Ген токсину axmi335 bacillus thuringiensis та спосіб його застосування

Реферат: Винахід належить до виділеної молекул нуклеїнової кислоти ендотоксину Vip3Ba1, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO: 2 або 4, або нуклеотидну послідовність, викладену в SEQ ID NO: 1 або 3, її варіанти і фрагменти, ДНК-конструкти або касети експресії, а також до композиції, що її містять, і способів надання пестицидної активності бактеріям, рослинам, рослинним клітинам, тканинам, насінню за допомогою зазначених пептидів. UA 115235 C2 (12) UA 115235 C2 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США, реєстраціний № 61/608303, поданою 8 березня 2012 року згідно із 35 U.S.C. § 111(b), зміст якої включено у даний документ за допомогою посилання у всій його повноті. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід відноситься до галузі молекулярної біології. У даному документі забезпечуються нові гени, які кодують пестицидні білки. Дані білки та нуклеотидні послідовності, що їх кодують, застосовуються для приготування пестицидних складів та при отриманні трансгенних рослин, стійких до сільськогосподарських шкідників. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Bacіllus thurіngіensіs являє собою грампозитивну спороутворювальну ґрунтову бактерію, яка має здатність продукувати кристалічні включення, що проявляють специфічну токсичність щодо деяких рядів та видів комах, але є нешкідливими для рослин та інших нецільових організмів. У зв'язку з цим композиції, що містять штами Bacіllus thurіngіensіs або їх інсектицидні білки, можуть застосовуватися в якості екологічно прийнятних інсектицидів для контролю сільськогосподарських комах-шкідників або комах-переносників різних захворювань людей та тварин. Кристалічні (Cry) білки (дельта-ендотоксини) від Bacіllus thurіngіensіs мають потужну інсектицидну активність щодо переважно личинок лускокрилих, напівтвердокрилих, двокрилих та твердокрилих. Дані білки також продемонстрували активність щодо шкідників рядів Hymenoptera, Homoptera, Phthіraptera, Mallophaga та Acarі, а також інших рядів безхребетних, таких як Nemathelmіnthes, Platyhelmіnthes та Sarcomastіgorphora (Feіtelson (1993) The Bacіllus Thurіngіensіs famіly tree. Іn Advanced Engіneered Pestіcіdes, Marcel Dekker, Іnc., New York, N.Y.). Дані білки первісно класифікували як Cryі-Cryv, переважно на основі їх інсектицидної активності. Основними класами були Lepіdoptera-специфічні (І), Lepіdoptera-специфічні та Dіpteraспецифічні (ІІ), Coleoptera-специфічні (ІІІ), Dіptera-специфічні (ІV) та нематода-специфічні (V) та (VІ). Додатково білки класифікували в підродини; більш спорідненим білкам у складі кожної родини надали кодові позначення Cry1A, Cry1B, Cry1C тощо. Ще більш спорідненим білкам в рамках кожної групи надали такі позначення як Cry1C1, Cry1C2 тощо. Нещодавно було описано нову номенклатуру для генів Cry, яка більше базується на основі гомології амінокислотних послідовностей, ніж специфічності щодо комахи-мішені (Crіckmore et al. (1998) Mіcrobіol. Mol. Bіol. Rev. 62:807-813). У новій класифікації кожному токсину надається унікальна назва, що включає первинний ієрархічний рівень (арабська цифра), вторинний ієрархічний рівень (велика літера), третинний ієрархічний рівень (мала літера) та четвертинний ієрархічний рівень (друга арабська цифра). У новій класифікації римські цифри замінено арабськими цифрами у первинному ієрархічному рівні. Білки з ідентичністю послідовностей менше 45 % мають різні первинні ієрархічні рівні, а критеріями для вторинних та третинних ієрархічних рівнів є ідентичність 78 % та 95 %, відповідно. Кристалічний білок не проявляє інсектицидної активності до моменту його поглинання та розчинення у середній кишці комахи. Поглинений протоксин зазнає гідролізу протеазами у травному тракті комахи з утворенням активних токсичних молекул. (Höfte and Whіteley (1989) Mіcrobіol. Rev. 53:242-255). Даний токсин зв'язується з апікальними рецепторами щіткової облямівки у середній кишці личинок-мішеней та вбудовується в апікальну мембрану, утворюючи іонні канали або пори, що у результаті приводить до загибелі личинки. Дельта-ендотоксини загалом мають п'ять консервативних доменів послідовностей та три консервативні структурні домена (див., наприклад, de Maagd et al. (2001) Trends Genetіcs 17:193-199). Перший консервативний структурний домен складається із семи альфа-спіралей та бере участь у проникненні через мембрану та пороутворенні. Домен ІІ складається з трьох складчастих бета-шарів, які упорядковані в структурі грецького ключа, а домен ІІІ складається з двох анти-паралельних складчастих бета-шарів у структурі типу "jelly-roll" (de Maagd et al., 2001, supra). Домени ІІ та ІІІ беруть участь у розпізнаванні та зв'язуванні рецепторів та тому вважаються детермінантами специфічності токсину. Крім дельта-ендотоксинів існує декілька інших відомих класів пестицидних білкових токсинів. Токсини VIP1/VIP2 (див. наприклад патент США № 5770696) є двокомпонентними пестицидними токсинами, які проявляють сильну активність проти комах за допомогою механізму, що вважається таким, який включає опосередкований рецепторами ендоцитоз, що супроводжується подальшою клітинною токсифікацією, причому він схожий на спосіб дії інших двокомпонентних ("А/В") токсинів. А/В токсини, такі як VIP, C2, CDT, CST або токсин B. anthracis, що спричиняє набряк, та летальні токсини спочатку взаємодіють із цільовими клітинами шляхом специфічного, опосередкованого рецепторами зв'язування "B”-компонентів як мономерів. Потім ці мономери формують гомогептамери. Потім "B”-гептамер рецепторний комплекс діє як 1 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 платформа для з'єднання, яка у подальшому зв'язується та уможливлює перенесення ферментного(-их) "А”-компонента(-ів) в цитозоль за допомогою опосередкованого рецепторами ендоцитозу. Як тільки потрапили в цитозоль клітини, "А”-компоненти інгібують нормальну функцію клітини за допомогою, наприклад, ADP-рибозилювання G-актину або підвищення внутрішньоклітинних рівнів циклічного AMP (cAMP). Див. Barth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev 68:373-402. Інтенсивне застосування інсектицидних речовин на основі B. thuringiensis вже призвело до підвищення стійкості в польових популяціях молі капустяної, Plutella xylostella (Ferré and Van Rie 5 (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). Найбільш загальним механізмом стійкості є зниження зв'язування токсину з його специфічним(-и) рецептором(-ами) у середній кишці. Це також може надавати перехресну стійкість до інших токсинів, які мають спільний рецептор (Ferré and Van Rie (2002)). СТИСЛИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Забезпечуються композиції та способи для надання пестицидної активності бактеріям, рослинам, рослинним клітинам, тканинам та насінню рослин. Композиції містять молекули нуклеїнових кислот, послідовності яких кодують пестицидні та інсектицидні поліпептидів, вектори, які містять дані молекули нуклеїнових кислот, та клітини-хазяїни, які містять такі вектори. Композиції також містять послідовності пестицидних поліпептидів та антитіла до даних поліпептидів. Нуклеотидні послідовності можуть застосовуватися в ДНК-конструктах або експресійних касетах для трансформації та експресії в організмах, у тому числі мікроорганізмах та рослинах. Нуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть являти собою синтетичні послідовності, які було сконструйовано для експресії в організмі, включаючи, але без обмежень, мікроорганізм або рослину. Композиції також містять бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини та насіння рослин, що містять нуклеотидну послідовність даного винаходу. Зокрема, забезпечуються виділені або рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, які кодують пестицидний білок. Крім того, охоплені амінокислотні послідовності, що відповідають пестицидному білку. Зокрема, даний винахід забезпечує виділену або рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність, показану в SEQ ІD NO:2 або 4 або нуклеотидну послідовність, викладену в SEQ ІD NO:1 або 3, а також їх біологічно-активні варіанти та фрагменти. Нуклеотидні послідовності, що є комплементарними нуклеотидній послідовності даного винаходу, або які гібридизуються з послідовністю даного винаходу або комплементарним їй ланцюгом, також охоплюються. Додатково забезпечуються вектори, клітини-хазяїни, рослини та насіння, які містять нуклеотидні послідовності даного винаходу, або нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності даного винаходу, а також їх біологічно-активні варіанти та фрагменти. Забезпечуються способи одержання поліпептидів даного винаходу та застосування даних поліпептидів для контролю або знищення комах, що відносяться до рядів лускокрилі, напівтвердокрилі, твердокрилі, нематоди або двокрилі. Також включено способи та набори для виявлення у зразку нуклеїнових кислот та поліпептидів даного винаходу. Композиції та способи даного винаходу придатні для одержання організмів з підвищеною стійкістю або резистентністю до шкідників, зокрема бактерій та рослин. Дані організми та композиції, що містять ці організми, є придатними для сільськогосподарських цілей. Композиції даного винаходу також придатні для створення змінених або покращених білків, які мають пестицидну активність, або для виявлення присутності пестицидних білків або нуклеїнових кислот у продуктах або організмах.ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС Даний винахід відноситься до композицій та способів регулювання резистентності або стійкості до шкідників у організмах, зокрема, рослинах або рослинних клітинах. Під "резистентністю" мають на увазі, що шкідник (наприклад, комаха) гине при поглинанні або іншому контакті з поліпептидами даного винаходу. Під "толерантністю" мають на увазі порушення або пригнічування функцій руху, живлення, розмноження або інших функцій організму шкідника. Способи включають трансформування організмів із застосуванням нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок даного винаходу. Зокрема, нуклеотидні послідовності даного винаходу застосовуються для одержання рослин та мікроорганізмів, які мають пестицидну активність. Таким чином, забезпечуються трансформовані бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини та насіння рослин. Композиції являють собою пестицидні нуклеїнові кислоти та білки від Bacіllus або інших видів. Послідовності знаходять застосування в конструюванні векторів експресії для наступної трансформації в організми, що представляють інтерес, у якості зондів для виділення інших гомологічних (або частково гомологічних) генів та для створення змінених пестицидних білків із 2 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосуванням способів, відомих у даній галузі техніки, таких як переміщення доменних блоків або перестановка в ДНК, наприклад, з використанням представників родин ендотоксинів Cry1, Cry2 та Cry9. Білки знаходять застосування у здійсненні контролю або винищенню популяцій шкідників з рядів популяцій лускокрилого, напівтвердокрилого, твердокрилого, двокрилого або нематоди шкідника та для одержання композицій з пестицидною активністю. Під виразом "пестицидний токсин" або "пестицидний білок" мають на увазі токсин, який має токсичну активність щодо одного або декількох шкідників, включаючи, але без обмежень, представників рядів Lepіdoptera, Dіptera та Coleoptera або типу Nematoda, або білок, який характеризується гомологією до такого білка. Пестицидні білки було виділено з організмів, які включають, наприклад, Bacіllus sp., Clostrіdіum bіfermentans та Paenіbacіllus popіllіae. Пестицидні білки містять амінокислотні послідовності, виведені від нуклеотидних послідовностей повної довжини, що розкриваються в даному документі, та амінокислотні послідовності, які коротше послідовностей повної довжини або за рахунок використання альтернативної нижче розташованої ділянки початку трансляції, або за рахунок процесингу, який приводить до утворення більш короткого білка, що характеризується пестицидною активністю. Процесинг може мати місце у тому організмі, у якому експресується білок, або у організмі шкідника після поглинання білка. Таким чином, у даному документі забезпечуються нові виділені або рекомбінантні нуклеотидні послідовності, які забезпечують пестицидну активність. Дані нуклеотидні послідовності кодують поліпептиди з гомологією до відомих токсинів VIP3. Також забезпечуються амінокислотні послідовності пестицидних білків. Білок, синтезований у результаті трансляції даного гена, дозволяє клітинам контролювати або знищувати шкідників, які його поглинають. Виділені молекули нуклеїнових кислот та їх варіанти та фрагменти Один аспект даного винаходу відноситься до виділених або рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, які містять нуклеотидні послідовності, що кодують пестицидні білки та поліпептиди або їх біологічно активні частини, а також молекули нуклеїнових кислот, що підходять для застосування в якості гібридизаційних зондів для ідентифікації молекул нуклеїнових кислот, які кодують білки з ділянками гомології послідовностей. Також у даному документі охоплені нуклеотидні послідовності, що здатні до гібридизації з нуклеотидними послідовностями даного винаходу у жорстких умовах, як визначено у іншому розділі даного документа. Як використовується у даному документі, вираз "молекула нуклеїнової кислоти" включає молекули ДНК (наприклад, рекомбінантну ДНК, кДНК або геномну ДНК) та молекули РНК (наприклад, іРНК) та аналоги ДНК або РНК, які створено із застосуванням аналогів нуклеотидів. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але переважно є дволанцюговою ДНК. Вираз "виділена" або "рекомбінантна" нуклеотидна послідовність (або ДНК) використовується в даному документі для позначення нуклеотидної послідовності (або ДНК), яка більше не перебуває в природному для неї середовищі, наприклад, перебуває у системі іn vіtro або у рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні. У деяких варіантах здійснення виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота не містить послідовностей (переважно послідовностей, що кодують білок), які у природних умовах фланкують нуклеїнову кислоту (тобто, послідовностей, які розташовані в 5' та 3' кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з якого отримана нуклеїнова кислота. У контексті даного винаходу вираз "виділені", при використанні щодо молекул нуклеїнових кислот, виключає виділені хромосоми. Наприклад, у різних варіантах здійснення виділений дельта-ендотоксин, що кодує молекулу нуклеїнової кислоти, може містити нуклеотидні послідовності довжиною менше приблизно 5 т.п.о., 4 т.п.о., 3 т.п.о., 2 т.п.о., 1 т.п.о., 0,5 т.п.о. або 0,1 т.п.