуку формули І, пропіленгліколь, стерильну воду, етанол та хлорид натрію. Альтернативні розчинники, що можуть бути використані замість пропіленгліколю, включають гліцерин та поліетиленгліколь. Придатні ароматизатори, такі, як ментол чи левоментол, або підсолоджувачі, такі, як сахарин або сахарин натрій, можуть бути додані у ці композиції за даним винаходом, що призначені для введення шляхом інгаляції/інтраназального введення. Композиції для введення шляхом інгаляції/інтраназального введення можуть бути одержані як композиції негайного та/або модифікованого вивільнення, наприклад, PGLA. Композиції модифікованого вивільнення включають уповільнене, безперервне, імпульсне, контрольоване, цільове та програмоване вивільнення. У випадку інгаляторів та аерозолів, одиницю дозування визначають за допомогою кларану, що доставляє дозовану кількість. Одиниці відповідно до даного винаходу, типово, призначені для введення дози або "вдихання", що містить від 10 нг до 100 мкг сполуки формули І. Загальна денна доза, типово, знаходитиметься у діапазоні від 1 мкг до 100 мг, та може бути введена як однократна доза або, зазвичай, як окремі дози протягом дня. Ректальне/інтравагінальне введення Сполуки за даним винаходом можуть бути введені ректально чи вагінально, у вигляді супозиторіїв, маткових кілець чи клізми. Традиційною основою супозиторіїв є какао-олія, але, якщо доцільно, можуть бути застосовані інші варіанти. Композиції для ректального/вагінального введення можуть бути одержані як композиції негайного та/або модифікованого вивільнення. Композиції модифікованого вивільнення включають уповільнене, безперервне, імпульсне, контрольоване, цільове та програмоване вивільнення. Інтраокулярне введення/введення у вуха Сполуки за даним винаходом можуть також бути введені безпосередньо в око чи вухо, типово, у вигляді крапель мікронізованої суспензії або розчину в ізотонічному, рН-контрольованому, стери 23 льному сольовому розчині. Інші композиції, придатні для введення в очі або вуха включають мазі, імпланти (наприклад, гелеві тампони, що розсмоктуються, колаген), що розпадаються біологічно, та імпланти (наприклад, силікон), що не розпадаються біологічно, підложки, лінзи та системи мікрочастинок або везикулярні системи, такі, як ніозоми або ліпосоми. Полімер, такий, як перехресно зшита акрилова кислота, полівініловий спирт, гіалуронова кислот, полімер целюлози, наприклад, гідроксипропілметилцелюлоза, гідроксиетилцелюлоза, або метилцелюлоза, або гетерополісахаридний полімер, наприклад, желатин, можуть бути включені разом із консервантом, таким, як хлорид бензалконію. Такі композиції можуть також бути доставлені шляхом іонтофорезу. Композиції для ректального/вагінального введення можуть бути одержані як композиції негайного та/або модифікованого вивільнення. Композиції модифікованого вивільнення включають уповільнене, безперервне, імпульсне, контрольоване, цільове та програмоване вивільнення. Комплекти Оскільки може бути бажаним введення комбінації активних сполук, наприклад, для лікування конкретного захворювання або стану, до обсягу даного винаходу входить те, що дві чи більше фармацевтичні композиції, одна з яких, щонайменше, містить вакцину за даним винаходом, може, зазвичай, бути скомбінована у вигляді комплекту, придатного для спільного введення композицій. Тому комплект за даним винаходом містить дві чи більше окремі композиції, одна з яких, щонайменше, містить вакцину за даним винаходом, та засоби для окремого зберігання вказаних композицій, такі, як контейнер, пляшка з нанесеними діленнями або пакет з фольги з нанесеними діленнями. Прикладом такого комплекту є шприць та голка, та інш. Комплект за даним винаходом є особливо придатним для введення різних форм дозувань, наприклад, орально та парентерально, для введення окремих композицій у різні інтервали дозування, або для титрування окремих композицій одна щодо іншої. З метою надання допомоги ветеринару, комплект типово містить інструкції щодо введення. Даний винахід додатково проілюстровано, але жодним чином не обмежено, наступними прикладами. Приклади Приклад 1. Епітопне картування NS3 доменів Спосіб епітопного картування використовували для ідентифікації конкретних епітопів, що розпізнаються протеїном NS3 набором mAbs. Спосіб задіє ПЦР ампліфікацію кожного тестового фрагменту, з наступною трансляцією усіченого протеїну in vitro, та остаточний аналіз його реакційної здатності з різними mAbs. Для попередньої ідентифікації антигенних регіонів NS3, був ампліфікований набір з семі ДНК фрагментів, що являли собою регіон (Фігура 1). Кожен з фрагментів містив на своєму 5' кінці промотор Т7, перед стартовим кодоном, та стоп кодон на 3' кінці. Ці ДНК фрагменти використовували як темплати для генерації 95619 24 35 S -мічених фрагментів протеїну шляхом транскрипції/трансляції in vitro з використанням системи лізатів кролячих ретикулоцитів TnT® (Promega;Madison, WI) та