Ген bacillus thuringiensis з активністю проти lepidoptera

Реферат: Винахід належить до виділеної молекули нуклеїнової кислоти або її повнорозмірного комплементу, отриманої зі штамів Bacillus thuringiensis, що кодують поліпептид, що має пестицидну активність проти комах-шкідників з порядку Lepidoptera та застосування в способах боротьби з комахами-шкідниками із порядку Lepidoptera. UA 108348 C2 (12) UA 108348 C2 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ ВІДНОСИТЬСЯ ВИНАХІД Даний винахід відноситься до природних і рекомбінантних нуклеїнових кислот, отриманих з нових генів Bacillus thuringiensis, які кодують пестицидні поліпептиди, що володіють пестицидною активністю відносно комах-шкідників. У композиціях і способах за даним винаходом використовуються описані нуклеїнові кислоти й кодуємі ними поліпептиди для цілей контролю шкідників рослин. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Комахи-шкідники представляють важливий фактор, що визначає втрати врожаю сільськогосподарських культур у світі. Так, наприклад, ушкодження, викликані такими шкідниками, як "похідні хробаки", совка іпсилон або метелик кукурудзяний, можуть розглядатися як реальна економічна погроза для виробників сільськогосподарської продукції. Так, втрати, обумовлені тільки одним комахом-шкідником, метеликом кукурудзяним, на полях і солодкій кукурудзі становили приблизно один мільярд доларів у рік, з обліком як втрат урожаю, так і витрат на боротьбу зі шкідником. Традиційно, основним способом впливу на популяції вважалося використання хімічних інсектицидів широкого спектра дії. Однак, і в споживачів, і в контролюючих урядових органів викликає все більшу занепокоєність забруднення навколишнього середовища, пов'язане з виробництвом і застосуванням синтетичних хімічних пестицидів. У зв'язку з ростом такої заклопотаності органі, що контролюють, або забороняють, або обмежують використання деяких з найбільш шкідливих пестицидів. Таким чином, є виражений інтерес до розробки альтернативних пестицидів. Біологічний контроль економічно значимих комах-шкідників з використанням мікробного агента, такого як гриби, бактерії або інший вид комахи, являє собою екологічно безпечну й комерційно привабливу альтернативу синтетичним хімічним пестицидам. У цілому, слід зазначити, що використання біопестицидів знижує ризик забруднення навколишнього середовища, а самі біопестициди забезпечують більш високу специфічність впливу, ніж це характерно для традиційних хімічних інсектицидів широкого спектра дії. Крім того, біопестициди найчастіше дешевше виробляти, що підвищує економічний вихід у випадку великої кількості культур. Відомо, що деякі мікроорганізми з роду Bacillus мають пестицидну активність відносно широкого спектра комах-шкідників, що включають Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera і інших. Bacillus thuringiensis (Bt)і Bacillus papilliae відносяться до числа частіше й успішніше інших відомих до теперішнього часу агентів, застосовуваних з метою біологічного контролю. Патогенний ефект для комах також мають штами B.larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus (Harwook, ed., ((1989) Bacillus (Plenum Press), 306) і B. cereus (WO 96/10083). Пестицидна активність концентрується, як видно, у параспоральних кристалічних білках включення, хоча пестицидні білки були також виділені з Bacillus на стадії вегетативного росту. Було виділено й охарактеризовано кілька генів, кодуючих зазначені пестицидні білки (див., наприклад, патенти США NoNo. 5 366 892 і 5 840 868). Мікробні інсектициди, особливо отримані зі штамів Bacillus, відігравали важливу роль у сільському господарстві, виконуючи функцію альтернативи хімічним засобам боротьби зі шкідниками. Останнім часом, вчені, що працюють у сфері сільського господарства створили культури рослин з підвищеною стійкістю до комах, шляхом генетичного конструювання культур рослин, продукуючих пестицидні білки з Bacillus. Наприклад, з використанням методів генетичної інженерії були отримані рослини кукурудзи й бавовни, продукуючі пестицидні білки, виділені зі штамів Bt (див., наприклад, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiolmol Biol Rev. 62(3):775-806). Зазначені генетично сконструйовані культури в даний час широко використовуються в сільськогосподарському секторі США і, як підтвердили фермери, є екологічно безпечною альтернативою традиційним способам контролю комах. Крім того, американському фермерові був проданий сорт картоплі, генетично модифікований з метою одержання пестицидних Cry токсинів. Однак, хоча ці генетично модифіковані культури були комерційно вдалими, стійкі до комах культури рослин забезпечували резистентність тільки до вузького діапазону економічно значимих комах-шкідників. Відповідно, залишається потреба в нових токсинах Bt з більш широким спектром інсектицидної активності проти комах-шкідників, наприклад, токсинах, які активні проти більшого числа видів комах з порядку Lepidoptera. Крім того, залишається потреба в біопестицидах, що володіють активністю проти безлічі шкідників, і в біопестицидах, які мають підвищену інсектицидну активність. 1 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 КОРОТКИЙ ОПИС СУТНОСТІ ВИНАХОДУ Даний винахід відноситься до композицій і способам, що впливають на комах-шкідників. Більш конкретно, у варіантах здійснення даного винаходу розглядаються способи впливу на комах з використанням нуклеотидних послідовностей, кодуючих інсектицидні пептиди, для одержання трансформованих організмів і рослин, які експресують інсектицидний поліпептид за даним винаходом. Такі шкідники включають агрономічно значимих шкідників, таких як, наприклад, метелик кукурудзяний (Osthnia nubilalis), fall armyworm (Spodoptera frugiperda), совка іпсилон (Agrotis ipsilon), corn earworm (Heliothis zea) і Southwestern corn borer (Diatraea grandiosella). У деяких варіантах здійснення даного винаходу, нуклеотидні послідовності кодують поліпептиди, які мають пестицидну активність у відношенні щонайменше одного комахи, що належить до порядку Lepidoptera. Різні варіанти здійснення даного винаходу відносяться до нуклеїнової кислоті і її фрагментам і варіантам, які кодують поліпептиди, що володіють пестицидною активністю проти комах-шкідників (наприклад, SEQ ID NONO: 1 і 3, кодуючі SEQ ID NONO: 2 і 4, відповідно). Згідно з варіантами здійснення даного винаходу, нуклеотидна послідовність дикого типу (наприклад, природна), яка була отримана з Bt, кодує новий інсектицидний пептид. Даний винахід також відноситься до фрагментів і варіантів розглянутої нуклеотидної послідовності, які кодують біологічно активні (наприклад, інсектицидні) поліпептиди. Даний винахід, у різних варіантах свого здійснення, також відноситься до виділених пестицидним (наприклад, інсектицидним) поліпептидам, кодованої або природної, або модифікованої (наприклад, мутованої або отриманої в результаті маніпуляції) нуклеїновою кислотою за даним винаходом. У конкретних прикладах, інсектицидні білки за даним винаходом включають фрагменти повнорозмірних білків і поліпептидів, які утворюються з мутованих нуклеїнових кислот, розроблених з метою введення певних амінокислотних послідовностей у поліпептиди за даним винаходом. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу, поліпептиди мають підвищену пестицидну активність, у порівнянні з активністю природного поліпептиду, на основі якого вони були отримані. Нуклеїнові кислоти за даним винаходом можуть також використовуватися для одержання трансгенних (наприклад, трансформованих) однодольних або дводольних рослин, які характеризуються наявністю геномів, що включають щонайменше одну стабільно вбудовану нуклеотидну конструкцію, що включає кодуючу послідовність за даним винаходом, оперативно зв'язану із промотором, який направляє експресію кодовуваного пестицидного поліпептиду. Відповідно, даний винахід також відноситься до трансформованих клітин рослин, рослинним тканинам, рослинам і їх насінням. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу, трансформована рослина може бути отримана з використанням нуклеїнової кислоти, яка була оптимізована для підвищеної експресії в рослині-хазяїні. Наприклад, один з пестицидних поліпептидів за даним винаходом може бути підданий бек-трансляції для одержання нуклеїнової кислоти, що включає кодони, оптимізовані для експресії в конкретному хазяїні, наприклад, у культурній рослині, такій, як рослина кукурудзи (Zea mays). Експресія кодуючої послідовності такою трансформованою рослиною (наприклад, дводольною або однодольною) буде приводити до продукції пестицидного поліпептиду й буде надавати рослині підвищену стійкість до комах. Деякі варіанти здійснення даного винаходу відносяться до трансгенних рослин, експресуючих пестицидні поліпептиди, які застосовуються в способах впливу на різні комахи-шкідники. Даний винахід, у різних варіантах його здійснення, також відноситься до пестицидних або інсектицидних композицій, що містять інсектицидні поліпептиди за даним винаходом, і може необов'язково включати інші інсектицидні пептиди. Даний винахід відноситься до застосування таких композицій у середовищі проживання комах-шкідників для впливу на комах-шкідників ДОКЛАДНИЙ ОПИС ДАНОГО ВИНАХОДУ Даний винахід, у різних варіантах свого здійснення, відноситься до композицій і способам впливу на комах-шкідників, зокрема, на шкідників рослин. Більш конкретно, виділена нуклеїнова кислота за даним винаходом і її фрагменти й варіанти, включають нуклеотидні послідовності, які кодують пестицидні поліпептиди (наприклад, білки). Розглянуті в даному винаході пестицидні білки біологічно активні (наприклад, мають пестицидну активність) проти широкого спектра комах-шкідників, таких як, без обмеження, комах-шкідників з порядку Lepidoptera. Представляючи інтерес, комахи-шкідники включають, без обмеження, метелика кукурудзяного (Ostrinia nubilalis), совку трав'яну (Spodoptera frugiperda), совку іпсилон (Agrotis ipsilon), совку бавовняну (Heliothis zea) і вогнівку кукурудзяну південно-західну (Diatraea grandiosella). 