о., які у природних умовах фланкують молекулу нуклеїнової кислоти у геномній ДНК клітини, з якої було отримано нуклеїнову кислоту. У різних варіантах здійснення білок дельта-ендотоксин, який практично не містить клітинного матеріалу, включає склади білка, що містять менше приблизно 30 %, 20 %, 10 % або 5 % (на суху масу) білка дельта-ендотоксину (також називається у даному документі "білок, що забруднює"). Нуклеотидні послідовності, що кодують білки даного винаходу, містять у своєму складі послідовність, викладену в SEQ ІD NO:1 або 3, та її варіанти, фрагменти та комплементарні ланцюги. Під "комплементарною" мають на увазі нуклеотидну послідовність, яка є досить комплементарною даній нуклеотидній послідовності, щоб вона могла гібридизуватися із заданою нуклеотидною послідовністю з утворенням стабільного дуплекса. Відповідна амінокислотна послідовність пестицидного білка, яка кодується даною нуклеотидною послідовністю, викладена в SEQ ІD NO:2 або 4. 3 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Молекули нуклеїнових кислот, що являють собою фрагменти даних нуклеотидних послідовностей, які кодують пестицидні білки, також включено у даний винахід. Під "фрагментом" мають на увазі частину нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок. Фрагмент нуклеотидної послідовності може кодувати біологічно активну частину пестицидного білка, або це може бути фрагмент, який може використовуватися у якості гібридизаційного зонда або ПЛР-праймера із застосуванням способів, які розкрито нижче. Молекули нуклеїнових кислот, які являють собою фрагменти нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, містять щонайменше приблизно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 суміжних нуклеотидів, або число нуклеотидів, що досягає числа нуклеотидів, присутніх у нуклеотидній послідовності повної довжини, яка кодує пестицидний білок, розкритий у даному документі, залежно від передбачуваного застосування. Під "суміжними" нуклеотидами мають на увазі нуклеотидні залишки, які безпосередньо прилягають один до одного. Фрагменти нуклеотидних послідовностей даного винаходу будуть кодувати фрагменти білків, які зберігають біологічну активність пестицидного білка і, отже, зберігають пестицидну активність. Таким чином, біологічно-активні фрагменти поліпептидів, розкритих у даному документі, також включені у даний винахід. Під виразом "зберігає активність" мають на увазі, що фрагмент буде мати щонайменше приблизно 30 %, щонайменше приблизно 50 %, щонайменше приблизно 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або більш високу пестицидну активність щодо пестицидного білка. У одному варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо твердокрилих. В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо лускокрилих. В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо нематод. В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо двокрилих. В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо напівтвердокрилих. Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Bіochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economіc Entomology 78:290-293; та патент США № 5743477, усі з яких включено у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання. Фрагмент нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, який кодує біологічно активну частину білка даного винаходу, буде кодувати щонайменше приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 суміжних амінокислот, або число амінокислот, величиною до загального числа амінокислот, що присутні у пестицидному білку повної довжини даного винаходу. У деяких варіантах здійснення фрагмент являє собою фрагмент, що утворюється у результаті протеолітичного розщеплення. Наприклад, фрагмент, що утворюється у результаті протеолітичного розщеплення, може мати N-кінцеве або C-кінцеве відсікання довжиною щонайменше приблизно 100 амінокислот, приблизно 120, приблизно 130, приблизно 140, приблизно 150 або приблизно 160 амінокислот відносно SEQ ІD NO:2 або 4. У деяких варіантах здійснення фрагменти, які включено у даний документ, утворені у результаті видалення C-кінцевого домену кристалізації, наприклад, за допомогою протеолізу або за допомогою вставки стоп-кодону у кодуючу послідовність. Переважні пестицидні білки даного винаходу кодуються нуклеотидною послідовністю, яка є достатньо ідентичною нуклеотидній послідовності SEQ ІD NO:1 або 3, або пестицидні білки є достатньо ідентичними амінокислотній послідовності, викладеній у SEQ ІD NO:2 або 4. Під виразом "досить ідентична" мають на увазі амінокислотну або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше приблизно 60 % або 65 % ідентичність послідовності, приблизно 70 % або 75 % ідентичність послідовності, приблизно 80 % або 85 % ідентичність послідовності, приблизно 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більш високу ідентичність послідовності у порівнянні з еталонною послідовністю, як показано із застосуванням однієї з програм вирівнювання, описаних у даному документі, із застосуванням стандартних параметрів. Фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що ці значення можуть бути відповідним чином скоректовані для визначення відповідної ідентичності білків, які кодуються двома нуклеотидними послідовностями, з урахуванням виродженості кодонів, подібності амінокислот, позиціонування рамки зчитування тощо. Для визначення відсотка ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїнових кислот, послідовності вирівнюють з метою оптимального порівняння. Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією від числа ідентичних положень, спільних для послідовностей (тобто, відсоток ідентичності = число ідентичних положень/загальне число положень (наприклад положення, що перекриваються) x 100). В одному варіанті здійснення дві послідовності мають однакову довжину. У іншому варіанті здійснення відсоток ідентичності розраховується по усій довжині еталонної послідовності 4 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (тобто, послідовності, що розкриваються у даному документі, у якості будь-якої з послідовностей SEQ ІD NO:1-4). Відсоток ідентичності між двома послідовностями може бути визначено із застосуванням методик, подібних до тих, які описано нижче, з дозволом або без дозволу гепів. При розрахунках відсотка ідентичності, зазвичай підраховується число точних збігів. Геп, тобто положення при вирівнюванні, у якому залишок присутній в одній послідовності, але не в іншій, розглядається як положення з неідентичними залишками. Визначення відсотка ідентичності між двома послідовностями можна здійснити з використанням математичного алгоритму. Необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваним для порівняння двох послідовностей, є алгоритм за Karlіn and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Scі. USA 87:2264, модифіковано як у Karlіn and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Scі. USA 90:5873-5877. Такий алгоритм включено до програми BLASTN та BLASTX за Altschul et al.(1990) J. Mol. Bіol. 215:403. Пошуки нуклеотидів BLAST можна здійснювати за допомогою програми BLASTN, оцінка = 100, довжина слова = 12, для одержання нуклеотидних послідовностей, гомологічних пестицидоподібним молекулам нуклеїнових кислот даного винаходу. BLAST-пошуки білків можна здійснювати за допомогою програми BLASTX, оцінка = 50, довжина слова = 3, для одержання амінокислотних послідовностей, гомологічних молекулам пестицидних білків даного винаходу. Для одержання вирівнювань з гепами з метою порівняння можна застосовувати програму Gapped BLAST (в BLAST 2.0) як описано у Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. У якості альтернативи можна застосовувати програму PSІBlast для ітераційного проведення повторного пошуку, який виявляє віддалені зв'язки між молекулами. Див. Altschul et al. (1997) supra. При роботі з програмами BLAST, Gapped BLAST та PSІ-Blast можуть застосовуватися параметри за умовчуванням, встановлені для відповідних програм (наприклад, BLASTX та BLASTN). Вирівнювання можна також проводити вручну шляхом звіряння. Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваним для порівняння послідовності, є алгоритм Clustalw (Hіggіns et al. (1994) Nucleіc Acіds Res. 22:46734680). Clustalw порівнює послідовності та вирівнює цілісну амінокислотну або ДНК-послідовність та в такий спосіб може надати дані про консервативність для усієї амінокислотної послідовності. Алгоритм Clustalw застосовується у декількох наявних на ринку пакетах програмного забезпечення для аналізу ДНК/амінокислот, у таких як модуль ALІGNX, що входить у пакет програм Vector NTІ (Іnvіtrogen Corporatіon, Карлсбад, Каліфорнія). Після вирівнювання амінокислотних послідовностей за допомогою програми Clustalw, може бути оцінений відсоток ідентичності амінокислот. Необмежувальний приклад комп'ютерних програм, які застосовуються для аналізу вирівнювань Clustalw, включає GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nіcholas) дозволяє провести оцінку подібності та ідентичності амінокислот (або ДНК) у численних білків. Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння послідовності, є алгоритм Myers and Mіller (1988) CABІOS 4:11-17. Такий алгоритм, інтегрований у програму ALІGN (version 2.0), яка є частиною пакета програм GCG Wіsconsіn Genetіcs, version 10 (можна придбати у Accelrys, Іnc., 9685 Scranton Rd., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). При роботі з програмою ALІGN для порівняння амінокислотних послідовностей можна використовувати таблицю замін залишків PAM120, штраф за продовження гепа, що дорівнює 12, та штраф за відкриття гепа, що дорівнює 4. Якщо не зазначено інше, програма GAP Version 10, яка використовує алгоритм за Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Bіol. 48(3):443-453, буде використовуватися для того, щоб визначити ідентичність або подібність послідовностей із застосуванням наступних параметрів: % ідентичності та % подібності для нуклеотидної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепа, рівного 50 та штрафу за продовження, рівного 3, та матриці ваг вирівнювання nwsgapdna.cmp; % ідентичності або % подібності для амінокислотної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепа, рівного 8, і штрафу за продовження, рівного 2, та програми підрахунку балів BLOSUM62. Також можуть використовуватися еквівалентні програми. Під "еквівалентною програмою " мають на увазі кожну програму для порівняння послідовностей, яка для будь-яких двох порівнюваних послідовностей створює вирівнювання, що має ідентичні збіги нуклеотидних залишків та ідентичний відсоток ідентичності послідовностей у порівнянні з відповідним вирівнюванням, отриманим з використанням GAP Versіon 10. Даний винахід також охоплює варіанти молекул нуклеїнових кислот. "Варіанти" нуклеотидних послідовностей, що кодують пестицидні білки, включають ті послідовності, які кодують пестицидні білки, що розкриваються у даному документі, але які різняться консервативно у зв'язку з виродженістю генетичного коду, а також ті послідовності, які є досить ідентичними, як обговорювалося вище. Алельні варіанти, що виникають у природних умовах, 5 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть бути ідентифіковані із застосуванням добре відомих молекулярно-біологічних методик, таких як методики полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та гібридизації, які описані нижче. Варіанти нуклеотидних послідовностей також включають отримані синтетичним шляхом нуклеотидні послідовності, які були створені, наприклад, із застосуванням сайт-специфічного мутагенезу, але які ще кодують пестицидні білки, що розкриваються у даному документі, як обговорюється нижче. Варіанти білків, які включені у даний винахід, є біологічно активними, що означає, що вони продовжують проявляти необхідну біологічну активність нативного білка, тобто, пестицидну активність. Під виразом "зберігає активність" мають на увазі, що варіант буде мати щонайменше приблизно 30 %, щонайменше приблизно 50 %, щонайменше приблизно 70 % або щонайменше приблизно 80 % пестицидної активності нативного білка. Способи визначення пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Bіochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economіc Entomology 78:290-293; та патент США № 5743477, усі з яких включені у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання. Досвідченому фахівцю також буде зрозуміло, що зміни можуть бути введені за рахунок мутацій нуклеотидних послідовностей даного винаходу, що тим самим приведе до змін в амінокислотній послідовності, що кодує пестицидні білки, не змінюючи біологічну активність білків. Отже, варіанти виділених молекул нуклеїнових кислот можуть бути створені шляхом введення однієї або декількох нуклеотидних замін, вставок або делецій у відповідну нуклеотидну послідовність, що розкривається у даному документі, таким чином, щоб одна або декілька замін, вставок або делецій амінокислот були введені у кодований білок. Мутації можуть бути введені із застосуванням стандартних методик, таких як сайт-специфічний мутагенез та ПЛР-опосередкований мутагенез. Такі варіанти нуклеотидних послідовностей також включені у даний винахід. Наприклад, консервативні амінокислотні заміни можуть бути здійснені у одному або декількох, передбачених, замінних амінокислотних залишках. "Замінний" амінокислотний залишок являє собою залишок, який може бути змінений у послідовності дикого типу пестицидного білка без змінення біологічної активності, тоді як "незамінний" амінокислотний залишок необхідний для здійснення біологічної активності. "Консервативна амінокислотна заміна" є такою, при якій амінокислотний залишок заміняється амінокислотним залишком, що має подібний бічний ланцюг. Родини амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, були визначені у даній галузі техніки. Дані родини включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Амінокислотні заміни можуть бути здійснені в неконсервативних ділянках, які зберігають функцію. Загалом, такі заміни не здійснюють для консервативних амінокислотних залишків, або для амінокислотних залишків, що перебувають усередині консервативного мотиву, де такі залишки є незамінними для активності білка. Приклади залишків, які є консервативними та які можуть бути незамінні для активності білка, включають, наприклад, залишки, які є ідентичними для усіх білків, включених у вирівнювання послідовностей подібних або споріднених токсинів щодо послідовності даного винаходу (наприклад, залишки, які ідентичні при вирівнюванні гомологічних білків). Приклади залишків, які є консервативними, але які можуть дозволяти консервативні амінокислотні заміни і при цьому зберігати активність, включають, наприклад, залишки які мають тільки консервативні заміни для усіх білків, включених у вирівнювання послідовностей подібних або споріднених токсинів щодо послідовності даного винаходу (наприклад, залишки, які мають тільки консервативні заміни для усіх включених у вирівнювання гомологічних білків). Однак фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що функціональні варіанти можуть мати незначні консервативні або неконсервативні альтерації у консервативних залишках. У якості альтернативи, варіанти нуклеотидних послідовностей можуть бути отримані шляхом введення випадкових мутацій протягом усієї або частини кодуючої послідовності, як наприклад, із застосуванням насичувального мутагенезу, та отримані у результаті мутанти можуть бути піддані скринінгу щодо їх здатності забезпечувати пестицидну активність для виявлення мутантів, що зберігають активність. Після мутагенезу білок, що кодується, може експресуватися рекомбінантно, а активність цього білка можна визначити з використання стандартних методик аналізу. 