радіоактивно мічених метіоніну та цистеїну. Утворені в результаті трансльовані протеїнові фрагменти включали повнорозмірний NS3 протеїн, гелі казу та протеазу, а також окремі субдомени гелікази. (Межі протеази, гелікази та субдоменів гелі кази ідентифікували, виходячи з вирівнювання послідовностей протеїнів BVDV та HCV NS3.) Набір з 12 mAbs, що розпізнають BVDV NS3, включаючи декілька з них, що застосовують у діагностичних лабораторіях для детекції інфекції BVDV у великої рогатої худоби, використовували для імнопреципітації трансльованих протеїнів. Ці моноклональні антитіла відомі з рівня техніки, та описані як "попереднього одержані" у Deregt et al., Mapping of two antiqenic domains on the NS3 protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus, Veterinary Microbiology (2005), 108(1-2), 1322. Імунопреципітації були проаналізовані за допомогою SDS-PAGE та флюорографії. Результати імунопреципітації наведені у Таблиці 1. Усі 12 mAbs та поліклональна сироватка (ПОЛІ) розпізнавали повнорозмірний NS3, та один чи більше геліказних субдоменів, тоді як жодні з них не розпізнавали протеазний фрагмент. Три mAbs (1.11.3,21.5.8, та 24.8) імунопреципітували як повно розмірну гелі казу, так і фрагмент домен 1домен 2 (d1-d2), але не фрагмент d2-d3, що свідчить про розпізнавання цими трьома антитілами домену 1 геліказного протеїну. Обидва mAbs 21.5.8 та 24.8 зв'язували фрагмент d1, проте mAb 1.11.3 не зв'язувало, що свідчить про більшу чутливість антитіла 1.11.3 до епітопної конформації, ніж будь-який з 21.5.8 та 24.8 mAbs. MAb 2.32.5 розпізнавало повно розмірну геліказу та, деякою мірою, фрагмент d1-d2, але не розпізнавало фрагмент d2-d3, що свідчить про те, що воно може також розпізнавати домен 1. Слабке зв'язування фрагменту d1-d2 може свідчити про те, що розпізнавання епітопів 2.32.5 відрізняється від розпізнавання фрагменту d1-d2 та повнорозмірної гелікази. MAbs 4.11.4 та 16.1.5 зв'язували як повнорозмірний NS3, так і геліказу, але лише слабко - фрагменти d1-d2 та d2-d3, що свідчить про їх специфічність по відношенню до епітопу у другому домені гелікази. Чотири mAbs, 5.2.1,9.10.4,12.7.3 та 15.14.6 розпізнають як повнорозмірний NS3, так і геліказу. Вони також слабко зв'язують фрагмент d2-d3, але не зв'язують фрагмент d1-d2, що свідчить про розпізнавання ними епітопів, розташованих у домені 3. Факт відсутності зв'язування ними одного d3 фрагменту свідчить про те, що належне згортання d3 може не відбуватись у відсутності інших субдоменів. MAb19.7.6 зв'язаний із NS3 та з повно розмірною геліказою, але не зв'язаний з жодним іншим фрагментом. Розпізнавання цим антитілом може потребувати наявності інтактного геліказного протеїну. MAb 20.10.6 дуже сильно зв'язаний з NS3, повнорозмірною геліказою, та обома d1-d2 та d2-d3 фрагментами. Воно також розпізнавало один d2 фрагмент, що свідчить про те, що епітоп у домені 2 розпізнається цим антитілом за відсутності впливу доменів 1 та 3. Факт 25 95619 того, що жодні з 12 mAbs зв'язували повно розмірну протеазу не був несподіваним, оскільки полі сироватка (ПОЛІ), взята від BVDV-інфікованої корови не розпізнає протеазу у наших експериментах, що є у сильному ступені свідчить про те, протеаза не є дуже антигенною. Це узгоджується як з молекулярною орієнтацією протеїнів протеази, 26 гелікази та NS4A (протезного кофактору) у HCV, у тому, що орієнтація протеази між протеїнами гелікази та NS4A залишає дуже невелику частину її поверхневої структури доступною для зв'язування антитілом. Виходячи з цих результатів, домен 1 є ілюстративною мішенню для введення мутації (мутацій), що відбуваються у міченого вірусу. Таблиця 1 Імунопреципітація NS3 субдоменів NS3 Домен 1-3 Домен 1-2 Домен 2-3 Протеаза Домен 1 Домен 2 Домен 3 Епітоп 1.11.3 2.32.5 4.11.4 5.2.1 9.10.4 12.7.3 15.14.6 16.1.5 19.7.6 21.5.8 24.8 20.10.6 POLY + ++ ++ ++ ++ + ++ + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ ++ +/+/+/++ ++ ++ ++ +/+/+/+/+/+/++ ++ ++ ++ +/+ + +/d1 d1 d2-d3 d3 d3 d3 d3 d2-d3 d1 d1 d1 d2 NS3 Приклад 2. Вирівнювання послідовностей BVDV тa HCV геліказ Для генерування міченого вірусу на основі мутації у домені 1 гелікази BVDV, бажаним є подальше очищення епітопів у цьому домені. Бажаним є делеція імунодомінантного епітопу без значної зміни функції гелікази. Для полегшення ідентифікації епітопів - кандидатів до мутації, надзвичайно корисною є молекулярна модель BVDV гелікази. Оскільки кристалічна структура HCV гелікази є відомою, вона може бути використана для моделювання як темплата. Для початку процесу генерування молекулярної моделі домену 1, вирівнювали амінокислотні послідовності домену1 геліказ BVDV та HCV. Ідентичність первинної послідовності цих геліказ становила, приблизно, 34 %. Для визначення вторинної структури геліказного домену 1 BVDV, 47 послідовностей NS3, одержаних від різних ізолятів BVDV та інших пестивірусів вирівнювали за допомогою програми Pileup програмного забезпечення