2 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Композиції за даним винаходом включають виділені нуклеїнові кислоти, а також їх фрагменти й варіанти, які кодують пестицидні поліпептиди, касети експресії, що включають нуклеотидні послідовності за даним винаходом, виділені пестицидні білки й пестицидні композиції. Деякі варіанти здійснення даного винаходу відносяться до модифікованих пестицидних поліпептидів, що відрізняються підвищеною інсектицидною активністю проти лускокрилих, у порівнянні з пестицидною активністю відповідного білка дикого типу. Даний винахід, у різних варіантах свого здійснення, також відноситься до рослин і мікроорганізмам, трансформованим даними новими нуклеїновими кислотами, і до способів, що включають використання таких нуклеїнових кислот, пестицидних композицій, трансформованих організмів і їх продуктів для впливу на комах-шкідників. Нуклеїнові кислоти й нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть бути використані для трансформації будь-якого організму з метою одержання кодуючих пестицидних білків. У даному винаході представлені способи, які включають використання таких трансформованих організмів для впливу на шкідників рослин або для боротьби з ними. Нуклеїнові кислоти й нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть також використовуватися для трансформації органел, таких як хлоропласти (McВride etal. (1995) Biotechnology 13: 362-365; and Kota etal. (1999) Proc. Natl.Acad. Sci. USA96:1840-1845). Даний винахід, у різних варіантах свого здійснення, також відноситься до ідентифікації фрагментів і варіантів природної кодуючої послідовності, яка кодує біологічно активні пестицидні білки. Нуклеотидні послідовності за даним винаходом знаходять безпосереднє застосування в способах впливу на шкідників, особливо, на комах-шкідників, таких як шкідники з порядку Lepidoptera. Відповідно, даний винахід, у різних варіантах свого здійснення, відноситься до нових підходів для впливу на комах-шкідників, які не залежать від використання традиційних, синтетичних хімічних інсектицидів. Даний винахід заснований на відкритті природних, біорозкладаємих пестицидів і до генів, які їх кодують. Даний винахід, у різних варіантах свого здійснення, також відноситься до фрагментів і варіантів природної кодуючої послідовності, яка також кодує біологічно активні (наприклад, що володіють пестицидною активністю) поліпептиди. Нуклеїнові кислоти за даним винаходом включають нуклеїнову кислоту або нуклеотидні послідовності, які були оптимізовані для експресії клітинами конкретного організму, наприклад, до послідовностей нуклеїнової кислоти, які були піддані бек-трансляції (наприклад, зворотної трансляції) з використанням кращих для рослини кодонів, заснованих на амінокислотній послідовності поліпептиду, що володіє підвищеною пестицидною активністю. Даний винахід, у різних варіантах свого здійснення, також відноситься до мутацій, які надають поліпшені або змінені властивості поліпептидам за даним винаходом. Див., наприклад, спільно розглянуті заявки на патент США NoNo. 10/606 320, зареєстрована 25 липня 2003, і 10/746 914, зареєстрована 24 грудня 2003. У наведеному нижче описі широко використовується безліч термінів. Для полегшення розуміння даного винаходу далі приводяться наступні визначення. Одиниці, префікси й символи можна розглядати відповідно прийнятій в SI формі. Якщо не зазначено інше, нуклеїнові кислоти позначаються ліворуч праворуч в орієнтації 5'-3'; амінокислотні послідовності вказуються з ліва на право від аміно- до карбокси-кінцю, відповідно. Наведені цифрові діапазони включають цифри, що визначають кінець діапазону. Амінокислоти можуть бути наведені або у вигляді їх загальноприйнятих трьохлітерних символів, або у вигляді однолітерних символів, згідно з рекомендаціями Комісії з номенклатури біохімічних з'єднань IUPAC-IUB. Аналогічно, нуклеотиди можуть бути позначені у вигляді загальноприйнятих однобуквених кодів. Зазначені вище терміни в цілому й більш повно визначаються в наведених посиланнях. У контексті даного опису, термін "нуклеїнова кислота" відноситься до дезоксирибонуклеотидному або рибонуклеотидному полімеру в одноланцюговій або двохланцюговій формі і, якщо не зазначене інше, включає відомі аналоги (наприклад, пептидні нуклеїнові кислоти), що володіють по суті основною властивістю природних нуклеотидів, обумовлених їхньою здатністю гібридизуватися з одноланцюговими нуклеїновими кислотами аналогічним чином, що й природні нуклеотиди. У контексті даного опису, терміни "кодуючий" або "кодовуваний", використовувані стосовно до конкретної нуклеїнової кислоти, означають, що зазначена нуклеїнова кислота включає потрібну інформацію для напрямку трансляції нуклеотидної послідовності в конкретний білок. Інформація, за допомогою якої білок кодується, визначається використанням кодонів. Нуклеїнова кислота, що і кодує білок, може включати нетрансльовані послідовності (наприклад, інтрони) у трансльованих ділянках нуклеїнової кислоти або може не містити такі вбудовані нетрансльовані послідовності (наприклад, як у випадку кДНК). 3 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У контексті даного опису, термін "повнорозмірна послідовність", використовуваний стосовно до конкретного полінуклеотиду або до кодовуваному ним білку, означає, що є повна послідовність нуклеїнової кислоти або повна амінокислотна послідовність нативної (несинтетичної) ендогенної послідовності. Повнорозмірний полінуклеотид кодує повнорозмірну, каталітично активну форму конкретного білка. У контексті даного опису, термін "антизначеннєвий", використовуваний стосовно до орієнтації нуклеотидної послідовності, відноситься до дуплексної полінуклеотидної послідовності, яка оперативно пов'язана із промотором у такій орієнтації, коли транскрибується антизначеннєвий ланцюг. Антизначеннєвий ланцюг має достатню комплементарність до ендогенного продукту транскрипції, так що трансляція ендогенного продукту транскрипції часто інгібується. Таким чином, термін "антизначеннєвий" використовується стосовно до конкретної нуклеотидної послідовності, і даний термін відноситься до комплементарного ланцюга розглянутого продукту транскрипції. Терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" використовуються в даному описі взаємозамінно для позначення полімеру з амінокислотних залишків. Терміни використовуються стосовно до амінокислотних полімерів, у яких один або кілька амінокислотних залишків являють собою штучний хімічний аналог відповідної природної амінокислоти, а також стосовно до природних амінокислотних полімерів. Терміни "залишок" або "амінокислотний залишок" або "амінокислота" використовується в даному описі взаємозамінно для позначення амінокислоти, яка включена в білок, поліпептид або пептид (у цілому, "білок"). Амінокислота може являти собою природну амінокислоту і, якщо не зазначене інше, може включати відомі аналоги природних амінокислот, які можуть функціонувати аналогічним чином, що й природні амінокислоти. Поліпептиди, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу, можуть бути отримані або з нуклеїнової кислоти за даним винаходом, або шляхом застосування стандартних методів молекулярної біології. Наприклад, білок за даним винаходом може бути отриманий шляхом експресії рекомбінантної нуклеїнової кислоти за даним винаходом в підходящій клітині-хазяїні або, альтернативно, при комбінації процедур ex vivo. У контексті даного опису, терміни "виділений" і "очищений" використовуються взаємозамінно для позначення нуклеїнових кислот або поліпептидів або їх біологічно активних частин, які значною мірою або по суті не містять компонентів, які звичайно супроводжують або взаємодіють із нуклеїновою кислотою або поліпептидом у звичайних умовах природного середовища. Таким чином, виділена/ий або очищена/ий нуклеїнова кислота або поліпептид по суті вільні від іншого клітинного матеріалу або культурального середовища, при одержанні їх рекомбінантними методами, або по суті вільні від хімічних попередників або інших хімічних речовин, у випадку їх хімічного синтезу. У такий спосіб "виділена" нуклеїнова кислота в основному не містить послідовностей (таких як, наприклад, послідовності, що кодують білок), які в природному стані фланкують нуклеїнову кислоту (тобто послідовностей, розташованих на 5' і 3' кінцях нуклеїнової кислоти) у геномної ДНК організму, з якого була отримана дана нуклеїнова кислота. Наприклад, у різних варіантах здійснення даного винаходу, виділені нуклеїнові кислоти можуть містити менш, чим приблизно 5 кбайт, 4 кбайт, 3 кбайт, 2 кбайт, 1 кбайт, 0,5 кбайт або 0,1 кбайт із нуклеотидних послідовностей, які в природному стані фланкують нуклеїнові кислоти в геномної ДНК клітини, з якої була отримана дана нуклеїнова кислота. Використовуваний у тексті даного винаходу термін "виділений" або "очищений", стосовно до поліпептиду, згідно з варіантами даного винаходу, означає, що виділений білок по суті не містить клітинного матеріалу й включає препарати білка, що містить менш, чим приблизно 30 %, 20 %, 10 % або 5 % (по сухій вазі) контамінуючого білка. У тому випадку, коли білок за даним винаходом або його біологічно активну частину одержують рекомбінантними методами, культуральне середовище містить менш, чим приблизно 30 %, 20 %, 10 % або 5 % (по сухій вазі) хімічних попередників або інших хімічних речовин, що не відносяться до білка, що цікавить. У тексті всього опису, слово «, що включає" або його варіації, такі як "включає" або ін., слід розуміти як включення зазначеного елемента, числа або стадії або групи елементів, чисел або стадій, але не як виключення будь-якого іншого елемента, числа або стадії або групи елементів, чисел або стадій. У контексті даного опису, термін "вплив на комаху-шкідника" відноситься до внесення змін у харчування комах, їх ріст і/або поведінку на будь-якій стадії розвитку, що включають, без обмеження: знищення комахи, затримку її росту, обмеження репродуктивної здатності, використання активності речовини, що охороняє рослину від поїдання комахами (антифідинг) і т.