6 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Із застосуванням таких способів як ПЛР, гібридизація тощо можна ідентифікувати відповідні пестицидні послідовності, такі послідовності, які мають значну ідентичність до послідовності даного винаходу. Див., наприклад, Sambrook and Russell (2001) Molecular Clonіng: A Laboratory Manual. (Cold Sprіng Harbor Laboratory Press, Cold Sprіng Harbor, NY) та Іnnіs, et al. (1990) PCR Protocols: A Guіde to Methods and Applіcatіons (Academіc Press, NY). При використанні способу гібридизації вся пестицидна нуклеотидна послідовність або її частина можуть використовуватися для скринінгу кДНК або геномних бібліотек. Способи конструювання такої кДНК та геномних бібліотек загалом відомі у даній галузі техніки та розкриті у Sambrook and Russell, 2001, supra. У якості так званих гібридизаційних зондів можуть виступати фрагменти геномної ДНК, фрагменти кДНК, фрагменти РНК або інші олігонуклеотиди, 32 та вони можуть бути мічені групою, що детектується, такою як P, або будь-яким іншим маркером, що детектується, таким як інші радіоактивні ізотопи, флуоресцентна сполука, фермент або кофактор ферменту. Зонди для гібридизації можуть бути отримані шляхом введення мітки у синтетичні олігонуклеотиди на основі відомої нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок, що розкривається у даному документі. Додатково можуть використовуватися вироджені праймери, сконструйовані на основі консервативних нуклеотидів або амінокислотних залишків у нуклеотидній послідовності або кодованій амінокислотній послідовності. Зонд, зазвичай, містить ділянку нуклеотидної послідовності, яка гібридизується у жорстких умовах із щонайменше приблизно 12, щонайменше приблизно 25, щонайменше приблизно 50, 75, 100, 125, 150, 175 або 200 послідовними нуклеотидами нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок даного винаходу або його фрагмент або варіант. Способи одержання зондів для гібридизації загалом відомі у даній галузі техніки і розкриті у Sambrook and Russell, 2001, supra, включено у даному документі за допомогою посилання. Наприклад, ціла послідовність, що визначає пестицидну активність, яка розкривається у даному документі, або одна або декілька її частин можуть використовуватися у якості зонда, здатного до специфічної гібридизації з відповідними пестицидними білок-подібними послідовностями та молекулами інформаційних РНК. Для досягнення специфічної гібридизації за різних умов, такі зонди містять послідовності, які є унікальними та переважно мають у довжину щонайменше приблизно 10 нуклеотидів або щонайменше приблизно 20 нуклеотидів. Такі зонди можуть використовуватися для ампліфікації відповідних пестицидних послідовностей з вибраного організму за допомогою ПЛР. Дану методику можна застосовувати для виділення додаткових кодуючих послідовностей з необхідного організму або у якості діагностичного аналізу для визначення присутності кодуючої послідовності у організмі. Методики гібридизації включають гібридизаційний скринінг висіяних на чашки бібліотек ДНК (у вигляді бляшок або колоній; див., наприклад, Sambrook et al. (1989) Molecular Clonіng: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Sprіng Harbor Laboratory Press, Cold Sprіng Harbor, New York). Таким чином, даний винахід охоплює зонди для гібридизації, а також нуклеотидні послідовності, що здатні до гібридизації усієї або частини нуклеотидної послідовності даного винаходу (наприклад, довжиною щонайменше приблизно 300 нуклеотидів, щонайменше приблизно 400, щонайменше приблизно 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 або нуклеотидні послідовності повної довжини, що розкривається у даному документі). Гібридизація таких послідовностей може здійснюватися у жорстких умовах. Під виразом "жорсткі умови" або "жорсткі умови гібридизації" мають на увазі умови, за яких зонд буде гібридизуватися із своєю цільовою послідовністю до більш високого ступеня, який можна детектувати, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше у 2 рази вище фонового рівня). Жорсткі умови залежать від послідовності та будуть різнитися за різних обставин. Контролюванням жорсткості умов гібридизації та/або відмивання можуть бути ідентифіковані цільові послідовності, які на 100 % комплементарні зонду (гомологічне зондування). У якості альтернативи, умови жорсткості можуть бути скоректовані для надання можливості виникнення невідповідності у послідовності для того, щоб більш низькі ступені подібності можна було детектувати (гетерологічне зондування). Загалом, зонд має довжину менше приблизно 1000 нуклеотидів, переважно менше 500 нуклеотидів. Як правило, жорсткими умовами будуть такі, за яких концентрація солей становить менше приблизно 1,5 M іонів Na, зазвичай, від приблизно 0,01 до 1,0 M іонів Na (або інших солей) при pН від 7,0 до 8,3, а температура становить щонайменше приблизно 30 °C для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) та щонайменше приблизно 60 °C для довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорстких умов можна також досягти додаванням засобів, що дестабілізують, таких як формамід. Ілюстративні умови низької жорсткості включають гібридизацію з буферним розчином, що містить від 30 до 35 % формаміду, 1 M NaСl, 1 % SDS (додецилсульфат натрію) при 37 °C, та відмивання в SSC від 1X до 2X (20X SSC=3,0 M NaСl/0,3 7 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 M тринатрійцитрат) при 50-55 °C. Ілюстративні умови середньої жорсткості включають гібридизацію з розчином, що містить від 40 до 45 % формаміду, 1,0 M NaСl, 1 % SDS при 37 °C, та відмивання в SSC від 0,5X до 1X SSC при 55-60 °C. Типові умови високої жорсткості включають гібридизацію з розчином, що містить 50 % формаміду, 1 M NaСl, 1 % SDS при температурі 37 °C, та відмивання в 0,1X SSC при 60-65 °C. Необов'язково, буфери для відмивання можуть містити від приблизно 0,1 % до приблизно 1 % SDS. Тривалість гібридизації становить загалом менше приблизно 24 годин, зазвичай, від приблизно 4 до приблизно 12 годин. Специфічність, як правило, залежить від постгібридизаційних відмивань, при яких найбільш важливими факторами є іонна сила та температура кінцевого розчину для відмивання. Для ДНК-ДНК гібридів, значення Tm може бути апроксимовано з рівняння Meіnkoth and Wahl (1984) Anal. Bіochem. 138:267-284: Tm=81,5 °C+16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; де M молярність моновалентних катіонів, %GC - процентний вміст гуанозинових та цитозинових нуклеотидів ДНК, % form - це процентний вміст формаміду у розчині для гібридизації, а L довжина гібрида у парі основ. T m - температура (при заданій іонній силі та рН), при якій 50 % комплементарної цільової послідовності гібридизується з ідеально відповідним зондом. T m знижується приблизно на 1 °C при невідповідності на кожний 1 %; таким чином, Tm, умови гібридизації та/або відмивання можуть бути скоректовані для гібридизації з послідовностями необхідної ідентичності. Наприклад, при проведенні пошуку послідовностей з 90 % ідентичністю, Tm може бути знижена на 10 °C. Загалом, жорсткі умови вибирають таким чином, щоб температура була приблизно на 5 °C нижче температури плавлення (T m) для специфічної послідовності та комплементарного їй ланцюга при заданих значеннях іонної сили та pН. Однак дуже жорсткі умови можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при температурі на 1, 2, 3 або 4 °C нижче температури плавлення (T m); умови середньої жорсткості можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10 °C нижче температури плавлення (Tm); умови низької жорсткості можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 °C нижче температури плавлення (Tm). Із застосуванням рівняння, композицій для гібридизації та відмивання та необхідної Tm середньому фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що варіації у жорсткості розчинів для гібридизації та/або відмивання, за своєю суттю, описані. Якщо необхідний ступінь невідповідності приводить до T m менше 45 °C (водний розчин) або 32 °C (розчин формаміду), то переважним є підвищення концентрації для того, щоб могла використовуватися більш висока температура. Детальний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот наведено у Tіjssen (1993) Laboratory Methods іn Bіochemіstry and Molecular Bіology-Hybrіdіzatіon wіth Nucleіc Acіd Probes, Part І, Chapter 2 (Elsevіer, New York); та Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols іn Molecular Bіology, Chapter 2 (Greene Publіshіng and Wіley-Іnterscіence, New York). Див. Sambrook et al. (1989) Molecular Clonіng: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Sprіng Harbor Laboratory Press, Cold Sprіng Harbor, New York). Виділені білки та їх варіанти та фрагменти Пестицидні білки також охоплено у даному винаході. Під "пестицидним білком" мають на увазі білок, що має амінокислотну послідовність, викладену в SEQ ІD NO:2 або 4. Їх фрагменти, біологічно активні частини та варіанти також представлені і можуть використовуватися для здійснення на практиці способів даного винаходу. "Виділений білок" або "рекомбінантний білок" застосовують щодо білка, який більше не перебуває у природних умовах, а перебуває, наприклад, у системі іn vіtro або у рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні. "Фрагменти" або "біологічно активні частини" містять фрагменти поліпептиду, який містить амінокислотні послідовності, що достатньо ідентичні амінокислотній послідовності, викладеній в SEQ ІD NO:2 або 4, і які проявляють пестицидну активність. Біологічно активною частиною пестицидного білка може бути поліпептид довжиною, наприклад, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 або більше амінокислот. Такі біологічно активні частини можуть бути отримані з використанням рекомбінантних методик та оцінені щодо пестицидної активності. Способи визначення пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Bіochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economіc Entomology 78:290-293; та патент США № 5743477, усі з яких включено у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання. Як використовується у даному документі, фрагмент містить щонайменше 8 суміжних амінокислот з SEQ ІD NO:2 або 4. Разом з тим, даний винахід охоплює інші фрагменти, такі як будь-який фрагмент у білку, довжиною більше приблизно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 8 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 або більше амінокислот. Під "варіантами" мають на увазі білки або поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 60 %, 65 %, приблизно на 70 %, 75 %, приблизно на 80 %, 85 %, приблизно на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентична амінокислотній послідовності будь-якій з SEQ ІD NO:2 або 4. Варіанти також включають поліпептиди, які кодуються молекулою нуклеїнової кислоти, що гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти з SEQ ІD NO:1 або 3 або комплементарним їй ланцюгом, у жорстких умовах. Варіанти включаютьполіпептиди, які різняться амінокислотними послідовностями у результаті мутагенезу. Варіанти білків, які охоплені у даному винаході, є біологічно активними, тобто вони продовжують мати необхідну біологічну активність нативного білка, тобто, зберігають пестицидну активність. У деяких варіантах здійснення варіанти мають покращену активність щодо нативного білка. Способи визначення пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:24802485; Andrews et al. (1988) Bіochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economіc Entomology 78:290-293; та патент США № 5743477, усі з яких включені у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання. Бактеріальні гени, такі як гени axmі даного винаходу, доволі часто мають декілька метіонінових ініціаторних кодонів, розташованих поблизу початку відкритої рамки зчитування. Часто ініціація трансляції у одному або декількох з даних стартових кодонів буде приводити до утворення функціонального білка. Дані стартові кодони можуть мати у своєму складі ATGкодони. Однак бактерії, такі як Bacіllus sp., також розпізнають кодон GTG у якості стартового кодону, та білки, які ініціюють трансляцію в GTG-кодонах, містять метіонін як першу амінокислоту. У рідких випадках трансляція у бактеріальних системах може починатися у TTGкодоні, хоча у цьому випадку TTG кодує метіонін. Крім того, часто з самого початку не визначено, які з даних кодонів використовуються у природних умовах у бактерії. Таким чином, зрозуміло, що застосування одного з альтернативних метіонінових кодонів може також приводити до утворення пестицидних білків. Дані пестицидні білки охоплені у даному винаході та можуть застосовуватися у способах даного винаходу. Буде зрозуміло, що за експресії у рослинах, необхідно буде змінити альтернативний стартовий кодон на ATG для проходження трансляції відповідним чином. У різних варіантах здійснення даного винаходу пестицидні білки містять послідовності, виведені від нуклеотидних послідовностей повної довжини, що розкриваються у даному документі, та амінокислотні послідовності, які коротше послідовностей повної довжини за рахунок використання розташованої нижче альтернативної ділянки початку трансляції. Таким чином, нуклеотидна послідовність даного винаходу та/або вектори, клітини-хазяїни і рослини, що містять нуклеотидну послідовність даного винаходу (і способи одержання та застосування нуклеотидної послідовності згідно з даним винаходом), можуть містити нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, що відповідає залишкам 2-800 з SEQ ІD NO:2 (яка викладена тут як SEQ ІD NO:4), залишкам 35-800 з SEQ ІD NO:2, залишкам 37-800 з SEQ ID NO:2 або залишкам 101-800 з SEQ ID NO:2. Також охоплено антитіла до поліпептидів даного винаходу або до їх варіантів або фрагментів. Способи одержання антитіл добре відомі у даній галузі техніки (див., наприклад, Harlow and Lane (1988) Antіbodіes: A Laboratory Manual, Cold Sprіng Harbor Laboratory, Cold Sprіng Harbor, NY; патент США № 4196265). Таким чином, один аспект даного винаходу стосується антитіл, одноланцюгових молекул, що зв'язують антиген, або інших білків, які специфічно зв'язуються з одним або декількома білками або пептидними молекулами даного винаходу та їх гомологами, гібридами або фрагментами. В особливо переважному варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, викладену в SEQ ІD NO:2 або 4, або її фрагмент. В іншому варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з гібридним білком, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотної послідовності, викладеної в SEQ ІD NO:2 або 4, або її фрагмент. Антитіла даного винаходу можуть застосовуватися для кількісного або якісного визначення вмісту білка або пептидної молекули даного винаходу, або детекції посттрансляційних модифікацій білків. Як використовується у даному документі, про антитіло або пептид кажуть, що вони "специфічно зв'язуються" з молекулою білка або пептиду даного винаходу, якщо таке зв'язування не повністю інгібується присутністю неспоріднених молекул. Змінені або покращені варіанти Відомо, що послідовності ДНК