Genetics Computer Group (University of Wisconsin;Madison, Wl), та штаму NADL BVDV як прототипної послідовності. З вирівняних послідовностей, був сгенерований файл множинних послідовностей (MSF), та наданий на сервер JPred (Cuff, et al., Bioinformatics, 14:892-893 (1998)) для прогнозування вторинних структур з використанням способу прогнозування PHD (Rost and Sander, J. Моl. ВіоІ. 235:13-26 (1993). Робочу станцію Silicon Graphics Indigo2Impact10000 (Silicon Graphics; Mountain View, CA) використовували в усіх дослідженнях молекулярного моделювання. Програмне забезпечення Molecular Operating Environment (МОЕ), версія 2001.01 (Chemical Computing Group, Inc.; Montreal, Quebec) та SYBYL 6.7 (Tripos Associates Inc.; St.Louis, MO) було застосовано для молекулярного моделювання та візуалізацій. Амінокислотні послідовності домену 1 та домену 2 HCV (SEQ ID NO.21) та BVDV (SEQ ID NO.20) NS3 протеїнів вирівнювали (Фігура 2), виходячи з гомології первинних послідовностей та прогнозувань вторинної структури. Потім була сгенерована попередня молекулярна модель домену 1 та 2 BVDV NS3, з використанням відповідного регіону протеїну HCV як темплати. Як показано на Фігурі 3, наявність декількох петель та витків між альфа спіралями та бета ланцюгами, включаючи α1-β2 (петля IGR), α2-β3 (КНР), β4-β5 (DMA) та α3-β7 (SES), призводить до утворення відкритої поверхні у стороні як від геліказного каталітичного центру, так і геліказно-протеазної інтерактивної поверхні. Ця область може, потенційно, бути високо-антигенним регіоном. Три петлі були ідентифіковані, петля КНР, петля IGP, та петля SES, були вибрані як мішені для вивчення мутагенезу. Приклад 3. Розташування сайтів зв'язування mAb шляхом скануючого мутагенезу Для додаткового визначення епітопів у домені 1, зв'язаних різними mAbs, використовували спосіб сканую чого мутагенезу. Стисло, короткі сегменти послідовності геліказного домену 1 BVDV (SEQ ID NO.20) заміщали відповідною послідовністю HCV (SEQ ID NO21) з використанням ПЦР-ампліфікації, з наступною рестриктазною дигестією та лігацією утворених в результаті фрагментів, генерації "скануючих мутантів", вказаних на Фігурі 4. Транскрипцію та трансляцію in vitro, а також імунопреципітацію проводили так, як описано у Прикладі 1. Стислий опис реакційної здатності різних mAbs з мутантами наведено у Таблиці 2. 27 95619 28 Таблиця 2 Реакційна здатність скануючих мутантів з mAbs mAbs 1.11.3 21.5.8 24.8 Скан 2 ++ ++ ++ Скан 3 + 20.10.6 ++++ +++ Полісироваткг СА72 негатив ний ++++ + ++++ Скан 4 ++ +/++++ + ++++ + Скан 5 Скан 6 +/ Скан 7 + +/ Скан 8 + ++ ++ Геліказний домен 1 +++++ +++++ +++++ ++ ++ ++ ++ +++++ ++ ++ ++ +++ +++++ Приклад 4. Детальний аналіз сайтів зв'язування mAb шляхом мутагенезу заміщення аланіну Для подальшого визначення епітопів у домені 1, зв'язаних різними mAbs, та для ідентифікації критичних залишків у цих регіонах для зв'язування антитіл, були сгенеровані та проаналізовані шістнадцять мутантнів заміщення однієї амінокислоти (аланіну) у трьох регіонах, I1841-R1846, K1867S1872 та S1938-I1941. Координати залишку амінокислоти відповідають SEQ ID NO.1. Таким чином, "І1841А" являє собою заміщення ізолейцину аланіном при координаті 1841, як пронумеровано у SEQ ID NO.1. Звичайно, в інших ізолятах BVDV, різні специфічні амінокислоти можуть бути наявні при конкретних координатах ілюстративної послідовності. Тому мутація при тому ж самому локусі геліказного домену варіантного вірусу BVD, або плазміну, сконструйованого для експресії варіантного вірусу BVD, призведе до еквівалентної втрати розпізнавання антитілами варіантного, немодифікованого вірусного пептиду. Мутанти заміщення були сконструйовані з використанням методики збільшення перекривання ПЦР, відомої з рівня техніки (див., наприклад, Ho et al., Gene, 77(1):51-9 (1989)). Стисло, ПЦР використовували для генерування фрагментів заміщення аланіну, кожний з яких кодує домен 1 та 2 гелікази. Кожний фрагмент кодував промоторну послідовність Т7 та трансляційний стартовий кодон на його 5' кінці, та і стоп-кодон на 3 кінці. Первісно, були проведені дві окремі реакції для генерування фрагментів, що перекриваються, які кодують 5' та 3' половини регіону заміщення. У регіоні перекривання, одинарна аланінові мутація була введена у послідовність обох фрагментів на основі мутагенних олігонуклеотидних праймерів, які використовують у ПЦР. Продукти кожного ПЦР були відділені шляхом електрофорезу на агарозному гелі, та окрема смуга правильного розміру була очищена у кожній реакції. Очищені ДНК фрагменти змішували та використовували як темплати для другого ПЦР для генерування одного фрагменту заміщення. Всю цю процедуру повторювали для генерування кожного бажаного фрагменту заміщення. Послідовність кожного з фрагментів перевіряли шляхом ДНК 35 секвентування. S -мічені фрагменти протеїну генерували з використанням цих фрагментів як темплати шляхом in vitro транскрпиції/трансляції, як