п. 4 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У контексті даного опису, терміни "пестицидна активність" і "інсектицидна активність" використовуються як синоніми для позначення активності організму або речовини (такого як, наприклад, білок), яка може бути обмірювана по загибелі шкідника, по втраті ваги шкідника, по репелентної активності відносно шкідників і по інших поведінкових і фізичних змінах шкідника після його годівлі й через деякий проміжок часу. Таким чином, організм або речовина, що володіють пестицидною активністю, несприятливо впливають щонайменше на один вимірюваний параметр поведінки шкідника. Наприклад, "пестицидні білки" являють собою білки, які проявляють пестицидну активність самі по собі або в комбінації з іншими білками. У контексті даного опису, термін "пестицидно ефективна кількість" відноситься до кількості речовини або організму, які мають пестицидну активність, у випадку їх присутності в середовищі проживання шкідника. Для такої речовини або організму, пестицидно ефективна кількість визначається емпірично для кожного шкідника в конкретному оточенні, на якого потрібно здійснити вплив. Аналогічно, "інсектицидно ефективна кількість" може використовуватися стосовно до "пестицидно ефективної кількості", коли шкідником є комаха-шкідник. У контексті даного опису, термін "отриманий рекомбінантними методами" або "сконструйований" відноситься до використання методів рекомбінантних ДНК для введення (наприклад, для конструювання) зміни в структуру білка, заснованого на розумінні механізму дії білка, і з урахуванням амінокислот, що підлягають додаванню, делетуванню або заміщенню. У контексті даного опису, термін "мутантна нуклеотидна послідовність" або "мутація" або "мутованна нуклеотидна послідовність" відноситься до нуклеотидної послідовності, яка була мутована або змінена таким чином, що містить один або декілька нуклеотидних залишків (наприклад, пари основ), які не присутні у відповідній послідовності дикого типу. Такий мутагенез або така зміна складається з одного або декількох уведень, делецій або заміщень або замін залишків нуклеїнової кислоти. У тому випадку, коли мутації вводять шляхом додавання, видалення або заміщення амінокислоти із протеолітичного сайту, таке додавання, видалення або заміщення може бути здійснене в межах мотиву протеолітичного сайту або поруч із ним, головне щоб була досягнута мета мутації (тобто щоб був змінений протеоліз у даному сайті). Мутантна нуклеотидна послідовність може кодувати мутантний інсектицидний токсин, що володіє підвищеною або зниженою інсектицидною активністю, або амінокислотну послідовність, яка надає підвищену або знижену інсектицидну активність утримуючому її поліпептиду. У контексті даного опису, термін "мутант" або "мутація", стосовно до білка, поліпептиду або амінокислотної послідовності, відноситься до послідовності, яка була мутована або змінена таким чином, що містить один або кілька амінокислотних залишків, які не присутні у відповідній послідовності дикого типу. Такий мутагенез або така зміна складається з одного або декількох додавань, делецій або заміщень або замін амінокислотних залишків. Мутантний поліпептид демонструє підвищену або знижену інсектицидну активність або являє собою амінокислотну послідовність, яка надає підвищену інсектицидну активність утримуючому її поліпептиду. Таким чином, термін "мутант" або "мутація" відноситься до мутантної нуклеотидної послідовності і/або до кодовуваним амінокислотам. Мутанти можуть використовуватися самі по собі або в будь-якій сумісній комбінації з іншими мутантами за даним винаходом або з будь-якими іншими мутантами. "Мутантний поліпептид" може, навпаки, демонструвати зниження інсектицидної активності. Коли до конкретної нуклеїнової кислоти або до конкретного білка додають більш, ніж одну мутацію, зазначені мутації можуть уводитися в той самий час або послідовно і, якщо послідовно, то такі мутації можуть уводитися в будь-якому підходящому порядку. У контексті даного опису, термін "підвищена інсектицидна активність" або "підвищена пестицидна активність" відноситься до інсектицидного поліпептиду, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу, який має підвищену інсектицидну активність, у порівнянні з відповідним білком дикого типу, і/або до інсектицидного поліпептиду, який ефективний проти більш широкого діапазону комах, і/або до інсектицидного поліпептиду, що володіє специфічністю для комахи, яка не чутлива до токсичності білка дикого типу. Для підтвердження поліпшеної або підвищеної пестицидної активності потрібна демонстрація підвищення пестицидної активності щонайменше на 10 % проти цільової комахи або підвищення щонайменше на 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 100 %, 150 %, 200 % або 300 % або більш пестицидної активності відносно пестицидної активності інсектицидного поліпептиду дикого типу, обумовленої стосовно до тої ж комахи. Наприклад, підвищена пестицидна або інсектицидна активність проявляється в тому випадку, коли йде вплив на більш широкий або звужений діапазон комах при використанні даного поліпептиду, у порівнянні з діапазоном комах, на яких справляє вплив Bt токсин дикого типу. Більш широкий діапазон впливу може бути бажаний у тому випадку, коли потрібна 5 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 універсальність впливу, тоді як більш вузький діапазон впливу може бути бажаний у тому випадку, коли, наприклад, впливу при наявності токсину можуть піддатися корисні комахи. Оскільки даний винахід у різних варіантах свого здійснення не пов'язаний з яким-небудь конкретним механізмом дії, підвищена пестицидна активність може бути також досягнута шляхом змін однієї або декількох характеристик поліпептиду; наприклад, стабільність або тривалість перебування поліпептиду в кишці комахи може бути підвищена щодо стабільності або тривалості перебування відповідного білка дикого типу. Термін "токсин" у контексті даного опису відноситься до поліпептиду, що демонструє пестицидну активність або інсектицидну активність або поліпшену пестицидну активність або поліпшену інсектицидну активність. Токсин Bt або "Bacillus thuringiensis" у контексті даного опису включає розширений клас Cry токсинів, виявлених у різних штамах Bt, який включає такі токсини як, наприклад, Cry1s, Cry2s або Cry3s. Терміни "протеолітичний сайт" або "сайт розщеплення" відноситься до амінокислотної послідовності, яка надає чутливість до класу протеаз або до певної протеази, так що поліпептид, що містить дану (амиинокислотну???) амінокислотну послідовність, розщеплюється протеазами даного класу або певною протеазою. Уважається, що протеолітичний сайт повинен бути "чутливим" до однієї або декільком протеазам, які розпізнають даний сайт. У даній галузі добре відомо, що ефективність розщеплення варіює й що зниження ефективності розщеплення може привести до підвищення стабільності або до тривалості перебування поліпептиду в кишці комахи. Таким чином, протеолітичний сайт може надавати чутливість більш, ніж до однієї протеази або класу протеаз, але ефективність розщеплення по цьому сайту різними протеазами може варіювати. Протеолітичні сайти включають, наприклад, сайти трипсину, сайти хімотрипсину й сайти еластази. Проведені дослідження показали, що протеази в кишці лускокрилих комах включають трипсини, хімотрипсини й еластази. Див., наприклад, Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212; і Hedegus et al. (2003) Arch. Insect Biochem.Physiol. 