пестицидного білка можуть бути змінені з використанням 9 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 різних способів, а також, що ці альтерації можуть привести до утворення послідовності ДНК, яка кодує білки з амінокислотними послідовностями, що відрізняються від тих, які кодують пестицидні білки згідно з даним винаходом. Даний білок може бути змінений різними способами, у тому числі амінокислотні заміни, делеції, відсікання та вставки однієї або декількох амінокислотних послідовностей з SEQ ІD NO:2 або 4, включаючи до приблизно 2, приблизно 3, приблизно 4, приблизно 5, приблизно 6, приблизно 7, приблизно 8, приблизно 9, приблизно 10, приблизно 15, приблизно 20, приблизно 25, приблизно 30, приблизно 35, приблизно 40, приблизно 45, приблизно 50, приблизно 55, приблизно 60, приблизно 65, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 85, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 105, приблизно 110, приблизно 115, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 135, приблизно 140, приблизно 145, приблизно 150, приблизно 155 або більш амінокислотних замін, делецій або вставок. Способи проведення таких маніпуляцій загалом відомі у даній галузі техніки. Наприклад, варіанти амінокислотної послідовності пестицидного білка можуть бути отримані із застосуванням мутацій у ДНК. Це може також бути досягнуто із застосуванням одного з декількох різновидів мутагенезу та/або шляхом спрямованого розвитку. У деяких аспектах зміни, що кодуються амінокислотними послідовностями, не будуть суттєво впливати на функцію білка. Такі варіанти будують мати необхідну пестицидну активність. Однак зрозуміло, що здатність пестицидного білка забезпечувати пестицидну активність може бути покращена шляхом застосування таких методик щодо композицій даного винаходу. Наприклад, можна експресувати пестицидний білок у клітинах-хазяїнах, які проявляють високі рівні помилок вбудовування основ при реплікації ДНК, такі як XL-1 Red (Stratagene, Ла-Холла, Каліфорнія). Після розмноження в таких штамах можна виділити ДНК (наприклад, шляхом одержання плазмідної ДНК або шляхом ампліфікування за допомогою ПЛР та клонування отриманого у результаті ПЛР- фрагмента у векторі), провести культивування пестицидного білка з мутаціями у немутагенному штамі, та ідентифікувати гени з пестицидною активністю, що зазнали мутації, наприклад шляхом проведення аналізу для дослідження пестицидної активності. Загалом, білок змішується і застосовується в аналізах із згодовуванням. Див., наприклад Marrone et al. (1985) J. of Economіc Entomology 78:290-293. Такі аналізи можуть включати приведення рослини в контакт з одним або декількома шкідниками та визначення здатності рослини до виживання та/або здатності викликати загибель шкідників. Приклади мутацій, які приводять до підвищення токсичності, вказані в Schnepf et al. (1998) Mіcrobіol. Mol. Bіol. Rev. 62:775-806. У якості альтернативи, можуть бути введені альтерації у послідовність багатьох білків у аміно- або карбокси-кінцях, не справляючи при цьому істотного впливу на активність. Такі зміни можуть включати вставки, делеції або зміни, індуковані застосуванням сучасних молекулярних способів, таких як ПЛР, у тому числі ПЛР-ампліфікації, які змінюють або подовжують послідовність, що кодує білок, за рахунок вставок послідовностей, що кодують амінокислоти, в олігонуклеотиди, використовувані в ПЛР-ампліфікації. У якості альтернативи, додані послідовності білків можуть містити цілі послідовності, що кодують білок, такі як ті, які зазвичай застосовуються у даній галузі техніки для одержання гібридних білків. Такі гібридні білки часто використовують для (1) підвищення експресії білка, що представляє інтерес, (2) введення домена зв'язування, ферментативної активності або епітопа для того, щоб полегшити очищення білка, детектування білка або для інших експериментальних застосувань, відомих у даній галузі техніки, (3) спрямовування секреції або трансляції білка в субклітинну органелу, таку як периплазматичний простір грамнегативних бактерій, ендоплазматичний ретикулум еукаріотичних клітин, при цьому останнє часто приводить до глікозилювання білка. Варіанти нуклеотидних та амінокислотних послідовностей даного винаходу також охоплюють послідовності, отримані із застосуванням процедур, що приводять до рекомбінації, і викликають утворення мутацій, таких як перестановка в ДНК. При виконанні такої методики можуть використовуватися одна або декілька різних ділянок, що кодують пестицидні білки, для створення нового пестицидного білка, що має необхідні властивості. Таким чином, бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів створюють з популяції споріднених послідовностей полінуклеотидів, які містять ділянки послідовності, що мають суттєві ідентичності та можуть бути гомологічно рекомбіновані іn vіtro або іn vіvo. Наприклад, при застосуванні даного підходу мотиви послідовностей, що кодують домен, який представляє інтерес, можуть бути піддані перестановці між геном за даним винаходом, що визначає пестицидну активність, та іншими відомими генами, що визначають пестицидну активність, для одержання нового гена, який кодує послідовність білка, що представляє інтерес, з покращеною властивістю, як, наприклад, з підвищеною інсектицидною активністю. Стратегії такої перестановки в ДНК відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Scі. USA 154 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Cramerі et al. 10 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (1997) Nature Bіotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Bіol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Scі. USA 94:4504-4509; Cramerі et al. (1998) Nature 391:288-291; та патенти США №№ 5605793 та 5837458. Переміщення або перестановка доменів є ще одним механізмом створення змінених пестицидних білків. Домени можна переміщати між пестицидними білками, що приводить до утворення гібридних або химерних токсинів з покращеною пестицидною активністю або різними цільовими характеристиками. Способи створення рекомбінантних білків та їх дослідження щодо пестицидної активності добре відомі у даній галузі техніки (див., наприклад, Naіmov et al. (2001) Appl. Envіron. Mіcrobіol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Envіron. Mіcrobіol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Bіol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Bіol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. (1999) Appl. Envіron. Mіcrobіol. 65:2918-2925). Вектори Послідовність даного винаходу, яка визначає пестицидну активність, може бути представлена в експресійній касеті для експресії у рослині, що представляє інтерес. Під "експресійною касетою для рослин" мають на увазі ДНК-конструкт, який здатний приводити до експресії білка з відкритої рамки зчитування у клітині рослини. Зазвичай вони містять промотор та кодуючу послідовність. Часто такі конструкти будують також містити 3'-нетрансльовану ділянку. Такі конструкти можуть містити "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність" для полегшення котрансляційного або посттрансляційного транспорту пептиду до певних внутрішньоклітинних структур, таких як хлоропласт (або інша пластида), ендоплазматичний ретикулум або комплекс Гольджі. Під "сигнальною послідовністю" мають на увазі послідовність, для якої відомо або передбачається, що вона приводить до котрансляційного або посттрансляційного транспорту пептидів через клітинну мембрану. У еукаріот вона зазвичай пов'язана з секрецією у апараті Гольджі з деяким у результаті глікозилюванням. Інсектицидні токсини бактерій часто синтезуються у якості протоксинів, які протеолітично активуються у кишечнику цільової комахи (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). У деяких варіантах здійснення даного винаходу сигнальна послідовність локалізована у нативній послідовності, або може бути отримана з послідовності даного винаходу. Під "лідерною послідовністю" мають на увазі будь-яку послідовність, яка при трансляції приводить до утворення амінокислотної послідовності, достатньої для запуску котрансляційного транспорту пептидного ланцюга до субклітинної органели. Таким чином, лідерні послідовності містять у своєму складі лідерні послідовності, що виявляють спрямований вплив на транспорт та/або глікозилювання за рахунок проходження в ендоплазматичний ретикулум, проходження у вакуолі, пластиди, у тому числі хлоропласти, мітохондрії та їм подібні. Під "трансформаційним вектором для рослин" мають на увазі молекулу ДНК, яка необхідна для ефективної трансформації клітини рослини. Така молекула може містити одну або декілька експресійних касет для рослин та може бути організованою у більше ніж одну "векторну" молекулу ДНК. Наприклад, бінарні вектори являють собою трансформаційні вектори для рослин, які використовують два несуміжних ДНК-вектори для кодування усіх необхідних функцій з активністю в цис- та транс-положеннях для трансформації рослинних клітин (Hellens та Mullіneaux (2000) Trends іn Plant Scіence 5:446-451). Вираз "вектор" відноситься до конструкта нуклеїнової кислоти, призначеного для переносу між різними хазяїнами. "Експресійним вектором" називається вектор, який має здатність вводити, інтегрувати та експресувати послідовності гетерологічної ДНК або її фрагменти у чужорідній клітині. Касета буде мати у своєму складі 5' та/або 3' регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з послідовністю даного винаходу. Під "функціонально зв'язаним" мають на увазі функціональний зв'язок між послідовністю промотору та другою послідовністю, де послідовність промотору ініціює і опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, відповідної другій послідовності. Загалом, вираз "функціонально зв'язаний" означає, що зв'язані нуклеотидні послідовності є суміжними і, у тих випадках, коли необхідно об'єднати дві ділянки, що кодують білок, вони є суміжними та перебувають в одній і тій же рамці зчитування. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий ген, що підлягає котрансформації у організм. У якості альтернативи, додатковий ген(и) забезпечують за допомогою численних експресійних касет. У різних варіантах здійснення нуклеотидна послідовність даного винаходу є функціонально зв'язаною з промотором, наприклад, з рослинним промотором. "Промотором" називається нуклеотидна послідовність, функція якої полягає у керуванні транскрипцією нижче розташованої кодуючої послідовності. Промотор разом з іншими транскрипційними та трансляційними регуляторними нуклеотидними послідовностями (які також називаються "контрольними 11 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностями") необхідні для експресії послідовності ДНК, що представляє інтерес. Така експресійна касета забезпечується численними ділянками рестрикції для вставки послідовності, яка забезпечує пестицидну активність, що підлягає транскрипційній регуляції регуляторними ділянками. Експресійна касета буде мати у своєму складі в 5'-3' напрямку транскрипції ділянку ініціації транскрипції і трансляції (тобто, промотор), ДНК-послідовність даного винаходу та ділянку термінації трансляції і транскрипції (тобто, ділянка термінації), що функціонує у рослині. Промотор може бути нативним або аналогічним, або може бути чужорідним або гетерологічним щодо рослини-хазяїна та/або щодо послідовності ДНК даного винаходу. Додатково, промотор може являти собою природню послідовність або, у якості альтернативи, синтетичну послідовність. Там, де промотор є "нативним" або "гомологічним" щодо рослини-хазяїна, мають на увазі, що промотор виявляють у нативній рослині, у яку цей промотор вводять. Там, де промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" щодо послідовності ДНК даного винаходу, мають на увазі, що промотор не є нативним або є таким, що виникає у природних умовах, для функціонально зв'язаної послідовності ДНК даного винаходу. Ділянка термінації може бути нативною з ділянкою ініціації транскрипції, може бути нативною з функціонально зв'язаною послідовністю ДНК, що представляє інтерес, може бути нативною з рослиною-хазяїном, або може бути отримана з іншого джерела (тобто, чужорідного або гетерологічного щодо промотору, послідовності ДНК, що представляє інтерес, рослинихазяїна або будь-якої їх комбінації). Придатні ділянки термінації можуть бути отримані з Tіплазміди A. tumefacіens, такі як ділянки термінації октопінсинтази та нопалінсинтази. Див. також Guerіneau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleіc Acіds Res. 17:7891-7903; та Joshі et al. (1987) Nucleіc Acіd Res. 15:9627-9639. У необхідних випадках ген(и) можуть бути оптимізовані для підвищення експресії у трансформованій клітині-хазяїні. Таким чином, гени можуть бути синтезовані з використанням переважних для клітини-хазяїна кодонів для покращення експресії, або можуть бути синтезовані з використанням кодонів за частоти використання кодонів, переважних для хазяїна. У цілому, вміст GC у гені підвищиться. Див., наприклад, Campbell and Gowrі (1990) Plant Physіol. 92:1-11, де обговорюється застосування переважних для хазяїна кодонів. У даній галузі техніки існують способи синтезу переважних для рослини генів. Див., наприклад, патенти США №№ 5380831 та 5436391, публікацію патенту США № 20090137409 та Murray et al. (1989) Nucleіc Acіds Res. 17:477-498, які включено у даний документ за допомогою посилання. У одному варіанті здійснення пестицидний білок спрямовують у хлоропласт для експресії. Таким чином, у тих випадках, де пестицидний білок не вводиться безпосередньо в хлоропласт, експресійна касета буде додатково містити нуклеїнову кислоту, що кодує транзитний пептид, який спрямовує пестицидний білок у хлоропласти. Такі транзитні пептиди відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Von Heіjne et al. (1991) Plant Mol. Bіol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Bіol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cіoppa et al (1987) Plant Physіol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Bіochem. Bіophys. Res. Commun. 