описано вище. Імунопреципітацію з використанням mAbs, з наступним аналізом SDS-PAGE, застосовували з метою визначення того, чи продовжують мутовані епітопи розпізнаватися антитілами. Результати імунопреципітації для мутантів заміщення одної АА наведені у Таблиці 3. Мутанти заміщення тільки аланіну у регіоні S1938-I1941, особливо у положеннях Е1939А та R1942A, Е1939А та R1942A повністю руйнували зв'язування mAb 1.11.3, що свідчить про те, що ці два залишки є критичними для зв'язування антитіл. Той факт, що ці дві амінокислоти розташовані у тій самій петлі α3-β7 (SES) (Фігура 3), свідчить про те, що епітоп, що розпізнається цим антитілом, утворюється цією петлею. Два інших мутанти, I1841А та К1867А, розташовані у двох різних регіонах геліказної молекули (петлі α1-β2 (IGR) та α2-β3 (КНР)), проявляли значно зменшене зв'язування mAb21.5.8, але не іншими антитілами. Одним з висновків, що може бути зроблений на підставі цих результатів, буде такий, епітоп, що розпізнається цим mAb, може охоплювати різні петлі, розташовані у близькому сусідстві у природній молекулі. Це узгоджується з молекулярною моделлю, наведеною на Фігурі 3. Мутантний R1843A руйнував зв'язування mAb 24.8, проте не впливав на зв'язування інших антитіл. Крім того, це може бути свідченням того, що цей залишок є частиною ключового епітопу, розташованого у петлі α1-β2 (IGR). Частковий вплив мутанту R1942A на зв'язування mAb24.8 свідчить про те, що петля α3-β7 (SES), разом із петлею α1-β2 (IGR), складає епітоп, що розпізнається цим антитілом. Як висновок, епітопі, що розпізнаються трьома mAbs, були точно картовані у домені 1 гелікази BVDV. Ключові залишки у цих епітопах були ідентифіковані як такі, що розташовані у трьох окремих регіонах первісної послідовності, але у близькому сусідстві у третинній конформації. Функцію цих епітопів додатково вивчали у контексті субвірусного реплікону BVDV. 29 95619 30 Таблиця 3 Імунопреципітація мутантів заміщення аланіну І1841А R1843A Н1844А K1845А R1846A S1938A Е1939А S1940A І1941А R1942A K1867А Н1868А Р1869А S1870A І1871А S1872A mAb 1.11.3 + ++ ++ + ++ ++ ++ + ++ + ++ ++ ++ ++ mAb 21.5.8 + + + + + + + + + + + + + + + + Приклад 5. Конструювання мутацій геліказного домену 1 у контексті субвірусного реплікону BVDV Конструювання субвірусного реплікону Бажаною характеристикою продукування вдалої вірусної вакцини є здатність одержання високих титрів вірусу. Тому мічена мутація не повинна у значному ступеню перешкоджати реплікації вірусу. Оскільки геліказна активність є необхідною для реплікації РНК BVDV, нашою метою було оцінити усі точкові мутації домену 1, не лише на предмет втрати розпізнавання антитілами, але також на предмет зберігання каталітичної геліказної активності. Ампліфікації та генетичні маніпуляції повнорозмірного провірусного молекулярного клону BVDV у Escherichia coli (Е. соlі) утруднені через нестійкість плазміду протягом відтворення. Через це, p15aDI, що містить усічений субвірусний реплікон, який експресує NS3 та підтримує вірусну РНК реплікацію, та у якого навіть відсутні вірусні структурні гени, був створений для полегшення скринінгу мутантів. p15aDI одержували з інфекційного провірусного батьківського плазміду (pNADLp15a), що містив повнорозмірний геном BVDV. Більш змінна через відсутність більшості структурних генів та кодуючого регіону NS2, єдина послідовність, розташована над NS3, складається зі злиття частини N протеїну та бичачого убіхітину (Фігура 5). NS3 протеїн, що був експресований з цього реплікону, є детектовним засобами імуногістохімії, тільки коли ефективна РНК реплікація призводить до ампліфікації транскриптів, що призводить, у свою чергу, до підвищення вірусної протеїнової експресії. Таким чином, детекція NS3 є непрямим підтвердженням ефективної реплікації РНК та каталітичної геліказної активності. Генерування мутацій геліказного домену 1 Набір з дванадцяти різних мутантів геліказного домену 1 був генерований у контексті субвірусного реплікону, та проаналізований на предмет вірусної РНК реплікації та втрати епітопного розпізнавання. Вісім з цих мутантнів містили тільки зміну однієї mAb2 4.8 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +/++ ++ + ++ ++ ++ Полісироватка ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ амінокислоти, та включали: у петлі IGR, І>А (амінокислотний залишок 1841), R>A (1843), та К>А (1845); у петлі КНР, К>А (1867), Н>А (1868), та Р>А (1869); у петлі SES, Е>А (1939), та R>A (1942). Два мутанти мали зміни у двох амінокислотах: у петлі IGR, R>A (1843) та К>А (1845), та у петлі SES, Е>А (1939), та R>A (1942). Два мутанти містили три зміни: К>А (1867), Н>А (1868), та Р>А (1869), усі у петлі IGR, та К>А (1845), Н>А (1868), and E>A (1939), впливаючи на множинні петлі. Тоді як аланін був використаний у ілюстративних мутаціях для зручності, неконсервативні амінокислотні заміщення можуть бути використані як відповідні мутації. Кожен з мутантів