53: 30-47. Наприклад, близько 18 різних трипсинів було виявлено в середній кишці личинки Helicoverpa armigera (див. Gatehouse et al. (1997) Insect Biochem. Mol. Biol. 27: 929-944). Були досліджені протеолітичні сайти кращих субстратів для цих протеаз. Див, наприклад, Peterson et al. (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25: 765-774. Уживали дослідження, спрямовані на поліпшення розуміння механізму дії Bt токсинів, і для конструювання токсинів з поліпшеними властивостями. Було показано, що протеази кишки комахи можуть виявляти ефект на Bt Cry білки комахи. Деякі протеази активують Cry білки шляхом процесингу їх від форми "протоксину" до токсичної форми, або "токсину". Див, Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42:1-12; і Carroll et al. (1997) J. Invertebrate Pathology 70: 41-49. Зазначена активація токсину може включати видалення N- і C-кінцевих пептидів від білка й може також включати внутрішнє розщеплення білка. Інші протеази можуть розкладати Cry білки. Див. Oppert, ibid. Порівняння амінокислотних послідовностей Cry токсинів з різною специфічністю виявило п'ять високо консервативних блоків послідовностей. Структурно, токсини включають три різні домени, які являють собою, від N- до C-кінця, кластер із семи альфа-спіралей, що брав участь в утворенні пор (позначені як "домен 1"), три антипаралельні складчасті бета-структури, що брали участь у зв'язуванні із клітиною (позначені як "домен 2") і бета-сендвіч (позначений як "домен 3"). Розташування й властивості цих доменів відомо фахівцям у даній галузі. Див, наприклад, Li et al. (1991) Nature, 305:815-821 і Morse et al. (2001) Structure, 9:409-417 Якщо робиться посилання на конкретний домен, такий як домен 1, слід розуміти, що точні кінці цього домену стосовно до конкретної послідовності не є вирішальним чинником, головне, щоб зазначена послідовність або її частина включала послідовність, яка забезпечує щонайменше деяку функцію, властиву конкретному домену. Так, наприклад, якщо йде посилання на домен 1, слід розуміти, що конкретна послідовність включає кластер із семи альфа-спіралей, але точні кінці послідовності, використовувані або зазначені стосовно до даного кластера, не є вирішальним чинником. Будь-який фахівець у даній галузі знає, як визначити такі кінцеві точки і як оцінити такі функції. Для того щоб краще охарактеризувати й удосконалити Bt токсини, досліджували штами бактерії Bt. Було виявлено, що кристалічні препарати, отримані з культур штамів Bt, мають пестицидну активність проти широкого спектра комах-шкідників, що включають метелика кукурудзяного, вогнівку кукурудзяну південно-західну, совку трав'яну, совку іпсилон і совку бавовняну (див., наприклад, експериментальний приклад 1). Були початі спроби ідентифікувати нуклеотидні послідовності, що кодують кристалічні білки з обраних штамів, і нуклеїнові кислоти дикого типу (тоб- то, що існують у природі) були виділені 6 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 із цих бактеріальних штамів, клоновані у векторі експресії й трансформовані в E coli. Було показано, що, залежно від характеристик даного препарату, для прояву пестицидної активності іноді потрібна попередня обробка трипсином для активації пестицидних білків. Із цього стало зрозуміло, що у випадку деяких пестицидних білків потрібно розщеплення протеазою (наприклад, трипсином, хімотрипсином і т.п.) для їхньої активації, тоді як інші білки біологічно активні (тобто, мають пестицидну активність) під час відсутності активації. Такі молекули можуть бути змінені з використанням способів, описаних, наприклад, в заявках на патенти США No. 10/606 320, зареєстрованої 25 червня 2003 р., і No 10/746 914, зареєстрованої 24 грудня 2003 р. Крім того, послідовності нуклеїнової кислоти можуть бути сконструйовані таким чином, щоб вони кодували поліпептиди, що містять додаткові мутації, які надають підвищену або змінену пестицидну активність, у порівнянні з пестицидною активністю природного поліпептиду. Нуклеотидні послідовності таких конструйованих нуклеїнових кислот включають мутації, не виявлені в послідовностях дикого типу. Мутантні поліпептиди, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу, створювали по способу, який включає стадії одержання послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує сімейство Cry поліпептидів; аналізу структури поліпептиду з метою ідентифікації конкретних "цільових" сайтів для мутагенезу генної послідовності, з урахуванням передбачуваної функції цільового домену в механізмі дії токсину; вбудовування однієї або декількох мутацій у послідовність нуклеїнової кислоти для створення бажаної зміни одного або декількох амінокислотних залишків у кодовуваної поліпептидної послідовності й тестування отриманого поліпептиду на наявність пестицидної активності. Багато інсектицидні Bt токсини характеризуються різним ступенем подібності по своїх амінокислотних послідовностях і третинній структурі, і добре відомі способи одержання кристалічних структур Bt токсинів. Репрезентативні приклади кристалічної структури високого дозволу поліпептидів СrуЗА й СrуЗВ наведені в літературі. Виявлена структура СrуЗА гена (Li et al. (1991) Nature 353:815-821) проливає світло на взаємозв'язок між структурою й функцією токсину. Об'єднаний розгляд даних структурного аналізу Bt токсинів і відомих функцій, асоційованих з конкретними структурами, мотивами й т.п., показує, що певні ділянки токсину корелюють із конкретними функціями й певними стадіями в механізмі дії білка. Наприклад, багато токсинів, виділені з Bt, в основному описані, що як включають три домену: семиспіральний пучок, який утягується в пороутворення, домен із трьох складчастих структур, який утягується у зв'язування з рецептором, і мотив типу бета-сендвіч (Li et al. (1991) Nature 305: 815-821). Як вказувалося в патенті США No. 7105332 і в спільно розглянутій заявці на патент США No. 10/746914, зареєстрованої 24 грудня 2003 р., токсичність Cry білків може бути поліпшена при цільовому впливі на ділянку, розташований між альфа-спіралями 3 і 4 у домені 1 токсину. Ця посилка стала основою знань, що стосуються інсектицидних токсинів, які включають наступне: 1) той факт, що, згідно з наявними даними, альфа-спирали 4 і 5 у домені 1 СrуЗА токсинів вбудовані в ліпідний бішар клітин, що вистилають середню кишку чутливих комах (Gazit etal. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12289-12294); 2) знання заявників про розташування сайтів розщеплення трипсином і хімотрипсином в амінокислотній послідовності білка дикого типу; 3) той факт, що білок дикого типу був більш активним проти деяких комах після активації обробкою in vitro трипсином або хімотрипсином; і 4) дані про те, що розщеплення токсинів з 3'кінця приводило до зниження токсичності для комах. Може бути створена ціла серія мутацій і введена в різні фонові послідовності з метою одержання нових поліпептидів, що володіють підвищеної або зміненої пестицидної активністю. Див., наприклад, заявки на патенти США No. 10/606320, зареєстровану 25 червня 2003 р., у даний час скасовану, і No.10/746914, зареєстровану 24 грудня 2003 р. Зазначені мутації включають, без обмеження: додавання щонайменше ще одного чутливого до протеази сайту (наприклад, сайту розщеплення трипсином) у ділянку, розташований між спіралями 3 і 4 у домені 1; заміщення вихідного чутливого до протеази сайту в послідовності дикого типу іншим чутливим до протеази сайтом; додавання безлічі чутливих до протеазам сайтів у конкретнім місці; додавання амінокислотних залишків поблизу одного або декількох чутливих до протеаз сайтів для зміни складчастості поліпептиду й, відповідно, для посилення розщеплення поліпептиду в одному або декількох чутливих до протеаз сайтах; і додавання мутацій для захисту поліпептиду від розкладання шляхом розщеплення, яке знижує токсичність (наприклад, створення серії мутацій, у рамках яких амінокислота дикого типу заміщається валіном для захисту поліпептиду від розщеплення). Мутації можуть використовуватися окремо або в будьякій комбінації для одержання поліпептидів за даним винаходом. 7 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно із вказаним способом, одержують послідовності за даним винаходом, що включають безліч мутацій, таких як, наприклад, мутація, яка включає додатковий або альтернативний чутливий до протеази сайт, розташований між альфа-спіралями 3 і 4 у домені 1 кодовуваного поліпептиду. Мутація, яка являє собою додатковий або альтернативний чутливий до протеази сайт, може бути чутлива до декількох класів протеаз, таких як серинові протеази, які включають трипсин і хімотрипсин або ферменти, такі як еластаза. Таким чином, може бути створена мутація, яка являє собою додатковий або альтернативний чутливий до протеази сайт, так що такий сайт буде легко розпізнаватися певною категорією протеаз, таких як протеаза ссавців або протеаза комах. Може бути також сконструйований чутливий до протеази сайт, який буде розщеплюватися деяким класом ферментів або конкретним ферментом, який, за відомими даними, продукується в організмі, таким як, наприклад, хімотрипсин, продукований совкою бавовняної Heliothis zea (Lenz et al.(1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212). Мутації можуть також віддавати стійкість до протеолітичного розщепленнюя, наприклад, до розщеплення хімотрипсином на C-кінці пептиду. Присутність додаткового і/або альтернативного чутливого до протеази сайту в амінокислотній послідовності кодовуваного білка може поліпшувати пестицидну активність і/або специфічність поліпептиду, кодовуваного нуклеїновими кислотами, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу. Відповідно, нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть бути сконструйовані рекомбінантними методами або отримані в результаті генетичних маніпуляцій, спрямованих на створення поліпептидів, що володіють поліпшеною або зміненою інсектицидною активністю або специфічністю, у порівнянні з такими, властивими немодифікованому токсину дикого типу. Крім того, мутації за даним винаходом можуть бути введені і/або використані в комбінації з іншими нуклеотидними послідовностями для досягнення поліпшених властивостей. Наприклад, чутливий до протеази сайт, який легко розщеплюється хімотрипсином комахи, наприклад, хімотрипсином, виявленим у совки латукової або у совки бавовняної (Hegedus et al. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47; і Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212), може бути введений у фонову послідовність Cry для досягнення кращої токсичності цієї послідовності. У цьому зв'язку, різні варіанти здійснення даного винаходу забезпечують одержання токсичних поліпептидів з поліпшеними властивостями. Наприклад, мутованна нуклеотидна послідовність Cry може включати додаткові мутанти, які містять додаткові кодони, які, у свою чергу, уводять другу чутливу до трипсину амінокислотну послідовність (на додаток до природного сайту трипсину) у кодовуваний поліпептид. Альтернативно, отриманий при додаванні мутант, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу, включає додаткові кодони, що дозволяють уводити щонайменше один інший додатковий сайт, чутливий до протеази, у поліпептид, наприклад, чутливий до хімотрипсину сайт, розташований відразу в 5' або 3' напрямку від природного сайту трипсину. Альтернативно, можуть бути отримані шляхом заміни мутанти, у яких щонайменше один кодон у нуклеїновій кислоті, який кодує природний чутливий до протеази сайт, зруйнований і в послідовність нуклеїнової кислоти введені альтернативні кодони для створення іншого (наприклад, що заміняє) чутливого до протеази сайту. Може бути також доданий до Cry послідовності, заміщаючий мутант у якому природний сайт розщеплення трипсином, наявний у кодовуваному поліпептиді, зруйнований і на його місце введений сайт розщеплення хімотрипсином або еластазою. Відомо, що може використовуватися будь-яка нуклеотидна послідовність, що кодує амінокислотні послідовності, які являють собою протеолітичні сайти або можливі протеолітичні сайти (наприклад, послідовності, такі як NGSR, RR або LKM), і що точна ідентичність кодонів, використовуваних для введення кожного із зазначених сайтів розщеплення у варіантний поліпептид може варіювати, залежно від використання, тобто експресії в конкретному виді рослини. Відомо також, що кожна з розглянутих мутацій може бути введена в будь-яку полінуклеотидну послідовність, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу, яка включає кодони для амінокислотних залишків, що забезпечують нативний сайт розщеплення трипсином, який є мішенню для модифікації. Відповідно, варіанти або повнорозмірних токсинів, або їх фрагментів можуть бути модифіковані, так щоб вони містили додаткові або альтернативні сайти розщеплення, і ці варіанти охоплюються галуззью даного винаходу. Для фахівців у даній галузі відомо, що будь-яка корисна мутація може бути додана до послідовностей за даним винаходом, головне, щоб кодовувані поліпептиди зберігали пестицидну активність. Відповідно, послідовності можуть бути також мутовані таким чином, щоб кодовувані поліпептиди стали стійкими до протеолітичного розщеплення хімотрипсином. Може бути доданий більш ніж один сайт розпізнавання в конкретному положенні, у будь-якій 8 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комбінації, а також множинні сайти розпізнавання можуть бути додані до токсину або вилучені з нього. Таким чином, додаткові мутації можуть включати три, чотири або більш сайтів розпізнавання. Відомо, що можуть бути введені множинні мутації в підходящу полінуклеотидну послідовність і, відповідно, або повнорозмірні послідовності, або їх фрагменти можуть бути модифіковані, для того щоб вони містили додаткові або альтернативні сайти розщеплення, а також, щоб вони стали стійкими до протеолітичного розщеплення. Таким чином, різні варіанти здійснення даного винаходу дозволяють одержувати Cry токсини, що містять мутації, які поліпшують пестицидну активність, а також одержувати поліпшені композиції й надають удосконалені способи впливу на шкідників з використанням інших Bt токсинів. Мутації можуть захищати поліпептид від розкладання протеазою, наприклад, за рахунок видалення можливих протеолітичних сайтів, таких як можливі сайти серинової протеази й сайти розпізнавання еластази з інших областей. Деякі або всі з таких можливих сайтів можуть бути вилучені або змінені, так що протеоліз у положенні вихідного сайту знижується. Зміна в протеолізі можна оцінити при порівнянні мутантного поліпептиду з токсинами дикого типу або при порівнянні мутантних токсинів, які відрізняються по своїй амінокислотній послідовності. Можливі протеолітичні й протеолітичні сайти включають, без обмеження наступні послідовності: RR, сайт розщеплення трипсином; LKM, сайт хімотрипсину; і NGSR, сайт трипсину. Зазначені сайти можуть бути змінені шляхом додавання або делеції будь-якого числа й виду амінокислотних залишків, головне, щоб підвищувалася пестицидна активність поліпептиду. Таким чином, поліпептиди, кодовувані нуклеотидними послідовностями, що включають мутації, будуть включати щонайменше одну зміну або додавання амінокислоти, відносно нативної або фонової послідовності, або зміни або додавання 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150,160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, або 280 або більш амінокислот. Пестицидна активність поліпептиду може бути також поліпшена шляхом усікання нативної або повнорозмірної послідовності, як це відомо в даній галузі. Композиції, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу, включають нуклеїнові кислоти і їх фрагменти й варіанти, які кодують пестицидні поліпептиди, зокрема, даний винахід відноситься до виділених молекул нуклеїнової кислоти, що включають нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотну послідовність, представлену у вигляді SEQ ID NONO: 2 і 4, або нуклеотидні послідовності, що кодують зазначену амінокислотну послідовність, наприклад, до нуклеотидної послідовності, показаної у вигляді SEQ ID NONO: 1 і 3, і її фрагментам і варіантам. Представляють також інтерес оптимізовані нуклеотидні послідовності, що кодують пестицидні білки, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу. У контексті даного опису, фраза "оптимізовані нуклеотидні послідовності" відноситься до нуклеїнових кислот, які оптимізовані для експресії в конкретному організмі, наприклад, у рослині. Оптимізовані нуклеотидні послідовності можуть бути створені для будь-якого організму, що представляє інтерес, з використанням відомих методів. Див., наприклад, заявки на патент США No 10/606320, зареєстровану 25 червня 2003 р., у даний час скасовану, і No. 10/746914, зареєстровану 24 грудня 2003 р., які описують оптимізовану нуклеотидну послідовність, що кодує розглянутий пестицидний білок. У цьому прикладі, нуклеотидна послідовність була отримана шляхом зворотної трансляції амінокислотної послідовності білка й зміни нуклеотидної послідовності, так щоб вона включала кращі для кукурудзи кодони, усе ще кодуючи ту ж амінокислотну послідовність. Ця процедура описана докладно в роботі Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. Оптимізовані нуклеотидні послідовності знаходять застосування для цілей підвищення експресії пестицидного білка в рослині, наприклад, в однодольних рослинах сімейства Gramineae (Poaceae), таких як, наприклад, у рослині кукурудзи або маїсу. Варіанти здійснення даного винаходу також відносяться до виділених пестицидних (наприклад, до інсектицидних) поліпептидам, кодовуваним або природною, або модифікованою нуклеїновою кислотою за даним винаходом. Більш докладно, ці варіанти здійснення даного винаходу відносяться до поліпептидів, що включають амінокислотну послідовність, представлену у вигляді SEQ ID NONO: 2 і 4, і до поліпептидів, кодовуваним нуклеїновими кислотами за даним винаходом, наприклад, представленими у вигляді SEQ ID NONO: 1 і 3, і їх фрагментами й варіантами. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу, пестицидні білки за даним винаходом включають повнорозмірні інсектицидні поліпептиди, фрагменти повнорозмірних інсектицидних поліпептидів і варіантні поліпептиди, які одержують із мутованих нуклеїнових кислот, сконструйованих таким чином, щоб уводити конкретні амінокислотні послідовності в поліпептиди за даним винаходом. У певних варіантах здійснення даного винаходу, 9 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотні послідовності, які вводяться в поліпептиди, включають послідовність, яка забезпечує сайт розщеплення для ферменту, такого як протеаза. У даній галузі відомо, що пестицидна активність Bt токсинів у типовому випадку активується при розщепленні пептиду в кишці комахи різними протеазами. Оскільки пептиди не завжди можуть розщеплюватися з достатньою ефективністю в кишці комахи, фрагменти повнорозмірного токсину можуть мати підвищену пестицидну активність, у порівнянні із самим повнорозмірним токсином. Таким чином, деякі поліпептиди, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу, включають фрагменти повнорозмірного інсектицидного поліпептиду, і деякі поліпептидні фрагменти, варіанти й мутації будуть мати підвищену пестицидну активність, у порівнянні з активністю природного поліпептиду, з якого вони були отримані, особливо, якщо природний інсектицидний поліпептид не активувався in vitro протеазою до скринінгу активності. Таким чином, дана заявка включає усічені версії або фрагменти послідовностей. Мутації можуть бути введені в будь-яку фонову послідовність, що включає такі усічені поліпептиди, головне, щоб зазначений поліпептид зберігав пестицидну активність. Будь-який фахівець у даній галузі може легко порівняти