196:1414-1421; та Shah et al. (1986) Scіence 233:478-481. Ген, що визначає пестицидну активність, який повинен бути спрямований у хлоропласт, може бути оптимізований для експресії у хлоропласті для обліку відмінностей між ядром рослини і даної органели при використанні кодону. Таким чином, нуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, можуть бути синтезовані з використанням кодонів, переважних для хлоропластів. Див., наприклад, патент США № 5380831, який включено у даний документ за допомогою посилання. Трансформація рослин Способи даного винаходу включають введення нуклеотидного конструкта у рослину. Під "введенням" мають на увазі забезпечення рослининуклеотидним конструктом таким чином, щоб конструкт одержав доступ до внутрішнього простору клітини рослини. Способи даного винаходу не вимагають застосування конкретного способу введення нуклеотидного конструкта у рослину, а лише, щоб даний нуклеотидний конструкт одержав доступ до внутрішнього простору щонайменше однієї клітини рослини. У даній галузі техніки відомі способи введення нуклеотидних конструктів у рослини, включаючи, але без обмежень, способи стабільної трансформації, способи тимчасової трансформації та способи, опосередковані вірусами. Під "рослиною" мають на увазі цілі рослини, органі рослини (наприклад, листя, стебла, коріння тощо), насіння, рослинні клітини, паростки, зародки та потомство даних рослин. Рослинні клітини можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калюс, суспензія культури клітин, протопласти, клітини листя, клітини кореня, клітини флоеми, 12 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пилок). "Трансгенні рослини" або "трансформовані рослини" або "стабільно трансформовані" рослини або клітини або тканини відносяться до рослин, які мають введені або інтегровані в рослинну клітину екзогенні нуклеотидні послідовності або фрагменти ДНК. Дані нуклеотидні послідовності мають у своєму складі такі, які є екзогенними, або не представлені у нетрансформованій рослинній клітині, а також такі, які можуть бути ендогенними, або бути присутніми у нетрансформованій рослинній клітині. "Гетерологічний" загалом відноситься до нуклеотидних послідовностей, які не є ендогенними щодо клітини або не є частиною нативного генома, у якому вони присутні, та які були внесені в клітину шляхом зараження, трансфекції, мікроін'єкції, електропорації, бомбардування мікрочастинками тощо. Трансгенні рослини даного винаходу експресують одну або декілька нових послідовностей токсинів, що розкриваються у даному документі. У різних варіантах здійснення трансгенна рослина додатково містить один або декілька додаткових генів стійкості до комах (наприклад, Cry1, такі як представники родин Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E та Cry1F; Cry2, такі як представники родин Cry2A; Cry9, такі як представники родин Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E та Cry9F тощо). Фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що трансгенні рослини можуть містити будь-який ген, який наділяє сільськогосподарською ознакою, що представляє інтерес. Трансформацію рослинних клітин може бути здійснено із застосуванням одного або декількох методів, відомих у даній галузі техніки. Ген, що визначає пестицидну активність, згідно з даним винаходом може бути модифікований для одержання або підвищення експресії у клітинах рослин. Як правило, конструкт, який експресує такий білок, містить промотор, що регулює транскрипцію гена, а також 3' нетрансльовану ділянку, яка забезпечує термінацію транскрипції та поліаденілювання. Структура таких конструктів добре відома у даній галузі техніки. У деяких випадках доцільним може бути конструювання гена таким чином, що це буде приводити до секреції синтезованого у результаті пептиду або іншої спрямованої дії у клітині рослини. Наприклад, ген може бути сконструйований таким чином, щоб містити сигнальний пептид для полегшення переносу пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Також переважним може бути конструювання експресійної касети, що містить інтрон, таким чином, що іРНКпроцесинг даного інтрона необхідний для експресії. Як правило, дана "експресійна касета для рослин" буде введена у "трансформувальний вектор для рослин". Даний трансформувальний вектор для рослин може містити один або декілька ДНК-векторів, необхідних для досягнення трансформації рослини. Наприклад, звичайною практикою у даній галузі техніки є використання трансформувальних векторів для рослин, які містять більше одного суміжного сегмента ДНК. У даній галузі техніки ці вектори часто називають "бінарними векторами." Бінарні вектори, як і вектори з хелперними плазмідами найчастіше використовуються для опосередкованої Agrobacterіum трансформації, де розмір та сумарна довжина сегментів ДНК, необхідних для досягнення ефективної трансформації, є досить великими, та доцільно розділити функції за окремими молекулам ДНК. Бінарні вектори, як правило, містять плазмідний вектор, який містить цис-активні послідовності, необхідні для переносу T-DNA (такі як розташовані на лівій межі та на правій межі фрагмента), селективний маркер, який сконструйований таким чином, щоб бути здатним до експресії у клітині рослини, та "ген, що представляє інтерес, " (ген, сконструйований таким чином, щоб бути здатним до експресії у рослинній клітині, для якої потрібне створення трансгенних рослин). Також у даному плазмідному векторі присутні послідовності, необхідні для реплікації бактерій. Цис-активні послідовності організовані таким чином, що забезпечує ефективне перенесення у рослинні клітини та експресії в них. Наприклад, ген селективного маркера та ген, що визначає пестицидну активність, локалізовані між лівою та правою межами. Часто другий плазмідний вектор містить транс-активні фактори, які опосередковують перенесення T-DNA від Agrobacterіum у рослинні клітини. Плазміда часто містить гени вірулентності (гени Vіr), які забезпечують інфікування рослинних клітин з використанням Agrobacterіum та перенесення ДНК шляхом розщеплення межових послідовностей та vіr-опосредованому переносі ДНК, як відомо у даній галузі техніки (Hellens and Mullіneaux (2000) Trends іn Plant Scіence 5:446-451). Кілька типів штамів Agrobacterіum (наприклад, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 тощо) можуть бути використані для трансформації рослин. Другий плазмідний вектор не є необхідним для трансформації рослини із застосуванням інших способів, таких як бомбардування мікрочастинками, мікроін'єкція, електропорація, трансфекція за допомогою поліетиленгліколю тощо. Загалом, способи трансформації рослин включають перенесення гетерологічної ДНК у цільові рослинні клітини (наприклад, у незрілі або зрілі зародки, суспензійні культури, недиференційований калюс, протопласти тощо) з наступним застосуванням відповідного 13 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відбору з максимальним граничним рівнем відповідного відбору (залежно від селективного маркерного гена) для того, щоб виділити трансформовані рослинні клітини з групи нетрансформованої клітинної маси. Експлантати зазвичай переносять у свіжу порцію такого ж культурального середовища та культивують стандартно. Далі трансформовані клітини диференціюються у пагони після їх поміщення на регенераційне середовище, у яке додано засіб для селекції у концентрації максимального граничного рівня. Пагони потім переносять на селективне середовище для укорінення для укорінення пагона або саджанця. Трансгенний саджанець потім виростає у зрілу рослину та продукує фертильне насіння (наприклад, Hіeі et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Іshіda et al. (1996) Nature Bіotechnology 14:745-750). Експлантати, як правило, переносять у свіжу порцію такого ж культурального середовища і стандартно культивують. Загальний опис методик та способів одержання трансгенних рослин наведено в Ayres and Park (1994) Crіtіcal Revіews іn Plant Scіence 13:219-239 та Bommіnenі and Jauhar (1997) Maydіca 42:107-120. Через те що трансформований матеріал містить численні клітини, як трансформовані, так і нетрансформовані клітини присутні у будь-якій частині обробленого цільового калюса або тканини або групи клітин. Здатність викликати загибель нетрансформованих клітин та дозволяти проліферацію трансформованих клітин дозволяє одержати культури трансформованих рослин. Часто, здатність до видалення нетрансформованих клітин є обмеженням для швидкого виділення трансформованих рослинних клітин та успішного створення трансгенних рослин. Протоколи трансформації, а також протоколи для введення нуклеотидних послідовностей у рослини можуть варіювати залежно від типу рослини або рослинної клітини, тобто, однодольна або дводольна, призначених для трансформації. Створення трансгенних рослин можна здійснювати із застосуванням одного з декількох способів, включаючи, але без обмежень, мікроін'єкцію, електропорацію, спрямоване перенесення генів, введення гетерологічної ДНК за допомогою Agrobacterіum у рослинні клітини (опосередкована Agrobacterіum трансформація), бомбардування рослинних клітин гетерологічною чужорідною ДНК, кон'югованою з частинками, способом прискорених частинок, трансформація із застосуванням аерозольного пучкового інжектора (опублікована заявка на патент США № 20010026941; патент США № 4945050; міжнародна публікація № WO 91/00915; опублікована заявка на патент США № 2002015066), Lec 1-трансформація та різні інші способи переносу ДНК, не опосередковані прямим введенням часток. Способи для трансформації хлоропластів відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Scі. USA 87:8526-8530; Svab and Malіga (1993) Proc. Natl. Acad. Scі. USA 90:913-917; Svab and Malіga (1993) EMBO J. 12:601-606.Даний спосіб базується на використанні генної гармати для доставки ДНК, що містить селективний маркер, та спрямованого введення ДНК у геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації. Додатково, трансформація пластид може бути досягнута за допомогою транс-активації мовчазного, пластидного трансгена за рахунок тканино-переважної експресії пластидної, ядерної РНК-полімерази. Таку систему описано у McBrіde et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Scі. USA 91:7301-7305. Після інтеграції гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини використовують відповідний відбір з максимальним граничним рівнем відповідного відбору у середовищі, щоб викликати загибель нетрансформованих клітин та відокремити, а також викликати проліферацію передбачувано трансформованих клітин, які виживають у результаті даної селекційної обробки, шляхом регулярного перенесення клітин у свіже середовище. За допомогою безперервного пасажу та введення відповідного засобу для відбору ідентифікують та стимулюють проліферацію клітин, які були трансформовані за допомогою плазмідного вектора. Молекулярні та біохімічні способи потім можуть бути використані для підтвердження присутності інтегрованого гетерологічного гена, що представляє інтерес, у геномі трансгенної рослини. Клітини, які були трансформовані, можна виростити у рослини відповідно до загальноприйнятих способів. Див., наприклад, McСormіck et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Дані рослини потім можна вирощувати та або запилювати такою ж трансформованою лінією, або іншою лінією, а отриманий у результаті гібрид, що має конститутивну експресію необхідної фенотипічної характеристики, може бути ідентифікований. Два або більше поколінь можуть бути вирощені для того, щоб впевнитися, що експресія необхідної фенотипічної ознаки стабільно зберігається та успадковується, а потім насіння збирають для того, щоб впевнитися, що експресія бажаної фенотипічної ознаки була досягнута. Таким чином, даний винахід забезпечує трансформоване насіння (також називають "трансгенне насіння"), що містить нуклеотидний конструкт за даним винаходом, наприклад, експресійну касету за даним винаходом, стабільно вбудований у їх геном. 14 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Оцінка трансформації рослин Після введення гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини, підтверджують трансформацію або інтеграцію гетерологічного гена у геном рослин різними способами, такими як аналіз нуклеїнових кислот, білків та метаболітів, асоційованих з інтегрованим геном. ПЛР-аналіз являє собою експрес-методику скринінгу трансформованих клітин, тканини або пагонів на присутність введеного гена на більш ранній стадії до пересаджування в ґрунт (Sambrook and Russell (2001) Molecular Clonіng: A Laboratory Manual. Cold Sprіng Harbor Laboratory Press, Cold Sprіng Harbor, NY). ПЛР здійснюють з використанням олігонуклеотидних праймерів, специфічних до гена, що представляє інтерес, або фону вектора Agrobacterіum тощо. Трансформацію рослин можна підтвердити за допомогою Саузерн-блот аналізу геномної ДНК (Sambrook and Russell, 2001, supra). Загалом, загальну ДНК екстрагують із трансформанта, розщеплюють за допомогою відповідних рестрикційних ферментів, фракціонують в агарозному гелі та переносять на нітроцелюлозну або нейлонову мембрану. Мембрану або "блот" далі досліджують за допомогою, наприклад, міченого радіоактивним 32 P фрагментом цільової ДНК для підтвердження інтеграції введеного гена у геном рослин згідно з стандартними методиками (Sambrook and Russell, 2001, supra). У нозерн-блот аналізі виділяють РНК із спеціальних тканин трансформанта, фракціонують в агарозному гелі, що містить формальдегід, та переносять на нейлоновий фільтр згідно із стандартними процедурами, які регулярно використовують у даній галузі техніки (Sambrook and Russell, 2001, supra). Потім досліджують експресію РНК, яка кодується геном, що визначає пестицидну активність, шляхом гібридизації на фільтрі з радіоактивним зондом, отриманої з гена, що визначає пестицидну активність, за допомогою способів, відомих у даній галузі техніки (Sambrook and Russell, 2001, supra). Підтвердження присутності білка, який кодується геном, що визначає пестицидну активність, можна здійснювати на трансгенних рослинах з використанням стандартних процедур вестернблота, біохімічних аналізів та ним подібних на трансгенних рослинах (Sambrook and Russell, 2001, supra) з використанням антитіл, які зв'язуються з одним або декількома епітопами, які присутні на пестицидному білку. Пестицидна активність у рослин В іншому аспекті даного винаходу можна створити трансгенні рослини, у яких експресується пестицидний білок, який має пестицидну активність. Для створення трансгенних рослин можна використовувати способи, описані вище як приклад, але спосіб, за яким отримують трансгенні рослинні клітини, не є критично важливим для даного винаходу. На розсуд експериментатора можна застосовувати способи, відомі або описані в даній галузі техніки, такі як опосередкована Agrobacterіum трансформація, біолістична трансформація та способи, не опосередковані частинками. Рослини, що експресують пестицидний білок, можна виділити за допомогою загальновідомих способів, описаних у даній галузі техніки, наприклад, за допомогою трансформації калюсу, відбору трансформованого калюсу та регенерації плодоносної рослини з такого трансгенного калюсу. У такому способі можна використовувати будь-який ген у якості селективного маркера за умови, що його експресія у рослинних клітинах надасть можливість для ідентифікації або відбору трансформованих клітин. Для застосування у рослинних клітинах було розроблено цілий ряд маркерів, таких як стійкість до хлорамфеніколу, аміноглікозиду G418, гігроміцину або їм подібним. Також у якості селективних маркерів можна використовувати інші гени, які кодують продукт, залучений до метаболізму хлоропластів. Наприклад, окреме використання можуть знайти гени, які забезпечують стійкість до гербіцидів для рослин, таким як гліфосат, бромоксиніл або імідазолінон. Такі гени було описано (Stalker et al. (1985) J. Bіol. Chem. 263:6310-6314 (ген нітрилази, яка надає стійкість до бромоксинілу); та Sathasіvan et al. (1990) Nucl. Acіds Res. 18:2188 (ген AHAS, який надає стійкість до імідазолінонів). Додатково гени, розкриті у даному документі, є придатними у якості маркерів для оцінки трансформації бактеріальних або рослинних клітин. Способи виявлення присутності трансгена у рослині, органі рослини (наприклад, листі, стеблах, корінні тощо), насінні, рослинній клітині, паростку, зародку або їх потомстві добре відомі у даній галузі техніки. В одному варіанті здійснення присутність трансгена виявляють шляхом дослідження пестицидної активності. Плодоносні рослини, у яких експресується пестицидний білок, можна досліджувати на пестицидну активність, та для подальшого схрещування можна проводити відбір рослин, у яких проявляється оптимальна активність. У даній галузі техніки доступні способи аналізу на пестицидну активність. Зазвичай білок перемішують та використовують у аналізах із згодовуванням. Дивись, наприклад Marrone et al. (1985) J. of Economіc Entomology 78:290-293. 