був генерований з використанням стратегії перекривання ПЦР, що описана вище. Конкретний набір праймерів, що перекриваються, був розроблений для кожної бажаної мутації (Таблиця 4). З метою скринінгу, кожний набір праймерів також містив додаткові мовчазні нуклеотидні зміни, що може призвести до утворення унікального нового рестриктазного сайту розщеплення близько до сайту мутації. Фрагменти ПЦР, що перекриваються, слугували темплатами у другій частині ампліфікації, що була проведена з використанням лише двох зовнішніх праймерів. Для генерування фрагментів, що містять амінокислотні зміни, реакцію ампліфікації повторювали з використанням попереднього мутантного фрагменту як темплати. Повністю мутований фрагмент потім клонували у каркас субвірусного реплікону за допомогою двох унікальних рестриктазних сайтів (Bsm В І та Sma І), утворених протягом процесу ПЦР. Мутантний фрагмент ПЦР та каркас субвірусного реплікону дигестували Bsm В І та Sma І, обробляли лужною фосфатазою (NEB, Inc.), очищали електрофорезом на агарозному гелі, та ліговали усю ніч при 16 °C з використанням лігази Т4 ДНК (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). Клітини STBL2 Ε. coli (Invitrogen;Carlsbad, CA) трансформували з аліквотою лігованої реакції та висівали на планшети у селективному середовищі. 31 Колонії піддавали скринінгу шляхом очищення плаз мідного ДНК, з наступним дигестуванням рестриктазами. Утворення плазмідів, що мали очіку 95619 32 ваний розмір, додатково підтверджували аналізом послідовностей. 33 Приклад 6. Характеристика мутантних субвірусних репліконів Транскрипція in vitro та трансфекція РНК Транскрипти РНК синтезували in vitro з використанням Т7 РНК полімерази та MEGAscript™ (Ambion;Austin, ТХ). ДНК темплати лінеарізували за допомогою Ksp І та обробляли Т4 ДНК полімеразою для видалення 3' "липкого" кінця. Продукти реакції транскрипції аналізували методом гельагарозного електрофорезу до початку трансфекції. 1-5 мкг РНК додавали до 200 мкл Opti-MEM (Invitrogen), що містив 6 мкг ліпофектину (Invitrogen), та інкубували протягом 10-15 хвилин при кімнатній температурі. Одночасно, моношари (50-60 % конфлюент) клітин бичачих нирок Madin Darby (MDBK), що були вирощені у планшетах на шість лунок (діаметром 35 мм) двічі промивали PBS, що не містив RNase, та однократно OptiMEM. Після кінцевого промивання, трансфекційні суміші додавали до кожної лунки та інкубували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі при 95619 34 обережному перемішуванні. 1 мл Opti-MEM потім додавали до кожної лунки, та інкубували планшети ще 3 години при 37 °C. Потім три мл Opti-MEM, що містив 2-3 % бичачої донорної телячої сироватки додавали у кожну лунку. Аналіз реплікації РНК та розпізнавання антитіл Після інкубування протягом 24-48 годин при 37 °C, трансфектовані клітини фіксували 80 % ацетоном та піддавали імуногістохімічному аналізу (ІНС), з використанням набору Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories;Burlingame, CA) відповідно до інструкцій виробника. Моноклональне антитіло 20.10.6, що розпізнає геліказний домен 2, використовували для візуалізації клітин, позитивних до NS3, як індикатору ефективної РНК реплікації. Клітини, трансфектовані РНК BVDV дикого типу, а також велика кількість мутантних репліконів, проявляли стійке забарвлення mAb20.10.6, що свідчить про те, що ці окремі мутантні вірусні гелікази підтримували ефективну vPHK реплікацію. Тільки мутантний К1867А/Н1868А/Р1869А не продукував 35 95619 36 мутований протеїн NS3, що свідчить про значне перешкоджання цим набором мутацій вірусній РНК реплікації. Усі клітини, трансфектовані репліконами дикого типу чи мутантними репліконами, також аналізували mAbs 1.11.3,21.5.8, та 24.8. (Таблиця 5). Кожна петля розпізнавалася одним з цих трьох антитіл, оскільки мутації у кожній петлі призводили до втрати розпізнавання одним з трьох антитіл. Зокрема, мутації залишків R1843A та K1845А у петлі IGR, окремо та разом, призводили до повної втрати розпізнавання mAb24.8. Одночасно, на розпізнавання mAbs 20.10.6,1.11.3 та 21.5.8 це не впливало. У петлі КНР, мутація К1867А знищувала розпізнавання mAb 21.5.8, не впливаючи на розпізнавання іншими трьома антитілами. Також, обид ві точкові мутації у петлі SES призводять до втрати розпізнавання mAb 1.11.3, як це відбувалося під дією подвійного мутанту. Крім того, дія потрійного мутанту (K1845А/Н1868А/Е1939А) призводила до втрати розпізнавання як 1.11.3, такі і 24.8 mAbs, тоді як впливу на розпізнавання антитілами mAbs 20.10.6 та 21.5.8 не спостерігалося. Загалом, було ідентифіковано декілька мутацій у трьох геліказних петлях, що призвели до знищення розпізнавання та зв'язування mAb. Крім того, була знайдена ймовірність одночасного руйнування сайтів розпізнавання двох антитіл при збереженні функції гелікази. Таким чином, кожна з цих окремих мутацій, або їх комбінація, може бути корисною як мічена вакцина BVDV, що містить мутацію (мутації) у геліказному регіоні. Приклад 7. Генерування та аналіз мічених вірусів Для оцінки впливу (впливів) направлених мутацій у протеїні NS3 на вірусну реплікацію та інфективність, потребувалося перенести мутації у провірусний плазмід, що містив повно розмірну послідовність BVDV (pNADLp15A). Трьома мутованими послідовностями, вибраними для подальшого дослідження, були: K1845А-Н1868А-Е1939А, R1942A, та Е1939А. Фрагмент ДНК, що містив кожну відповідну мутовану послідовність, що розглядається, клонували у pNADLp15A, повторно використовуючи унікальні сайти рестрикції Bsm ВІ та Sma І. Суміші лігування трансформували у клітини Е. соІі GM2163 (New England Biolabs, Inc.; Beverly, MA), а потім висівали на планшети у селективному середовищі. Після інкубації протягом ночі, колонії піддавали скринінгу на наявність плазміну, що містив правильну послідовність. Був відібраний один клон, що являв собою кожну з мутацій (R1942A; Е1939А; та K-Н-Е), та з цих клонів, булла одержана вірусна РНК, як описано у Прикладі 6. Клітини MDBK трансфектували з кожним препаратом РНК, та інкубували при 37 С° протягом 64 годин. Подвійні трансфекції клітин RD (АТСС; Rockville, MD) встановлювали для кожної мутації. Один набір трансфектованих клітин фіксували для забарвлення ІНС, як описано у Прикладі 6, та з другого набору, клітини очищали від насінних колб та зберігали при -80 °C як штами для подальшого культивування. 37 95619 38 Для подальшої оцінки вірусу, що був продукований трьома клонами, культуральні рідини, зібрані у експерименті з трансфекції, пропускали у моношари свіжих клітин RD. Після поглинання та інкубації протягом ночі, клітини фіксували для ІНС аналізу. Результати аналізу наведено в Таблиці 6. Як віруси дикого типу, так і мутантні віруси розпі знавалися mAb 20.10.6 (контрольним антитілом). Вірус дикого типу також розпізнавався mAbs 1.11.3 та 24.8. Мутант Е1939А зв'язувався mAb 24.8, але не 1.11.3. МутантК-Н-Е розпізнавався тільки mAb 20.10.6, але не 1.11.3 або 24.8. Мутант R1942A демонстрував реакційну здатність щодо mAb 24.8, але не по відношенню до 1.11.3. Також оцінювали кінетику росту кожного міченого вірусу. Титри штамів вірусів для кожного були попередньо визначені з використанням стандартного протоколу вірусного титрування. У дослідженні залежності від часу, свіжі моно шари RD клітин висівали у колби для культивування тканин, інкубували усю ніч, та на наступний день інфікували попередньо визначеною кількістю кожного вірусу. Після поглинання та промивання, збирали початковий набір проб (час "0"). Проби послідовно збирали через 14, 19, 24, 39, 43, 47, та 65 годин після інфікування. Вірусні титри визначали за допомогою способу Спірмана-Карбера (Hawkes, R. A. In Ε. Η. Lennette (ed.), Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, p. 33-35; 7th ed.American Public Health Association Publications, Washington, D.C.) та виражали як ТСlD50/мл. У порівнянні з вірусом BVD дикого типу (батьківським), усі мутанти зростали із швидкістю, аналогічній, а у деяких випадках дещо вищою за швидкість росту вірусів дикого типу (Таблиця 7). 39 Деякі з генерованих мутацій призводили до зміни специфічних імунологічно різних епітопів, як визначено за допомогою набору монклональних антитіл. Подібні результати Були одержані при аналізі розпізнавання антитілами у контексті частинок інфекційного вірусу. Клони, що містять мутації, які не перешкоджають генерації інфекційного вірусу, все ще призводять до втрати розпізнавання mAbs, являючи нові штами, корисні як ефективні штами мічених BVDV вакцин. Приклад 8. Аналіз ефективності вакцин у моделі молодих телят Були одержані BVDV-негативні здорові телята, рандомізовано поділені на групи для дослідження, яки знаходилися під наглядом відвідую чого ветеринару. Тестову вакцину комбінували із стерильною допоміжною речовиною, та вводили шляхом внутрішньомязової (lМ) або підшкірної (SC) ін'єкції. Вводили дві дози вакцини, 21-28 днів окремо. Тварин послідовно заражали на 21-28 день після кінцевої вакцинації штаму BVDV типу 1 або типу. Заражене щеплення здійснювали інтраназально у вигляді розділеної дози у 4 мл, 2 мл на ніздрю. Контрольні групи, що складалися з невакцинованих, незаражених тварин та/або невакцинованих заражених тварин, також зберігали протягом проведення дослідження. Клінічні параметри перевіряли щодня, включаючи ректальну температуру, тиск, анорексію та діарею. Титри нейтралізації сироватки визначали за допомогою аналізу с постійним вмістом вірусу та зниженим вмістом сироватки бичачої клітинної культури, з використанням серійних розведень сироватки у сполученні зі штамом BVDV типу 1 чи типу 2. Виділення після BVDV зараження у бичачій клітинній культурі здійснювали у периферійній крові. BVDV-позитивну клітинну культуру визначали за допомогою непрямої імунофлуоресценції. Для демонстрації захисту після зараження, необхідно було продемонструвати зменшення випадків інфікування