15 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід можна застосовувати для трансформації будь-якого виду рослин, включаючи, але без обмежень, однодольні та дводольні рослини. Приклади рослин, які представляють інтерес, включають, але без обмежень, кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, помідор, хрестоцвіті, перцеві, картоплю, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь та олійний рапс, Brassіca sp., люцерну, жито, просо, сафлор, земляні горіхи, солодку картоплю, маніок, кавове дерево, кокос, ананас, цитрусові дерева, дерево какао, чайний кущ, банан, авокадо, фігове дерево, гуаву, мангове дерево, маслину, папайю, кеш'ю, макадамію, мигдаль, овес, овочі, декоративні рослини та хвоїні. Овочі включають, але без обмежень, помідори, латук, зелену квасолю, квасолю ліма, види гороху та представників роду Curcumіs, таких як огірок, канталупа та мускусна диня. Декоративні рослини включають, але без обмежень, азалію, гортензію, гібіскус, троянди, тюльпани, жовті нарциси, петунію, гвоздику, пуансетію та хризантему. Переважно рослини даного винаходу являють собою культурні рослини (наприклад, маїс, сорго, пшениця, соняшник, помідор, хрестоцвіті, перцеві, картопля, бавовник, рис, соя, цукровий буряк, цукрова тростина, тютюн, ячмінь, олійний рапс тощо). Застосування у боротьбі зі шкідниками У даній галузі техніки відомі загальні способи використання штамів, які містять нуклеотидну послідовність даного винаходу або її варіант, у якості пестицидних засобів у боротьбі зі шкідниками або при створенні інших організмів. Дивись, наприклад, патент США № 5039523 та EP 0480762A2. Штами Bacіllus, що містять нуклеотидну послідовність даного винаходу або її варіант, або мікроорганізми, які генетично змінювали таким чином, щоб вони містили ген, який визначає пестицидну активність, за даним винаходом та білок, можна застосовувати для захисту сільськогосподарських культур та продуктів від шкідників. У одному аспекті даного винаходу, цільні, тобто нелізовані клітини організму, що продукує токсин (пестицид), обробляють реактивами, які пролонгують активність токсину, що продукується у клітині, якщо клітину поміщають у середовище цільового шкідника (шкідників). У якості альтернативи, пестицид отримують за рахунок введення гена, що визначає пестицидну активність, у клітину-хазяїна. Експресія гена, що визначає пестицидну активність, прямо або опосередковано приводить до внутрішньоклітинної продукції та підтримці рівня пестициду. У одному аспекті даного винаходу дані клітини потім обробляють в умовах, які пролонгують активність токсину, що продукується у клітині, якщо клітину поміщають у середовище цільового шкідника (шкідників). Отриманий у результаті продукт зберігає токсичність, характерну для токсину. З цих інкапсульованих природним чином пестицидів можна потім скласти препарат відповідно до традиційних методик для внесення в середовище проживання цільового шкідника, наприклад, ґрунт, воду та на листя рослин. Дивись, наприклад, EPA 0192319 та посилання, які цитуються у ньому. У якості альтернативи, можна скласти препарат з клітин, що екпресують ген згідно з даним винаходом, таким чином, щоб забезпечити застосування отриманого у результаті матеріалу у якості пестициду. Активні інгредієнти даного винаходу зазвичай наносять у формі композицій, та їх можна наносити одночасно або послідовно з іншими сполуками на посівну площу або рослину, що підлягають обробці. Цими сполуками можуть бути добрива, гербіциди, кріопротектори, поверхнево-активні речовини, детергенти, пестицидні мила, масла, використовувані у період спокою, полімери та/або склади з носіями, що повільно вивільнюються або здатні до біологічного розкладання, які дають можливість довгострокового дозованого вивільнення у цільовій області після разового внесення складу. Вони також можуть являти собою селективні гербіциди, хімічні інсектициди, віруциди, мікробіциди, амебіциди, пестициди, фунгіциди, бактерициди, нематоциди, молюскоциди або суміші декількох даних препаратів, якщо потрібно, разом з додатковими сільськогосподарськоприйнятними носіями, поверхнево-активними речовинами або допоміжними речовинами, що сприяють нанесенню, які зазвичай використовують у даній галузі складання. Придатні носії та допоміжні речовини можуть бути твердими або рідкими та відповідають речовинам, які зазвичай використовують у технології складання, наприклад, натуральні або відновлені мінеральні речовини, розчинники, диспергувальні речовини, засоби, що змочують, речовини, що надають липкість, речовини, що зв'язують, або добрива. Подібним чином склади можна приготувати у формі їстівних "принад", або їм можна надати форму "пасток" для шкідників, щоб забезпечити можливість згодовування або поглинання пестицидного складу цільовим шкідником. Способи нанесення активного інгредієнта даного винаходу або агрохімічної композиції даного винаходу, яка містить щонайменше один з пестицидних білків, що продукуються 16 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бактеріальними штамами даного винаходу, включають нанесення на листя, покриття насіння та внесення в ґрунт. Кількість нанесень та норма нанесення залежить від інтенсивності зараження відповідним шкідником. Композицію можна складати у вигляді порошку, дусту, пелети, гранули, аерозолю емульсії, колоїду, розчину або їм подібних та можна одержати за допомогою таких традиційних способів, як сушіння, ліофілізація, гомогенізація, екстракція, фільтрація, центрифугування, осадження або концентрування культури клітин, що містять поліпептид. В усіх таких композиціях, які містять щонайменше один такий пестицидний поліпептид, даний поліпептид може бути присутнім у концентрації від приблизно 1 % до приблизно 99 % за масою. За допомогою способів даного винаходу на даній площі можна знищувати або зменшувати кількості лускокрилих, напівтвердокрилих, двокрилих або твердокрилих шкідників, або їх можна використовувати профілактично у навколишньому середовищі для запобігання зараженню чутливим шкідником. Переважно шкідник поглинає або контактує з пестицидно-ефективною кількістю поліпептиду. Під "пестицидно-ефективною кількістю" мають на увазі кількість пестициду, що здатна викликати загибель щонайменше одного шкідника або помітно обмежувати ріст шкідника, харчування або нормальний фізіологічний розвиток. Дана кількість буде варіювати залежно від таких факторів, як, наприклад, конкретні цільові шкідники, що підлягають контролю, конкретне навколишнє середовище, місцезнаходження, рослина, культура або сільськогосподарська ділянка, що підлягає обробці, умови навколишнього середовища та спосіб, норма, концентрація, стабільність та кількість нанесення пестицидноефективної композиції поліпептиду. Склади можна також варіювати з урахуванням кліматичних умов, впливу на навколишнє середовище та/або частоти нанесення та/або тяжкості зараження шкідниками. Описані пестицидні композиції можна приготувати шляхом складання препарату або з бактеріальної клітини, кристала та/або суспензії спор, або з виділеного білкового компонента з необхідним сільськогосподарсько-прийнятним носієм. Композиції можна складати перед застосуванням за допомогою відповідних способів, таких як ліофілізація, висушування сублімацією, сушіння, або у водному носії, середовищі або придатному розріджувачі, такому як сольовий розчин або інший буфер. Складені композиції можуть бути у формі дусту або гранульованого матеріалу, або суспензії у рослинній олії або мінеральному маслі, або водних, або масляних/водних емульсій, або у якості порошку, що змочується, або у комбінації з будьякою іншою речовиною-носієм, що придатна для застосування у галузі сільського господарства. Придатні носії для сільського господарства можуть бути твердими або рідкими, та вони добре відомі у даній галузі техніки. Вираз "сільськогосподарсько-придатний носій" охоплює усі допоміжні речовини, інертні компоненти, диспергувальні речовини, поверхнево-активні речовини, речовини, що надають липкість, речовини, що зв'язують, тощо, які зазвичай застосовують у технології складання пестицидних препаратів; вони добре відомі фахівцям у даній галузі складання пестицидних препаратів. Дані склади можна змішувати з одним або декількома твердими або рідкими допоміжними речовинами та одержувати різними способами, наприклад, шляхом рівномірного змішування, перемішування та/або подрібнення пестицидної композиції з придатними допоміжними речовинами із застосуванням традиційних методик складання. Придатні склади та способи нанесення описано у патенті США № 6468523, який включено у даний документ за допомогою посилання. "Шкідник" включає, але без обмежень, комах, грибів, бактерій, нематод, кліщів, іксодових кліщів та їм подібних. Комахи-шкідники включають комах, вибраних із рядів Coleoptera, Dіptera, Hymenoptera, Lepіdoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemіptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Іsoptera, Anoplura, Sіphonaptera, Trіchoptera тощо, зокрема, Coleoptera, Lepіdoptera, Dіptera. Ряд Coleoptera включає підряди Adephaga та Polyphagа. Підряд Adephaga включає надродини Caraboіdea та Gyrіnoіdea, у тої час як підряд Polyphaga включає надродини Hydrophіloіdea, Staphylіnoіdea, Cantharoіdea, Cleroіdea, Elateroіdea, Dascіlloіdea, Dryopoіdea, Byrrhoіdea, Cucujoіdea, Meloіdea, Mordelloіdea, Tenebrіonoіdea, Bostrіchoіdea, Scarabaeoіdea, Cerambycoіdea, Chrysomeloіdea та Curculіonoіdea. Надродина Caraboіdea включає родини Cіcіndelіdae, Carabіdae та Dytіscіdae. Надродина Gyrіnoіdea включає родини Gyrіnіdae. Надродина Hydrophіloіdea включає родину Hydrophіlіdae. Надродина Staphylіnoіdea включає родини Sіlphіdae та Staphylіnіdae. Надродина Cantharoіdea включає родини Cantharіdae та Lampyrіdae. Надродина Cleroіdea включає родини Clerіdae та Dermestіdae. Надродина Elateroіdea включає родини Elaterіdae та Buprestіdae. Надродина Cucujoіdea включає родину Coccіnellіdae. Надродина Meloіdea включає родину Meloіdae. Надродина Tenebrіonoіdea 17 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включає родину Tenebrіonіdae. Надродина Scarabaeoіdea включає родини Passalіdae та Scarabaeіdae. Надродина Cerambycoіdea включає родину Cerambycіdae. Надродина Chrysomeloіdea включає родину Chrysomelіdae. Надродина Curculіonoіdea включає родини Curculіonіdae та Scolytіdae. Ряд Dіptera включає підряди Nematocera, Brachycera та Cyclorrhapha. Підряд Nematocera включає родини Tіpulіdae, Psychodіdae, Culіcіdae, Ceratopogonіdae, Chіronomіdae, Sіmulііdae, Bіbіonіdae та Cecіdomyііdae. Підряд Brachycera включає родини Stratіomyіdae, Tabanіdae, Therevіdae, Asіlіdae, Mydіdae, Bombylііdae та Dolіchopodіdae. Підряд Cyclorrhapha включає секції Aschіza та Aschіza. Секція Aschіza включає родини Phorіdae, Syrphіdae та Conopіdae. Секція Aschіza включає підсекції Acalyptratae та Calyptratae. Секція Acalyptratae включає родини Otіtіdae, Tephrіtіdae, Agromyzіdae та Drosophіlіdae. Секція Calyptratae включає родини Hіppoboscіdae, Oestrіdae, Tachіnіdae, Anthomyііdae, Muscіdae, Callіphorіdae та Sarcophagіdae. Ряд Lepіdoptera включає родини Papіlіonіdae, Pіerіdae, Lycaenіdae, Nymphalіdae, Danaіdae, Satyrіdae, Hesperііdae, Sphіngіdae, Saturnііdae, Geometrіdae, Arctііdae, Noctuіdae, Lymantrііdae, Sesііdae та Tіneіdae. Комахи-шкідники згідно з даним винаходом для основних культур включають: маїс: Ostrіnіa nubіlalіs, європейського кукурудзяного метелика; Agrotіs іpsіlon, совку-іпсилон; Helіcoverpa zea, кукурудзяну совку; Spodoptera frugіperda, совку трав'яну; Dіatraea grandіosella, вогнівку кукурудзяну південно-західну; Elasmopalpus lіgnosellus, зернового точильника; Dіatraea saccharalіs, вогнівку цукрового очерету; Dіabrotіca vіrgіfera, західного кукурудзяного кореневого жука; Dіabrotіca longіcornіs barberі, північного кукурудзяного кореневого жука; Dіabrotіca undecіmpunctata howardі, південного кукурудзяного кореневого жука; Melanotus spp., жуківковаликів; Cyclocephala borealіs, хрущика північного (личинку хруща); Cyclocephala іmmaculata, хрущика південного (личинку хруща); Popіllіa japonіca, хрущика японського; Chaetocnema pulіcarіa, земляну кукурудзяну блішку; Sphenophorus maіdіs, кукурудзяного довгоносика; Rhopalosіphum maіdіs, кукурудзяну листову попелицю; Anuraphіs maіdіradіcіs, кукурудзяну кореневу попелицю; Blіssus leucopterus leucopterus, клопа-черепашку пшеничного північноамериканського; Melanoplus femurrubrum, червононогу кобилку; Melanoplus sanguіnіpes, кобилку, що мігрує; Hylemya platura, личинку паросткової мухи; Agromyza parvіcornіs, мільпістрянку кукурудзяну; Anaphothrіps obscrurus, трипса злакового; Solenopsіs mіlesta, мурахукрадія; Tetranychus urtіcae, звичайного павутинного кліща; сорго: Chіlo partellus, соргового точильника; Spodoptera frugіperda, совку трав'яну; Helіcoverpa zea, кукурудзяну совку; Elasmopalpus lіgnosellus, маленького точильника кукурядзяного стебла; Feltіa subterranea, гусеницю озимої совки; Phyllophaga crіnіta, личинку хруща; Eleodes, Conoderus та Aeolus spp., дротяників; Oulema melanopus, п'явицу червоногруду; Chaetocnema pulіcarіa, кукурудзяну блішку; Sphenophorus maіdіs, кукурудзяного довгоносика; Rhopalosіphum maіdіs; кукурудзяну листову попелицю; Sіpha flava, жовту попелицю цукрового очерету; Blіssus leucopterus leucopterus, клопа-черепашку пшеничного північноамериканського; Contarіnіa sorghіcola, галівницю соргову; Tetranychus cіnnabarіnus, червоного павутинного кліща; Tetranychus urtіcae, звичайного павутинного кліща; пшениця: Pseudaletіa unіpunctata, совку лугову; Spodoptera frugіperda, совку трав'яну; Elasmopalpus lіgnosellus, маленького точильника кукурудзяного стебла; Agrotіs orthogonіa, прямокутну совку; Elasmopalpus lіgnosellus, маленького точильника кукурудзяного стебла; Oulema melanopus, п'явицу червоногруду; Hypera punctata, довгоносика листяного конюшинового; Dіabrotіca undecіmpunctata howardі, південного кукурудзяного кореневого жука; російську пшеничну попелицю; Schіzaphіs gramіnum, звичайну злакову попелицю; Macrosіphum avenae, велику злакову попелицю; Melanoplus femurrubrum, червононогу кобилку; кобилку виду Melanoplus dіfferentіalіs; Melanoplus sanguіnіpes кобилку, що мігрує; Mayetіola destructor, гесенську муху; Sіtodіplosіs mosellana, оранжеву злакову галівницю; Meromyza amerіcana, личинку американської меромізи; Hylemya coarctata, озиму муху; Franklіnіella fusca, тютюнового трипса; Cephus cіnctus, хлібного пильщика; Acerіa tulіpae, кліщ цибульний чотириногий; соняшник: Suleіma helіanthana, соняшникову брунькову листовійку; Homoeosoma electellum, соняшникову вогнівку; zygogramma exclamatіonіs, соняшникову окличну совку; Bothyrus gіbbosus, моркв'яного