у вакцинованій групі у порівнянні з контрольними групами. Приклад 9. Аналіз ефективності вакцин у моделі вагітних телиць BVDV-негативні корів та телиць у віці статевого дозрівання одержували та розподіляли у тестові групи вакцинації або у плацебо (контрольні) групи. Корів двічі прищеплювали шляхом внутрішньомязових (lМ) чи підшкірних (SC) ін'єкцій, вакциною чи плацебо, окремо на 21-28 день. Після другої вакцинації, усі корови одержували ІМ ін'єкцію простагландіном для синхронізації тічки. Корови, в яких була тічка, запліднювали шляхом штучного запліднення сертифікованим BVDV-негативним насінням. На, приблизно, 60-й день гестації, статус вагітності корів визначали шляхом ректальної пальпації. Через, приблизно, 6 тижнів, у корів підтверджували вагітність та рандомізовано відбирали з кожної тестової групи. Кожну з цих корів заражали шляхом інтраназального щеплення BVDV типу 1 чи типу 2. Проби крові збирали у день зараження та у множинні інтервали після зараження для виділення BVDV. 95619 40 Через двадцять вісім днів після зараження, виконували лапаротомію лівого боку та збирали амніотичну рідину від кожної корови. Безпосередньо перед початком проведення хірургії, проби крові збирали з кожної корови для проведення аналізів нейтралізації сироватки. Після пологів методом кесаревого розтину, з кожного плоду збирали проби крові. Потім плоди піддавали евтаназії, а тканини асептично збирали для виділення BVDV. У випадках мимовільних викидів, проби крові брали з матки у випадку виявлення викиду, та через два тижні. Спарені проби крові та плоди-викидні піддавали серологічному аналізу та виділяли з них вірус. Ефективність вакцини булла продемонстрована як відсутність інфікування плодів та викидні на пізніх термінах. Приклад 10. Діагностичний аналіз мічених вакцин BVDV Велика рогата худоба у різному віці може бути вакцинована або живою атенуйованою або інактивованою NS3-мутованою (міченою) BVDV вакциною відповідно до наданих інструкцій. Проби сироватки можуть бути зібрані через 2-3 тижні чи пізніше після вакцинації. Для диференціації великої рогатої худоби, що одержала мічену BVDV вакцину порівняно із інфікованими польовим (дикого типу) штамом BVDV, проби сироватки можуть бути проаналізовані за допомогою диференційного діагностичного аналізу. Протеїн NS3 з епітопспецифічними амінокислотними мутаціями може, при наданні худобі міченої вакцини, викликати продукування специфічних антитіл, що зв'язуватимуть епітопи протеїну NS3, але не не-мутовані епітопи, наявні у вірусі дикого типу. У контексті вірусу дикого типу, вірним є протилежне - те, що специфічні антитіла можуть розпізнавати епітопи дикого типу протеїнів NS3, а не мутовані форми. Способи аналізу специфічності та афінності зв'язування антитіл добре відомі з рівня техніки, та включають, не обмежуючись наведеним, такі формати іммуноаналізів, як ELISA, конкурентні іммуноаналізи, радіологічні імуноаналізи, Вестерн блоттінг, непрямі імунофлуоресцентні аналізи та інш. Конкурентний аналіз ELISA може бути прямим чи непрямим. Один приклад прямого конкурентного аналізу описано у цій заявці. Всі або частини антигенів вірусу дикого типу, включаючи протеїн NS3 (природний або одержаний синтетично), може бути використаний як джерело антигенів. Після покриття планшети ELISA антигеном за лужних умов, проби сироватки великої рогатої худоби та розведення додавали разом при оптимальному розведенні епітоп-специфічного mAb, та інкубували протягом 30 - 90 хвилин. Пероксидаза хрону чи лужна фосфатаза були кон'юговані із mAb, дозволяючи колориметричну детекцію зв'язування. Після промивання планшет, додавали ферментспецифічний хромогенний субстрат, та після кінцевої стадії інкубації вимірювали оптичну щільність кожної лунки при довжині хвилі, що відповідала субстрату, що був використаний. В залежності від рівня реакційної здатності сироват 41 ки великої рогатої худоби по відношенню до протеїну NS3, що покривав планшету, зв'язування міченим mAb може бути інгібовано. Відсутність зв'язування mAb вказує на наявність антитіл у сироватці великої рогатої худоби, що розпізнають епітоп, специфічний до дикого типу, що є свідченням природного (дикого типу) інфікування. Навпаки, сироватка, взята від великої рогатої худоби, імунізованої міченою вакциною, що містить епітопспецифічну мутацію (мутації) не буде містити антитіла, що зв'язуватимуть протеїн NS3, що покривав планшету. Тому, mAb зв'язуватимуть протеїн NS3, що призводитиме до поступового забарвлення. 95619 42 Численні варіації будуть очевидними для фахівців у цій галузі у контексті опису цієї заявки. Наприклад, інші цитопатичні штами BVDV можуть бути мутовані у геліказний домен NS3 способом, аналогічним тому, що описаний у цій заявці для штаму NADL. У той час, коли в ілюстративних мутаціях у цій заявці використовують аланін, Інгі неконсервативні амінокислотні заміщення або інші мутації, що призводять до зберігання реплікації, але втрати розпізнавання антитілами до NS3 дикого типу, входять до обсягу даного винаходу. Вони наведені лише для ілюстрації. 43 95619 44 45 95619 46 47 95619 48 49 95619 50 51 95619 52 53 95619 54 55 95619 56 57 95619 58 59 95619 60
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMarked bovine viral diarrhea virus vaccines
Автори англійськоюHuang Chichi, Sheppard Michael G., Cao Xuemei, Zybarth Gabriele
Назва патенту російськоюМеченные вакцины мутированного вируса бычьей вирусной диареи
Автори російськоюХуанг Чичи, Шеппард Майкл Дж., Као Ксюемей, Зибарт Габриэль
МПК / Мітки
МПК: A61K 39/12, C07K 14/18, C12N 7/04
Мітки: мутованого, вірусу, вірусної, діареї, мічені, бичачої, вакцини
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/38-95619-micheni-vakcini-mutovanogo-virusu-bichacho-virusno-diare.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Мічені вакцини мутованого вірусу бичачої вірусної діареї</a>
Спосіб вакцинації проти інфекції сім’яників, викликаної вірусом бичачої вірусної діареї
Номер патенту: 86405
Опубліковано: 27.04.2009
Автори: Еллсворт Майкл Аарон, Такер Кассіус МакАллістер, Гівенс Моріс Даніель
МПК: A61P 31/14, A61K 39/295, A61K 39/12
Мітки: вірусної, сім'яників, спосіб, діареї, бичачої, викликаної, вакцинації, вірусом, інфекції
Формула / Реферат:
1. Спосіб профілактики інфекції сім'яників, викликаної вірусом BVDV, у сприйнятливого самця тварини, який передбачає:введення тварині ефективної кількості вакцини, вибраної з групи, яка складається з інактивованої вакцини BVDV типу 1, інактивованої вакцини BVDV типу 2, модифікованої живої вакцини BVDV типу 1 і модифікованої живої вакцини BVDV типу 2.2. Спосіб за п. 1, де тварина вибрана з групи, яка складається з биків, баранів...
Спосіб одержання антигену для діагностики вірусної діареї великої рогатої худоби
Номер патенту: 70247
Опубліковано: 15.09.2004
Автори: Білокінь Віктор Степанович, Стегній Борис Тимофійович, Фісенко Світлана Анатоліївна, Соловйов Сергій Тихонович
Мітки: одержання, вірусної, антигену, діагностики, худоби, великої, рогатої, спосіб, діареї
Формула / Реферат:
1. Спосіб одержання антигена для діагностики вірусної діареї великої рогатої худоби, що включає репродукцію вірусу в чутливій біологічній системі, інактивацію, концентрування та очистку, який відрізняється тим, що як антиген використовують вірус діареї ВРХ у ефективній кількості.2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як чутливу біологічну систему використовують перещеплювану лінію клітин КСТ (коронарні судини теляти).3....
Бівалентна інактивована концентрат-вакцина проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби
Номер патенту: 4626
Опубліковано: 17.01.2005
Автори: Стеценко Володимир Іванович, Кучерявенко Роман Олексійович, Стегній Борис Тимофійович, Білокінь Віктор Степанович, Кучерявенко Вікторія Вікторівна
МПК: A61K 39/265
Мітки: вірусної, діареї, інактивована, інфекційного, бівалентна, великої, ринотрахеїту, рогатої, худоби, концентрат-вакцина
Формула / Реферат:
Вакцина проти респіраторних вірусних захворювань, що містить компонент вірусу ІРТ, ад'ювант та інактиватор, яка відрізняється тим, що використовують штам "Молдавський" вірусу ІРТ, додають компонент вірусу діареї штам "ВК-1", використовують як ад'ювант масло ISA-70, a як інактиватор використовують формалін.
Спосіб профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби
Номер патенту: 5153
Опубліковано: 15.02.2005
Автори: Чебанюк Ірина Владиславівна, Кучерявенко Людмила Іллівна, Тризна Лариса Петрівна, Стеценко Володимир Іванович
МПК: A61K 39/12
Мітки: худоби, діареї, спосіб, вірусної, рогатої, профілактики, великої
Формула / Реферат:
Спосіб профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби, що включає введення живої вакцини, який відрізняється тим, що використовують живу вакцину з модифікованого штаму "ВК-1 В-1М", адаптованого до перещеплюваних культур клітин (коронарних судин теляти, трахеї теляти, нирки вівці) з дворазовим уведенням внутрішньом'язово з інтервалом 14 діб дозою 2 см3 та окремо одночасно вводять внутрішньом'язово лужний гідролізат Bac.alvei...
Штам вірусу діареї bovine viral diarrhoea (кмиэв-7) у великої рогатої худоби для виготовлення вакцинних і діагностичних препаратів
Номер патенту: 26676
Опубліковано: 10.10.2007
Автори: Кассіч Володимир Юрійович, Красочко Іріна Алэксандровна, Красочко Пєтр Альбіновіч, Волосянко Олена Вікторівна
МПК: C12N 7/00, A61K 39/265
Мітки: великої, вакцинних, вірусу, кмиэв-7, bovine, діагностичних, viral, діареї, виготовлення, худоби, препаратів, рогатої, diarrhoea, штам
Формула / Реферат:
Штам вірусу діареї bovine viral diarrhoea (КМИЭВ-7) великої рогатої худоби для виготовлення вакцинних і діагностичних препаратів.
Попередній патент: Затискна оправка для цифрового друку на корпусі банки
Наступний патент: Каталітичні композиції і спосіб оксихлорування вуглеводню з їх використанням
Випадковий патент: Емалевий шлікер