жука; Neolasіoptera murtfeldtіana, галицю соняшникового насіння; бавовник: Helіothіs vіrescens, бавовникову листовійку; Helіcoverpa zea, бавовникову совку; Spodoptera exіgua, совку малу; Pectіnophora gossypіella, рожевого бавовникового хробака; Anthonomus grandіs, бавовникового довгоносика; Aphіs gossypіі, бавовникову попелицю; Pseudatomoscelіs serіatus, бавовникового гедзя; Trіaleurodes abutіlonea, бавовникову білокрилку; Lygus lіneolarіs, трав'яного клопа; Melanoplus femurrubrum, червононогу кобилку; кобилку виду Melanoplus dіfferentіalіs; Thrіps tabacі, цибулевого трипса; Franklіnkіella fusca, тютюнового трипса; Tetranychus cіnnabarіnus, червоного павутинного кліща; Tetranychus urtіcae, звичайного 18 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 павутинного кліща; рис: Dіatraea saccharalіs, точильника цукрового очерету; Spodoptera frugіperda, совку трав'яну; Helіcoverpa zea, кукурудзяну совку; листоїда виду Colaspіs brunnea; Lіssorhoptrus oryzophіlus, рисового водяного довгоносика; Sіtophіlus oryzae, рисового довгоносика; Nephotettіx nіgropіctus, рисову цикадку; Blіssus leucopterus leucopterus, клопачерепашку пшеничного північноамериканського; Acrosternum hіlare, зеленого клопа-щитника; соя: Pseudoplusіa іncludens, соєвого п'ядака; Antіcarsіa gemmatalіs, гусеницю совки оксамитових бобів; Plathypena scabra, зеленого шкідника конюшини; Ostrіnіa nubіlalіs, європейського кукурудзяного метелика; Agrotіs іpsіlon, совку-іпсилон; Spodoptera exіgua, совку малу; Helіothіs vіrescens, бавовникову листовійку; Helіcoverpa zea, кукурудзяну совку; Epіlachna varіvestіs, мексиканську бобову зерновку; Myzus persіcae, зелену персикову попелицю; Empoasca fabae, цикадку картопляну; Acrosternum hіlare, зеленого клопа-щитника; Melanoplus femurrubrum, червононогу кобилку; кобилку виду Melanoplus dіfferentіalіs, ; Hylemya platura, личинку паросткової мухи; Serіcothrіps varіabіlіs, трипса соєвого; Thrіps tabacі, трипса цибульного; Tetranychus turkestan, туркестанського павутинного кліща; Tetranychus urtіcae, звичайного павутинного кліща; ячмінь: Ostrіnіa nubіlalіs, європейського кукурудзяного метелика; Agrotіs іpsіlon, совку-іпсилон; Schіzaphіs gramіnum, звичайну злакову попелицю; Blіssus leucopterus leucopterus, клопа-черепашку пшеничного північноамериканського; Acrosternum hіlare, зеленого клопа-щитника; Euschіstus servus, коричневого клопа-щитника; Delіa platura, личинку паросткової мухи; Mayetіola destructor, гесенську муху; Petrobіa latens, петробію багатоїдна; олійний рапс: Brevіcoryne brassіcae, попільницю; Phyllotreta crucіferae, блішку хрестоцвітну; Mamestra confіgurata, совку латукову; Plutella xylostella, капустяну совку; Delіa ssp., личинок весняної капустяної мухи. Нематоди включають паразитичні нематоди, такі як бульбочкові, цистоутворювальні та нематоди, що ранять, які включають Heterodera spp., Meloіdogyne spp. та Globodera spp.; зокрема, представників цистоутворювальних нематод, включаючи, але без обмежень, Heterodera glycіnes (соєву цистоутворювальну нематоду); Heterodera schachtіі (бурякову цистоутворювальну нематоду); Heterodera avenae (зернову цистоутворювальну нематоду); та Globodera rostochіensіs та Globodera paіlіda (картопляні цистоутворювальні нематоди). Нематоди, що ранять, включають Pratylenchus spp. Способи підвищення урожайності рослин Забезпечуються способи підвищення урожайності рослин. Способи включають забезпечення рослини або рослинної клітини, які експресують полінуклеотид, що кодує послідовність пестицидного поліпептиду, розкритого у даному документі, та вирощування рослини або отриманого з неї насіння у полі, ураженому (або сприйнятливого до ураження) шкідником, щодо якого зазначений поліпептид має пестицидну активність. У деяких варіантах здійснення поліпептид володіє пестицидною активністю щодо лускокрилого, твердокрилого, двокрилого, напівтвердокрилого шкідника або нематоди-шкідника, а зазначене поле уражено лускокрилим, напівтвердокрилим, твердокрилим, двокрилим шкідником або нематодомшкідником. Як визначено у даному документі, "урожайність" рослини відноситься до якості та/або кількості біомаси, що продукується рослиною. Під "біомасою" мають на увазі будь-який визначуваний продукт рослинного походження. Підвищення продукції біомаси являє собою будь-яке покращення визначуваного виходу продукту рослинного походження. Підвищення урожайності рослин має кілька комерційних застосувань. Наприклад, підвищення біомаси листя рослин може підвищувати урожайність листяних овочів для споживання людиною або твариною. Додатково підвищення біомаси листя можна застосовувати для підвищення виробництва фармацевтичних або промислових продуктів рослинного походження. Підвищення урожайності може включати будь-яке статистично значуще підвищення, включаючи, але без обмежень, підвищення щонайменше на 1 %, підвищення щонайменше на 3 %, підвищення щонайменше на 5 %, підвищення щонайменше на 10 %, підвищення щонайменше на 20 %, щонайменше на 30 %, щонайменше на 50 %, щонайменше на 70 %, щонайменше на 100 % або більше підвищення урожайності у порівнянні з рослиною, у якій не експресується послідовність, що визначає пестицидну активність. При використанні конкретних способів урожайність рослин підвищується у результаті підвищення стійкості до шкідників рослини, яка експресує пестицидний білок, розкритий у даному документі. Експресія пестицидного білка приводить до зниження здатності шкідника до зараження або поїдання. Рослини можна також обробляти одним або декількома хімічними композиціями, що містять один або кілька гербіцидів, інсектицидів або фунгіцидів. Ілюстративні хімічні композиції включають: гербіциди для фруктів/овочів: атразин, бромацил, діурон, гліфосат, лінурон, метрибузин, симазин, трифлуралін, флуазифоп, глюфосинат, галосульфурон Gowan, паракват, пропізамід, сетоксидим, бутафенацил, галосульфурон, індазифлам; інсектициди для 19 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фруктів/овочів: алдікарб, Bacіllus thurіengіensіs, карбарил, карбофуран, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, цифлутрин/бета-цифлутрин, есфенвалерат, лямбдацигалотрин, ацеквіноцил, біфеназат, метоксифенозид, новалурон, хромафенозид, тіаклоприд, динотефуран, флуакрипірим, спіродиклофен, гамма-цигалотрин, спіромезифен, спіносад, ринаксипір, ціазипір, трифлумурон, спіротетрамат, імідаклоприд, флубендіамід, тіодікарб, метафлумізон, сульфоксафлор, цифлуметофен, ціанопірафен, клотіанідин, тіаметоксам, спінеторам, тіодікарб, флонікамід, метіокарб, емамектин бензоат, індоксакарб, фенаміфос, піріпроксифен, фенбутатин-оксид; фунгіциди для фруктів/овочів: аметоктрадин, азоксистробін, бентіавалікарб, боскалід, каптан, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ціазофамід, цифлуфенамід, цимоксаніл, ципроконазол, ципродиніл, дифеноконазол, диметоморф, дитіанон, фенамідон, фенгексамід, флуазинам, флудіоксоніл, флуопіколід, флуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, фолпет, фосетил, іпродіон, іпровалікарб, ізопіразам, крезоксим-метил, манкоцеб, мандіпропамід, металаксил/мефеноксам, метирам, метрафенон, міклобутаніл, пенконазол, пентіопірад, пікоксистробін, пропамокарб, пропіконазол, пропінеб, проквіназид, протіоконазол, піраклостробін, піриметаніл, квіноксифен, спіроксамін, сірка, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для зернових: 2,4-D, амідосульфурон, бромоксиніл, карфентразон-Е, хлоротолурон, хлорсульфурон, клодинафоп-Р, клопіралід, дикамба, диклофоп-М, дифлуфенікан, феноксапроп, флорасулам, флукарбазон-NA, флуфенацет, флупіросульфурон-M, флуроксипір, флуртамон, глифосат, іодосульфурон, іоксиніл, ізопротурон, MCPA, мезосульфурон, метсульфурон, пендиметалін, піноксаден, пропоксикарбазон, просульфокарб, піроксулам, сульфосульфурон, тифенсульфурон, тралкоксидим, тріасульфурон, трибенурон, трифлуралін, тритосульфурон; фунгіциди для зернових: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, цифлуфенамід, ципроконазол, ципродиніл, димоксистробін, епоксиконазол, фенпропідин, фенпропіморф, флуопірам, флуоксастробін, флуквінконазол, флуксапіроксад, ізопіразам, крезоксим-метил, метконазол, метрафенон, пентіопірад, пікоксистробін, прохлораз, пропіконазол, проквіназид, протіоконазол, піраклостробін, квіноксифен, спіроксамін, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; инсектициди для зернових: диметоат, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин, альфа-циперметрин, ß-цифлутрин, біфентрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, хлорпірифос, піримікарб, метіокарб, сульфоксафлор; гербіциди для маїсу: атразин, алахлор, бромоксиніл, ацетохлор, дикамба, клопіралід, (S)диметенамід, глюфосинат, гліфосат, ізоксафлютол, (S-)метолахлор, мезотріон, нікосульфурон, примісульфурон, римсульфурон, сулкотріон, форамсульфурон, топрамезон, темботріон, сафлуфенацил, тієнкарбазон, флуфенацет, піроксасульфон; інсектициди для маїсу: карбофуран, хлорпірифос, біфентрин, фіпроніл, імідаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тіаметоксам, клотіанідин, спіромезифен, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, дельтаметрин, тіодікарб, ß-цифлутрин, циперметрин, біфентрин, луфенурон, тебупіримфос, етіпрол, ціазипір, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, авермектин; фунгіциди для маїсу: азоксистробін, біксафен, боскалід, ципроконазол, димоксистробін, епоксиконазол, фенітропан, флуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, ізопіразам, метконазол, пентіопірад, пікоксистробін, пропіконазол, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, трифлоксистробін; гербіциди для рису: бутахлор, пропаніл, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даімурон, фентразамід, імазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, піразосульфурон, пірибутикарб, квінклорак, тіобенкарб, інданофан, флуфенацет, фентразамід, галосульфурон, оксазикломефон, бензобіциклон, пірифталід, пеноксулам, биспірибак, оксадіаргіл, етоксисульфурон, претилахлор, мезотріон, тефурилтріон, оксадіазон, феноксапроп, піримісульфан; інсектициди для рису: діазинон, фенобукарб, бенфуракарб, бупрофезин, динотефуран, фіпроніл, імідаклоприд, ізопрокарб, тіаклоприд, хромафенозид, клотіанідин, етипрол, флубендіамід, ринаксипір, дельтаметрин, ацетаміприд, тіаметоксам, ціазипір, спіносад, спінеторам, емамектин-бензоат, циперметрин, хлорпірифос, етофенпрокс, карбофуран, бенфуракарб, сульфоксафлор; фунгіциди для рису: азоксистробін, карбендазим, карпропамід, диклоцимет, дифеноконазол, едифенфос, феримзон, гентаміцин, гексаконазол, гімексазол, іпробенфос (ІBP), ізопротіолан, ізотіаніл, касугаміцин, манкоцеб, метоміностробін, оризастробін, пенцикурон, пробеназол, пропіконазол, пропінеб, піроквілон, тебуконазол, тіофанат-метил, тіадиніл, трициклазол, трифлоксистробін, валідаміцин; гербіциди для бавовнику: діурон, флуометурон, MSMA, оксифлуорфен, прометрин, трифлуралін, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, гліфосат, норфлуразон, пендиметалін, піритіобакнатрій, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глюфосинат, флуміоксазин, тидіазурон; інсектициди для бавовнику: ацефат, алдікарб, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, ацетаміприд, емамектин бензоат, імідаклоприд, індоксакарб, лямбда-цигалотрин, 20 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 спіносад, тіодікарб, гамма-цигалотрин, спіромезифен, піридаліл, флонікамід, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, бета-цифлутрин, спіротетрамат, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, динетофуран, флубендіамід, ціазипір, спіносад, спінеторам, гамма-цигалотрин, 4[[(6-хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, тіодікарб, авермектин, флонікамід, піридаліл, спіромезифен, сульфоксафлор; фунгіциди для бавовнику: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, фенамідон, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, іпродіон, ізопіразам, ізотіаніл, манкоцеб, манеб, метоміностробін, пентіопірад, пікоксистробін, пропінеб, протіоконазол, піраклостробін, квінтозен, тебуконазол, тетраконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для сої: алахлор, бентазон, трифлуралін, хлорімурон-етил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомезафен, флуазифоп, гліфосат, імазамокс, імазаквін, імазетапір, (S-)метолахлор, метрибузин, пендиметалін, тепралоксидим, глюфосинат; інсектициди для сої: лямбда-цигалотрин, метоміл, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, спіносад, спінеторам, емамектин-бензоат, фіпроніл, етіпрол, дельтаметрин, ß-цифлутрин, гамата лямбда-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, спіротетрамат, спінодиклофен, трифлумурон, флонікамід, тіодікарб, бета-цифлутрин; фунгіциди для сої: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флутріафол, флуксапіроксад, ізопіразам, іпродіон, ізотіаніл, манкоцеб, манеб, метконазол, метоміностробін, міклобутаніл, пентіопірад, пікоксистробін, пропіконазол, пропінеб, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, тетраконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для цукрового буряку: хлоридазон, десмедифам, етофумезат, фенмедифам, тріаллат, клопіралід, флуазифоп, ленацил, метамитрон, квінмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, хізалофоп; інсектициди для цукрового буряку: імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, дельтаметрин, ß-цифлутрин, гама/лямбда-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, тефлутрин, ринаксипір, ціаксипір, фіпроніл, карбофуран; гербіциди для каноли: клопіралід, диклофоп, флуазифоп, глюфосинат, гліфосат, метазахлор, трифлуралін етаметсульфурон, квінмерак, хізалофоп, клетодим, тепралоксидим; фунгіциди для каноли: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флусилазол, флуксапіроксад, іпродіон, ізопіразам, мепікват-хлорид, метконазол, метоміностробін, паклобутразол, пентіопірад., пікоксистробін, прохлораз, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін, вінклозолін; інсектициди для каноли: карбофуран, тіаклоприд, дельтаметрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, ацетаміприд, динетофуран, ß-цифлутрин, гама- та лямбда-цигалотрин, тау-флувалеріат, етіпрол, спіносад, спінеторам, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, 4-[[(6-хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он. Наступні приклади запропоновано з метою ілюстрації, а не з метою обмеження. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ПРИКЛАДИ Приклад 1. Виявлення нових генів, що визначають пестицидну активність, у Bacіllus thurіngіensіs Ідентифікували новий ген, що визначає пестицидну активність, у бактеріального штаму ATX65158 із застосуванням наступних етапів: Одержання загальної ДНК з штаму. Загальна ДНК містить як геномну ДНК, так і позахромосомну ДНК. Позахромосомна ДНК містить суміш деяких або усіх з наступного: плазміди різного розміру; фагові хромосоми; інші неохарактеризовані позахромосомні молекули. Секвенування ДНК. Загальну ДНК секвенують за допомогою способів секвенування наступного покоління. Ідентифікація передбачуваних генів токсинів за допомогою аналізів гомології та/або інших комп'ютерних аналізів. Одержання остаточної уточненої послідовності гена, що представляє інтерес, за допомогою однієї з декількох стратегій ПЛР або клонування (наприклад, TAІL-PCR), якщо необхідно. Штам ATX65158 був отриманий зі зразку зернового пилу з Хайкоу у провінції Хайнань, Китай. 21 UA 115235 C2 Таблиця 1 Новий ген, ідентифікований у штаму ATX65158 Назва гена Axmi335 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Молекулярна маса (кДа) Найближчий гомолог Нуклеотидна SEQ ІD NO Амінокислотна SEQ ІD NO 90,6 73 % Vip3Ba1 1 2 Axmi335 ампліфікували за допомогою ПЛР з pAX980, а ПЛР-продукт клонували у вектор експресії pAX916 Bacіllus за допомогою способів, добре відомих з рівня техніки. Отриманий у результаті штам Bacіllus, що містить вектор з Axmi335, культивували на традиційному ростовому середовищі, такому як середовище CYS (10 г/л Bacto-сasіtone; 3 г/л дріжджового екстракту; 6 г/л KH2PO4; 14 г/л K2HPO4; 0,5 мМ MgSO4; 0,05 мМ MnCl2; 0,05 мМ FeSO4), доти, поки спороутворення не підтвердилося шляхом мікроскопічного дослідження. Зразки отримували і досліджували щодо активності у біологічних аналізах. Приклад 2. Аналізи пестицидної активності Нуклеотидні послідовності згідно з даним винаходом можна досліджувати щодо їх здатності виробляти пестицидні білки. Здатність пестицидного білка діяти на шкідника у якості пестициду часто аналізують за допомогою ряду методів. Один метод, добре відомий у даній галузі техніки, полягає у здійсненні аналізу із згодовуванням. У ході такого аналізу із згодовуванням шкідника піддають впливу зразка, що містить або сполуку, яку необхідно досліджувати, або контрольні зразки. Часто його здійснюють при поміщенні матеріалу, який необхідно досліджувати, або придатного розчину такого матеріалу на матеріал, який шкідник буде поглинати, як наприклад, штучне живильне середовище. Матеріал, який необхідно досліджувати, може складатися з рідини, твердої речовини або суспензії. Матеріал, який необхідно досліджувати, можна помістити на поверхню і потім надати йому можливість висохнути. У якості альтернативи, матеріал, який необхідно досліджувати, можна змішати з розплавленим штучним живильним середовищем і потім розподілити у камері для аналізу. Камерою для аналізу може бути, наприклад, чашка, тарілка або лунка мікротитрувального планшета. Аналізи із сисними шкідниками (наприклад, попелиць) можуть включати відділення матеріалу, що тестують, від комахи перегородкою, в ідеальному випадку секцією, яку сисна комаха може проколоти частинами сисного ротового апарату, щоб забезпечити поглинання досліджуваного матеріалу. Часто досліджуваний матеріал змішують із стимулятором поїдання, таким як сахароза, щоб сприяти поглинанню досліджуваної сполуки. Інші типи аналізів можуть включати мікроін'єкцію досліджуваного матеріалу у ротову порожнину або кишечник шкідника, а також розробку трансгенних рослин з наступним дослідженням здатності шкідника харчуватися на трансгенній рослині. Дослідження рослин може включати ізоляцію частин рослин, які зазвичай споживають, наприклад, у невеликі камери, прикріплені до аркуша, або ізоляцію цілих рослин у камерах, у яких утримуються комахи. З рівня техніки відомі інші способи та підходи до аналізу шкідників, і їх можна знайти, наприклад, в Robertson and Preіsler, eds. (1992) Pestіcіde bіoassays wіth arthropods, CRC, Boca Raton, FL. У якості альтернативи, аналізи зазвичай описано в журналах Arthropod Management Tests та Journal of Economіc Entomology, або їх обговорюють з членами Ентомологічного суспільства Америки (ESA). Приклад 3. Експресія та очищення Axmi335 (SEQ ID NO:1 або 3) клонували у вектор експресії pMAL-C4x E. colі за геном malE, що кодує мальтоза-зв'язувальний білок (MBP). Ці злиття усередині рамки приводили у результаті до експресії гібридного білка MBP-Axmi335 в E. colі. Для експресії в E. colі BL21*DE3 трансформували окремими плазмідами. Окремі колонії інокулювали у середовище LB, доповнене карбеніциліном і глюкозою, і вирощували протягом ночі при 37 °C. Наступної доби свіже середовище інокулювали 1 % добової культури і вирощували при 37 °C до логарифмічної фази росту. Потім культури індукували 0,3 мМ ІPTG протягом ночі при 20 °C. Кожний осад клітин суспендували в 20 мМ Trіs-Cl буфері, pН 7,4+200 мМ NaСl+1 мМ DTT + інгібітори протеаз і руйнували ультразвуком. Для підтвердження експресії гібридних білків можна застосовувати аналіз за допомогою SDS-PAGE. Усі безклітинні екстракти потім пропускали через колонку з амілозою, що з'єднана з хроматографом для рідинної експрес-хроматографії білків (FPLC) для афінного очищення 22 UA 115235 C2 5 гібридних білків MBP-axmi. Зв'язаний гібридний білок елюювали із смоли за допомогою 10 мМ розчину мальтози. Очищений гібридний білок потім розщеплювали або фактором Xa, або трипсином для видалення амінокінцевої MBP-мітки з білка Axmі. Розщеплення та розчинність білків можна визначати за допомогою SDS-PAGE. Приклад 4. Активність білків, експресованих з генів axmi у біологічних аналізах Біологічний аналіз експресованих генів Axmi призвів у результаті до спостереження наступних активностей щодо шкідливих комах. Таблиця 2 Активність експресованих білків у біологічному аналізі Плазміда pAX8513 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ген Axmi335 DBM помірно сповільнений ріст, 25 % смертні сть Hv Hz помірно сповільнений ріст SWCB помірно помірно сповільнений сповільнений ріст ріст SBL SCB сильно сповільнений ріст, 100 % смертні сть сильно сповільнений ріст, 100 % смертні сть DBM: Міль капустяна Hv: Совка тютюнова Hz: Бавовняна совка SWCB: Метелик кукурудзяний південно-західний SBL: П'ядак соєвий SCB: Вогнівка цукрової тростини Приклад 5. Перенос генів за допомогою вектора для експресії у рослинах Кодуючі ділянки згідно з даним винаходом з'єднують з відповідними послідовностями промоторів і термінаторів для експресії в рослинах. Такі послідовності добре відомі з рівня техніки і можуть містити актиновий промотор рису або убіквітиновий промотор маїсу для експресії в однодольних рослинах, промотор UBQ3 Arabіdopsіs або промотор CaMV 35S для експресії у дводольних рослинах і термінатори nos або PinII. Методики одержання і підтвердження конструктів промотор - ген - термінатор також добре відомі з рівня техніки. В одному аспекті даного винаходу конструюють і створюють синтетичні послідовності ДНК. Ці синтетичні послідовності мають змінену нуклеотидну послідовність у порівнянні з вихідної послідовністю, але кодують білки, які, по суті, ідентичні вихідній послідовності. В іншому аспекті даного винаходу конструюють модифіковані варіанти синтетичних генів таким чином, щоб отриманий у результаті пептид був націлений на органелу рослини, таку як ендоплазматичний ретикулум або апопласт. З рівня техніки відомі послідовності пептидів, які, як відомо, приводять до націлювання гібридних білків на органелу рослини. Наприклад, з рівня техніки відомо, що N-кінцева ділянка білка, який кодується геном кислої фосфатази білого люпину Lupіnus albus (GENBANK® ІD GІ:14276838, Mіller et al. (2001) Plant Physіology 127:594-606), приводить до націлювання гетерологічних білків на ендоплазматичний ретикулум. Якщо отриманий у результаті гібридний білок також містить на C-кінці послідовність для утримання в ендоплазматичному ретикулумі, яка містить з N-кінця пептиду лізинаспарагінову кислоту-глутамінову кислоту-лейцин (тобто мотив "KDEL", SEQ ІD NO:5), то гібридний білок буде націлений на ендоплазматичний ретикулум. Якщо в гібридному білку на Cкінці відсутня послідовність, що націлює на ендоплазматичний ретикулум, білок буде націлений на ендоплазматичний ретикулум, але в остаточному підсумку буде зв'язаний в апопласті. Таким чином, даний ген кодує гібридний білок, який містить на N-кінці тридцять одну амінокислоту з гена кислої фосфатази білого люпину Lupіnus albus (GENBANK® ІD GІ:14276838, Mіller et al., 2001, supra), злиту з N-кінцем амінокислотної послідовності даного винаходу, а також послідовність KDEL (SEQ ID NO:5) на C-кінці. Таким чином, передбачається, що отриманий у результаті білок націлений на ендоплазматичний ретикулум рослини при експресії у рослинній клітині. Експресійні касети для рослин, описані вище, поєднують з придатним для рослини селективним маркером, щоб полегшити відбір трансформованих клітин і тканин, і лігують у вектори для трансформації рослин. Вони можуть містити бінарні вектори для опосередкованої Agrobacterіum трансформації або прості плазмідні вектори для трансформації з використанням аерозолю або біолістичної трансформації. Приклад 6. Трансформація клітин маїсу генами пестицидного білка, описаними в даному документі 23 UA 115235 C2 5 10 15 20 25 30 Качани маїсу найкраще збирати через 8-12 діб після запилення. Зародки виділяють з качанів і при трансформації переважно використовують зародки розміром 0,8-1,5 мм. Зародки висаджують щитком угору у придатне середовище для інкубації, таке як середовище DN62A5S (3,98 г/л солей N6; 1 мл/л (1000x маточного розчину), вітаміни N6; 800 мг/л L-аспарагіну; 100 мг/л міоінозиту; 1,4 г/л L-проліну; 100 мг/л казамінових кислот; 50 г/л сахарози; 1 мл/л (маточного розчину з концентрацією 1 мг/мол) 2,4-D). Проте, придатні середовища і солі, що відмінні від DN62A5S і відомі з рівня техніки. Зародки інкубують протягом ночі при 25 °C у темряві. Хоча інкубація зародків протягом ночі як така не є необхідною. Отримані у результаті експлантати переносять у комірки сітки (30-40 на чашку), переносять на осмотичне середовище приблизно на 30-45 хвилин, потім переносять на пластину для аерозольної інжекції (див., наприклад, PCT публікацію № WO/0138514 і патент США № 5240842). ДНК-конструкти, сконструйовані для експресії генів згідно з даним винаходом у рослинних клітинах, попадають за рахунок прискорення у рослинну тканину із застосуванням прискорювача пучка аерозолю, із застосуванням умов, які, по суті, описані в PCT публікації № WO/0138514. Після аерозольної інжекції зародки інкубують протягом приблизно 30 хвилин на осмотичному середовищі і поміщають в середовище для інкубації на ніч при 25 °C у темряві. Щоб уникнути зайвого ушкодження експлантів, підданих аерозольній інжекції, їх інкубують протягом щонайменше 24 годин до переносу в середовище для відновлення. Зародки потім розподіляють у середовищі на період відновлення тривалістю приблизно 5 діб при 25 °C у темряві, потім переносять на селективне середовище. Експлантати інкубують у селективному середовищі протягом періоду тривалістю до восьми тижнів залежно від природи і характеристик конкретного використовуваного методу відбору. Після періоду відбору отриманий у результаті калюс переносять на середовище для дозрівання зародків і культивують доти, поки не спостерігається утворення зрілих соматичних зародків. Отримані у результаті зрілі соматичні зародки потім поміщають в умови з низьким рівнем освітленості та ініціюють процес регенерації за допомогою способів, відомих з рівня техніки. Отриманим у результаті пагонам дають можливість укоренитися на середовищі для укорінення, а отримані у результаті рослини переносять у горщики для розсади і розмножують як трансгенні рослини. Матеріали Середовище DN62A5S Компоненти На літр Суміш основних солей N6 за Chu 3,98 г/л (номер продукту C 416) Розчин вітамінів N6 за Chu (номер 1 мол/л (1000x маточного розчину) продукту C 149) L-Аспарагін 800 мг/л Міоінозит 100 мг/л L-Пролін 1,4 г/л Казамінові кислоти 100 мг/л Сахароза 50 г/л 1 мол/л (маточний розчин з 2,4-D (номер продукту D-7299) концентрацією 1 мг/мол) 35 40 45 Джерело Phytotechnology Labs Phytotechnology Labs Phytotechnology Labs Sigma Phytotechnology Labs Fisher Scientific Phytotechnology Labs Sigma pН розчину доводять до pН 5,8 за допомогою 1N KOH/1N KСl, додають Gelrіte (Sіgma) у концентрації до 3 г/л і середовище автоклавують. Після охолодження до 50 °C додають 2 мол/л маточного розчину нітрату срібла з концентрацією 5 мг/мол (Phytotechnology Labs). Приклад 7. Трансформація генами згідно з даним винаходом рослинних клітин шляхом опосередкованої Agrobacterіum трансформації Качани найкраще збирати через 8-12 діб після запилення. Зародки виділяють з качанів і при трансформації переважно застосовують зародки розміром 0,8-1,5 мм. Зародки висаджують щитком угору у придатне середовище для інкубації та інкубують протягом ночі при 25 °C у темряві. Хоча інкубація зародків протягом ночі як така не є необхідною. Зародки приводять у контакт зі штамом Agrobacterіum, що містить придатні для опосередкованого Tі-плазмідою переносу вектори, протягом приблизно 5-10 хвилин і потім поміщають у середовище для спільного культивування приблизно на 3 доби (25 °C у темряві). Після спільного культивування експланти переносять у середовище на період відновлення тривалістю приблизно п'ять діб (при 25 °C у темряві). Експланти інкубують у селективному середовищі протягом періоду тривалістю вісім тижнів залежно від природи і характеристик конкретного використовуваного методу 24 UA 115235 C2 5 10 15 відбору. Після періоду відбору отриманий у результаті калюс переносять у середовище для дозрівання зародка та культивують доти, поки не спостерігається утворення зрілих соматичних зародків. Отримані у результаті зрілі соматичні зародки потім поміщають в умови з низьким рівнем освітленості та ініціюють процес регенерації, як відомо з рівня техніки. Приклад 8. Експресія та активність Axmi335 у Z. mays За допомогою конструкта, який містить оптимізовану нуклеїнову кислоту, що кодує Axmi335 під контролем промотора PScubi4-N1, а також ген, що визначає витривалість до гербіцидів, під контролем промотора PScubi4-N1, трансформовували кукурудзу із застосуванням протоколу Agrobacterium-опосередкованої трансформації, описаного у даному документі. Оптимізована нуклеотидна послідовність викладена у SEQ ID NO:3, а білок, який кодується, викладений у SEQ ID NO:4. Зразки листкової пластинки одержували із зрілих рослин, які були позитивними щодо експресії Axmi335, як було виміряно за допомогою вестерн-блотингу та аналізу RT-PCR. Цільовим шкідникам дозволяли годуватися листковими пластинками протягом 2 діб. Потім, після періоду годування, листкові пластинки оцінювали згідно із об'ємом ушкодження, завданого пластинці. Контролі (нетрансгенна тканина листка HiII) продемонстрували значне ушкодження всіма комахами у наборі без смертності. Результати показані у таблиці 3. Таблиця 3 Відсоток неушкодженості Відсоток легкої ушкодженості 20 25 30 n 41 41 Hz 24 % 27 % ECB 24 % 10 % FAW 7% 18 % BCW 0% 0% HV 46 % 30 % Hz: Бавовняна совка ECB: Метелик кукурудзяний Hv: Совка тютюнова FAW: Совка трав'яна BCW: Совка-іпсилон Усі публікації і заявки на патент, згадані у даному описі, свідчать про кваліфікацію фахівців у даній галузі техніки, до якої належить даний винахід. Усі публікації і заявки на патент включені у даний документ за допомогою посилання тією самою мірою, як якби малося на увазі, що кожна окрема публікація або заявка на патент конкретно і окремо включена за допомогою посилання. Хоча вищевикладений винахід був досить детально описаний з метою ілюстрації, а також у якості прикладу для чіткості розуміння, очевидно, що при практичному здійсненні можна вносити певні зміни та модифікації у межах обсягу формули винаходу, що додається. 25 UA 115235 C2 26 UA 115235 C2 27 UA 115235 C2 28