два або більш білків за їх пестицидною активностю з використанням відомих і широко описаних тестів. Слід розуміти, що поліпептиди за даним винаходом можуть бути отримані або при експресії розглянутої нуклеїнової кислоти, або при використанні стандартних процедур молекулярної біології. Відомо, що пестицидні білки можуть бути представлені в олігомерній формі й можуть варіювати по молекулярній масі, кількості залишків, складеним пептидам, активності проти конкретних шкідників і за іншими показниками. Однак, з використанням способів, наведених у даному описі, білки, активні проти безлічі шкідників, можуть бути виділені й охарактеризовані. Пестицидні білки, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу, можуть використовуватися в комбінації з іншими Bt токсинами або іншими інсектицидними білками для розширення діапазону комах, що є мішенню для впливу. Крім того, використання пестицидних білків за даним винаходом в комбінації з іншими Bt токсинами або іншими інсектицидними агентами іншої природи знайшло особливе застосування для попередження і/або ведення явища стійкості комах. Інші інсектицидні агенти включають інгібітори протеази (як серинового, так і цистеЇнового типів), α-амілазу й пероксидазу. Фрагменти й варіанти нуклеотидних і амінокислотних послідовностей і кодовувані поліпептиди також охоплюються галуззю даного винаходу. У контексті даного опису, термін "фрагмент" відноситься до частини нуклеотидної послідовності полінуклеотиду або до частини амінокислотної послідовності поліпептиду за даним винаходом. Фрагменти нуклеотидної послідовності можуть кодувати білкові фрагменти, які зберігають біологічну активність нативного або відповідного повнорозмірного білка й, у цьому зв'язку, мають пестицидну активність. Таким чином, слід мати на увазі, що деякі з полінуклеотидних і амінокислотних послідовностей, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу, можуть бути коректно позначені як фрагменти й мутанти. Слід розуміти, що термін "фрагмент", використовуваний стосовно до послідовностей нуклеїнової кислоти за даним винаходом, також означає послідовності, які використовуються в якості зондів для гібридизації. Даний клас нуклеотидних послідовностей в основному не кодує фрагментні білки, що зберігають біологічну активність. Таким чином, фрагменти нуклеотидної послідовності можуть варіювати в діапазоні від щонайменше приблизно 20 нуклеотидів, приблизно 50 нуклеотидів, приблизно 100 нуклеотидів і до повнорозмірної нуклеотидної кодуючої послідовності білки, згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу. Фрагмент нуклеотидної послідовності за даним винаходом, який кодує біологічно активну частину пестицидного білка за даним винаходом, буде кодувати щонайменше 15, 25, 30, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 або 1100 безперервних амінокислот або аж до повного числа амінокислот, що присутні у пестицидному поліпептиді за даним винаходом (наприклад, 1231 амінокислота в SEQ ID NO: 2). Таким чином, слід розуміти, що різні варіанти здійснення даного винаходу також включають поліпептиди, які є фрагментами репрезентативних пестицидних білків за даним винаходом і які мають довжину, що включає щонайменше 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 або 1100 безперервних амінокислот або аж до повного числа амінокислот, що присутні у пестицидному поліпептиді за даним винаходом (наприклад, 1231 амінокислота в SEQ ID NO: 2). Фрагменти нуклеотидної послідовності за даним винаходом, які використовуються в якості зондів для гібридизації або ПЦР праймерів, звичайно не кодують біологічно активну частину пестицидного білка. Таким чином, фрагмент нуклеїнової кислоти за даним винаходом може кодувати біологічно активну частину пестицидного білка або він може бути фрагментом, який може 10 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовуватися в якості зонда для гібридизації або ПЦР праймеру, згідно наведеним у даному описі процедурам. Біологічно активна частина пестицидного білка може бути отримана при виділенні частини однієї з нуклеотидних послідовностей за даним винаходом, експресуючої кодуєму частину пестицидного білка (наприклад, шляхом рекомбінантної експресії in vitro), з наступною оцінкою активності кодовуваної частини пестицидного білка. Нуклеїнові кислоти, які є фрагментами нуклеотидної послідовності за даним винаходом, включають щонайменше 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 або 2000 нуклеотидів або аж до кількості нуклеотидів, присутніх у нуклеотидній послідовності, наведеної в даному описі (наприклад, 7392 нуклеотиду SEQ ID NO: 1). У конкретних варіантах здійснення даного винаходу розглядаються фрагменти, отримані з (наприклад, створені на основі) першої нуклеїнової кислоти за даним винаходом, де такий фрагмент кодує усічений токсин, що володіє пестицидною активністю. Усічені поліпептиди, кодовувані полінуклеотидними фрагментами за даним винаходом, характеризуються пестицидною активністю, яка або еквівалентна, або поліпшена, щодо активності відповідного повнорозмірного поліпептиду, кодовуваного першою нуклеїновою кислотою, з якої був отриманий даний фрагмент. Уважається, що такі фрагменти нуклеїнової кислоти за даним винаходом можуть бути усічені на 3'- кінці нативної або відповідної повнорозмірної кодуючої послідовності. Фрагменти нуклеїнової кислоти можуть бути також усічені й по 5'-, і по 3'- кінцю нативної або відповідної повнорозмірної кодуючої послідовності. Термін "варіанти" використовується відповідно до по суті подібним послідовностям. У випадку нуклеотидних послідовностей, консервативні варіанти включають такі послідовності, які, у зв'язку виродженістю генетичного коду, кодують амінокислотну послідовність одного з пестицидних поліпептидів за даним винаходом. Природні алельні варіанти, такі як були зазначені, можуть бути ідентифіковані в рамках добре відомих процедур молекулярної біології, таких як, наприклад, полімеразно-ланцюгова реакція (ПЦР) і методи гібридизації, наведені в даному описі. Варіантні нуклеотидні послідовності також включають синтетично створені нуклеотидні послідовності, такі як нуклеотидні послідовності, отримані, наприклад, шляхом сайтспрямованого мутагенезу, але які усе ще кодують пестицидний білок за даним винаходом, такий як мутантний токсин. В основному, варіанти конкретної нуклеотидною послідовністю за даним винаходом характеризуються ідентичністю по послідовності на рівні щонайменше приблизно 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більш, з іншою певною нуклеотидною послідовністю, при оцінці з використанням програм зіставлення послідовностей добре відомих і описаних, з використанням заданих параметрів. Варіант нуклеотидної послідовності за даним винаходом може відрізнятися від іншої послідовності всього на 1-15 нуклеотидів, усього на 1-10, зокрема, на 6-10, усього на 5, а також усього на 4, 3, 2 або навіть один нуклеотид. Варіанти конкретної нуклеотидної послідовності за даним винаходом, наприклад, репрезентативна нуклеотидна послідовність, можуть бути також оцінені при порівнянні відсотка ідентичності по послідовності для поліпептиду, кодовуваного варіантною нуклеотидною послідовністю, і поліпептиду, кодовуваного стандартною нуклеотидною послідовністю. Так, наприклад, тут описуються виділені нуклеїнові кислоти, які кодують поліпептид із заданим відсотком ідентичності по послідовності з поліпептидом SEQ ID NONO: 2 і 4. Відсоток ідентичності по послідовності між двома поліпептидами може бути розрахований з використанням відомих і описаних програм зіставлення послідовностей, з використанням заданих параметрів. Коли будь-яка дана пара полінуклеотидів за даним винаходом оцінюється при порівнянні відсотка ідентичності по послідовності, загальної для двох поліпептидів, які вони кодують, відсоток ідентичності по послідовності між двома кодовуваними поліпептидами становить щонайменше приблизно 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, в основному щонайменше приблизно 75 %, 80 %, 85 %, щонайменше приблизно 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % або щонайменше приблизно 98 %, 99 % або більш відсотків ідентичності по послідовності. У контексті даного опису, термін "варіантний білок » означає поліпептиди, які були отримані з нативного білка шляхом: делеції (так званого усікання) або додавання однієї або декількох амінокислот до N-кінцевій і/або C-кінцевій частині нативного білка; делеції або додавання однієї або декількох амінокислот в одному або декількох сайтах нативного білка; або заміни однієї або декількох амінокислот в одному або декількох сайтах нативного білка. Відповідно, термін "варіантний білок" означає біологічно активні фрагменти нативного білка, які включають достатнє число безперервних амінокислотних залишків для збереження біологічної активності нативного білка, тобто для прояву пестицидної активності. Така пестицидна активність може 11 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бути іншою або поліпшеною, відносного нативного білка, або вона може не мінятися, головне, щоб зберігалася пестицидна активність. Варіантні білки, охоплювані різними варіантами здійснення даного винаходу, є біологічно активними, і це значить, що вони продовжують демонструвати бажану біологічну активність нативного білка, або пестицидну активність по даному опису. Такі варіанти можуть бути результатом, наприклад, генетичного поліморфізму або проведених людиною процедур маніпуляції. Біологічно активні варіанти нативного пестицидного білка за даним винаходом будуть характеризуватися ідентичністю по послідовності на рівні щонайменше приблизно 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більш, з амінокислотною послідовністю нативного білка, при визначенні з використанням відомих і описаних програм зіставлення послідовностей з використанням заданих параметрів. Біологічно активний варіант білка за даним винаходом може відрізнятися від іншого білка всього на 1-15 кислотних залишків, усього на 1-10, наприклад, на 6-10, усього на 5, усього на 4, 3, 2 або навіть 1 амінокислотний залишок. Даний винахід, у різних варіантах свого здійснення, відноситься також до мікроорганізму, який був трансформований щонайменше однією нуклеїновою кислотою за даним винаходом, касетою експресії, що включає зазначену нуклеїнову кислоту, або вектором, що включає касету експресії. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, зазначений мікроорганізм являє собою такий організм, який розмножується на рослинах. Один варіант здійснення даного винаходу відноситься до інкапсулюваного пестицидного білку, який включає трансформований мікроорганізм, здатний до експресії щонайменше одного пестицидного білка за даним винаходом. Різні варіанти здійснення даного винаходу відносяться до пестицидних композицій, що включають трансформований мікроорганізм за даним винаходом. У таких варіантах, трансформований мікроорганізм в основному є присутнім у пестицидній композиції в пестицидно ефективній кількості, разом з підходящим носієм. Різні варіанти здійснення даного винаходу також відносяться до пестицидних композицій, що включають виділений білок за даним винаходом, один або в комбінації із трансформованим організмом за даним винаходом і/або з інкапсулюваним пестицидним білком за даним винаходом, в інсектицидно ефективній кількості, разом з підходящим носієм. Різні варіанти здійснення даного винаходу також відносяться до способу розширення діапазону для цільового впливу на комах шляхом використання пестицидного білка за даним винаходом в комбінації щонайменше з одним іншим або "другим" пестицидним білком. Будьякий відомий у даній галузі пестицидний білок може використовуватися в способах даного винаходу. Такі пестицидні білки включають, без обмеження, Bt токсини, інгібітори протеази, αамілази й перксидази. Різні варіанти здійснення даного винаходу також відносяться до трансформованих або до трансгенних рослин, що включають щонайменше одну нуклеотидну послідовність за даним винаходом. У деяких варіантах, така рослина була стабільно трансформована нуклеотидною конструкцією, що включає щонайменше одну нуклеотидну послідовність за даним винаходом, оперативно пов'язану із промотором, який направляє експресію в рослинній клітині. У контексті даного опису, терміни "трансформована рослина" і "трансгенна рослина" відносяться до рослини, яка містить у своєму геномі гетерологічний полінуклеотид. В основному, зазначений гетерологічний полінуклеотид стабільно інтегрований у геном трансгенної або трансформованої рослини, так що зазначений полінуклеотид проходить у наступні генерації. Гетерологічний полінуклеотид може бути інтегрований в геном один або у вигляді частини рекомбінантної касети експресії. Слід розуміти, що використовуваний у даному описі термін "трансгенний" означає будь-яку клітину, клітинну лінію, каллюс, тканину, частину рослини або рослину, генотип якого був змінений присутністю гетерологічної нуклеїнової кислоти, що включає початково змінені трансгенні частини, а також трансгенні елементи, утворені при половому схрещуванні або при нестатевому розмноженні вихідного трансгенного елемента. Термін "трансгенний" у контексті даного опису не відноситься до зміни генома (хромосомного або нехромосомного) традиційними способами вирощування рослин, або природними явищами, такими як випадкове перехресне запилення, нерекомбінантна вірусна інфекція, бактеріальна трансформація, нерекомбінантна транспозиція або спонтанна мутація. У контексті даного опису термін "рослина" включає цілу рослину, органи рослини (наприклад, листя, стебла, коріння й т.п.), насіння, клітини рослин і їх потомство. Частини трансгенних рослин входять в галузь даного винаходу й включають, наприклад, рослинні клітини, протопласти, тканини, калюс, ембріони й квіти, стебла, плоди, листя й коріння, що 12 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вироблялося із трансгенних рослин або їх потомства, раніше трансформованих молекулою ДНК за даним винаходом й, у цьому зв'язку, складаються, щонайменше частково, із трансгенних клітин. У контексті даного опису, термін рослина включає клітини рослин, протопласти рослин, культури тканин клітин рослин, на основі яких рослини можуть бути регенеровані, калюси рослин, групи рослин і рослинні клітини, які є інтактними в рослинах або частинах рослин, таких як ембріони, пилок, сем′ябруньки, насіння, листя, квіти, гілки, плоди, зерна, колосся, качани, лушпайка, стебла, коріння, кінчики корінь, пильовики й т.п. Клас рослин, який може використовуватися, в основному так само широкий, як і клас вищих рослин, що підходить для здійснення на них методів трансформації, що включають і однодольні, і дводольні рослини. Такі рослини включають, наприклад, Solanum tuberosum і Zea mays. Оскільки даний винахід у різних варіантах свого здійснення не залежить від конкретного біологічного механізму підвищення стійкості рослини до шкідника рослини, експресія нуклеотидних послідовностей за даним винаходом в рослині може приводити до продукції пестицидних білків за даним винаходом й до підвищення стійкості рослини до шкідника рослини. Рослина за даним винаходом знаходить застосування в сільському господарстві в рамках способів впливу на комах-шкідників. Деякі варіанти відносяться до трансформованих культурних рослин, таким як, наприклад, рослина кукурудзи, яка знаходить застосування в способах впливу на комах-шкідників рослини, таких як, наприклад, метелик кукурудзяний. "Розглянута рослина або рослинна клітина" являє собою таку рослину або таку рослинну клітину, де генетична зміна стосувалася гена, що представляє інтерес, або рослину або рослинну клітину, яка є потомством зміненої рослини або зміненої рослинної клітини і яка включає зазначені зміни. "Контроль" або "контрольна рослина" або "контрольна рослинна клітина" забезпечують еталонний варіант для оцінки змін у фенотипі розглянутої рослини або рослинної клітини. Контрольна рослина або контрольна рослинна клітина може включати, наприклад: а) рослину або клітину дикого типу, тобто того ж генотипу, що й вихідний матеріал, узятий для генетичної зміни, яка привела до розглянутої рослини або клітини; b) рослину або рослинну клітину того ж генотипу, що й вихідний матеріал, але який був трансформований нульовою конструкцією (тобто конструкцією, яка не виявляє відомий ефект на розглянуту ознаку, таку як конструкція, що включає маркерний ген); с) рослину або рослинну клітину, яка являє собою нетрансформований сегрегант у потомстві розглянутої рослини або розглянутої рослинної клітини; d) рослину або рослинну клітину, генетично ідентичні розглянутій рослині або рослинній клітині, але яка не зазнала впливу умов або стимулів, здатних індукувати експресію гена, що представляє інтерес; або е) розглянута рослина або рослинна клітина, в умовах при яких ген, що представляє інтерес, не експресується. Для будь-якого фахівця в даній галузі очевидно, що досягнення в молекулярній біології, такі як сайт-специфічний і випадковий мутагенез, методи полімеразно-ланцюгової реакції, а також методи білкового конструювання дають більшу сукупність інструментів і процедур, прийнятних для використання з метою зміни або конструювання амінокислотних послідовностей і відповідних генетичних послідовностей для агрономічно значимих білків. Таким чином, білки за даним винаходом можуть бути змінені різними способами, що включають заміщення, делеції, усікання й вставки амінокислот. Способи здійснення таких маніпуляцій в основному відомі в даній галузі. Наприклад, варіанти амінокислотних послідовностей пестицидних білків можуть бути отримані при введенні мутацій у синтетичну нуклеїнову кислоту (наприклад, у молекулу ДНК). Методи мутагенезу й змін нуклеїнових кислот добре відомі в даній галузі. Наприклад, потрібні зміни можуть бути введені по процедурі сайтспрямованого мутагенезу з використанням олігонуклеотиду. Див., наприклад, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel etal. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; U.S. Patent No. 4,873,192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (Macmillan Publishing COmpАny, New York), з наведеними в цих роботах посиланнями. Мутовані нуклеотидні нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть бути модифіковані, так щоб змінилися приблизно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 або більш амінокислот, що присутні у первинній послідовності кодовуваного поліпептиду. Альтернативно, може бути введена навіть більша кількість змін, так що кодуємий білок може містити щонайменше приблизно 1 % або 2 % або приблизно 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 % або навіть приблизно 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % або 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 % або 25 %, 30 %, 35 % або 40 % або більш кодонів, змінених або іншим способом модифікованих, у порівнянні з відповідним білком дикого типу. Аналогічно, кодований білок може містити щонайменше приблизно 1 % або 2 % або приблизно 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 13 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 9 %, 10 %, 11 %, 12 % або навіть приблизно 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % або 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 % або 25 %, 30 %, 35 % або 40 % або більш кодонів, змінених або іншим способом модифікованих, у порівнянні з відповідним білком дикого типу. Слід розуміти, що мутовані нуклеотидні послідовності за даним винаходом охоплюють біологічно функціональні, еквівалентні пептиди, які мають пестицидну активність, так що досягається підвищена пестицидна активність, обумовлена по антифідинговим властивостям проти личинок метелика кукурудзяного. Такі послідовності можуть з'являтися як наслідок надмірності кодонів і функціональної еквівалентності, яка, як відомо, зустрічається в природньому стані в послідовностях нуклеїнових кислот і в кодованих ними білках. Для будь-якого фахівця в даній галузі очевидно, що додавання і/або заміщення амінокислот у цілому засноване на відносній подібності заступників у бічних ланцюгах амінокислот, наприклад, на їх гідрофобності, заряді, розмірі й т.п. Репрезентативні групи замінних амінокислот, у виборі яких ураховуються різні наведені далі характеристики, відомі фахівцям у даній галузі й включають: аргінін і лізин; глютамат і аспартат; серин і треонін; глютамін і аспарагін; а також валін, лейцин і ізолейцин. Посібник із проведення відповідних амінокислот замін, які не будуть впливати на біологічну активність білка, що представляє інтерес, дано в моделі, описаної в роботі Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), включеної в даний опис як посилання. Так, можуть бути виконані консервативні заміщення, такі як заміна однієї амінокислоти іншою з подібними властивостями. Таким чином, гени й нуклеотидні послідовності за даним винаходом включають як природні послідовності, так і мутантні форми. Аналогічно, білки за даним винаходом включають як природні білки, так і їх варіації (наприклад, усічені поліпептиди) і їх модифіковані форми (наприклад, мутанти). Такі варіанти будуть продовжувати демонструвати бажану пестицидну активність. Очевидно, що мутації, які будуть уведені в нуклеотидну послідовність, кодуючий варіант, не повинні перебувати в цій послідовності за межами рамки зчитування, і в основному вони не будуть створювати комплементарні ділянки, які могли б приводити до утворення вторинної структури мРНК. Див. публікацію за заявкою на ЕР патент No. 75444. Не очікується, що делеції, вставки й заміщення білкових послідовностей, наведених у даному описі, будуть приводити до радикальних змін у характеристиках білка. Однак, коли заздалегідь важко передбачити точний ефект заміщення, делеції або вставки, будь-який фахівець у даній галузі розуміє, що в цілому даний ефект може бути оцінений за допомогою стандартних процедур скринінгу, таких як тести по поїданню комахами. Див., наприклад, роботи Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol. 78: 290-293 and Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485, включені в даний опис як посилання. Варіантні нуклеотидні послідовності й білки також включають послідовності й білки, отримані в результаті мутагенної й рекомбіногенної процедури, такої як перестановка в ДНК. У рамках такої процедури, одна або кілька різних кодуючих послідовностей можуть зазнати генетичних маніпуляцій для створення нового пестицидного білка, що володіє бажаними властивостями. Аналогічним чином одержують бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів з популяції близьких по послідовності полінуклеотидів, що включають ділянки послідовності, які мають значну ідентичність по послідовності й можуть зазнати гомологічної рекомбінації in vitro або in vivo. Наприклад, у рамках даного підходу, повнорозмірні кодуючи послідовності, мотиви послідовності, кодуючі домен, що представляє, інтерес або будь-який фрагмент нуклеотидної послідовності за даним винаходом може бути переміщений між нуклеотидними послідовностями за даним винаходом й відповідними частинами інших відомих нуклеотидних послідовностей Cry з метою одержання нового гена, що кодує білок з поліпшеною властивістю, яка становить інтерес. Властивості, що представляють інтерес включають, без обмеження, пестицидну активність на одиницю пестицидного білка, стабільність білка й токсичність відносно нецільових видів, особливо, людей, домашньої худоби, рослин і мікробів, які експресують пестицидні поліпептиди згідно з різними варіантами здійснення даного винаходу. Різні варіанти здійснення даного винаходу не пов'язані з певною стратегією перестановки, важливо, щоб щонайменше одна нуклеотидна послідовність за даним винаходом або її частина утягувалася в таку стратегію перестановки. Перестановка може утягувати тільки нуклеотидні послідовності, наведені в даному описі, або може додатково утягувати перестановку інших нуклеотидних послідовностей, відомих у даній галузі. Стратегії перестановки в ДНК добре відомі й описані. Див, наприклад, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore etal. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang 14 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 etal. (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri etal. (1998) Nature 391:288-291; і патент США NoNo. 5605793 і 5837458. Нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть також використовуватися для виділення відповідних послідовностей з інших організмів, зокрема, з інших бактерій, і більш конкретно, з інших штамів Bacillus. Аналогічним чином, методи, такі як ПЦР, гібридизація й т.п., можуть використовуватися для ідентифікації таких послідовностей, на основі їх гомології по послідовності з послідовностями, наведеними в даному описі. Різні варіанти здійснення даного винаходу включають послідовності, які були обрані на основі їх ідентичності по послідовності з повними послідовностями, наведеними в даному описі, або з їхніми фрагментами. Такі послідовності включають ті послідовності, які є ортологами описуваних послідовностей. Термін "ортологи" відноситься до генів, які отримані із загального гена-попередника і які знайдені в різних видах у результаті видоутворення. Гени, знайдені в різних видах, розглядаються як ортологи, коли їх нуклеотидні послідовності й/їх кодовувані білкові послідовності мають значну ідентичність, обумовлену згідно з наведеним описом. Функції ортологів найчастіше характеризуються високою консервативністю серед різних видів. У рамках ПЦР стратегії, можуть бути сконструйовані олігонуклеотидні праймери для використання в реакціях ПЦР із метою ампліфікації відповідних послідовностей ДНК із кДНК або геномної ДНК, екстрагованої з будь-якого організму, що представляє інтерес. Методи розробки праймерів для ПЦР і ПЦР-клонування відомі в даній галузі й описані в роботі: Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), далі називаної "Sambrook". Див. також Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); і Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual(Academic Press, New York). Відомі методи ПЦР включають без обмеження, методи з використанням парних праймерів, зчеплених праймерів, праймерів з одною специфічністю, вироджених праймерів, ген-специфічних праймерів, вектор-специфічних праймерів, частковонеспарованих праймерів У методі гібридизації, повна або частина відомої нуклеотидної послідовності використовується як зонд, який селективно гібридизується з іншими відповідними нуклеотидними послідовностями, що присутні в популяції клонованих фрагментів геномної ДНК або фрагментів кДНК (тобто в бібліотеках геномних ДНК або кДНК) з обраного організму. Зонди для гібридизації можуть являти собою фрагменти геномної ДНК, фрагменти кДНК, фрагменти 32 РНК або інші олігонуклеотиди й можуть бути мічені детектуємою групою, такою як P, або будьякою іншим детектуємим маркером. Так, наприклад, зонди для гібридизації можуть бути створені шляхом мічення синтетичних олігонуклеотидів, заснованих на послідовностях за даним винаходом. Методи одержання зондів для гібридизації й конструювання бібліотек кднк і геномних бібліотек в основному відомі в даній галузі й описані в керівництві Sambrook. Наприклад, повнорозмірна послідовність за даним винаходом або одна або декілька її частин може використовуватися в якості зонда, здатного специфічно гібридизуватися з відповідними послідовностями й матричними РНК. Для проведення специфічної гібридизації в самих різних умовах, використовувані зонди включають послідовності, які є унікальними для послідовності за даним винаходом й в основному включають щонайменше приблизно 10 або 20 нуклеотидів у довжину. Такі зонди можуть використовуватися для ампліфікації відповідних Cry послідовностей з обраного організму в рамках ПЦР. Даний метод може використовуватися для виділення додаткових кодуючих послідовностей з бажаного організму або в якості діагностичного тесту для визначення присутності кодуючих послідовностей в організмі. Методи гібридизації включають гібридизаційний скринінг на планшетах бібліотек ДНК (у вигляді бляшок або колоній, див., наприклад, Sambrook). Гібридизація таких послідовностей може проводитися в жорстких умовах. Термін « жорсткі умови" або « жорсткі умови гібридизації" у контексті даного опису відноситься до умов, при яких зонд буде гібридизуватися зі своєю цільовою послідовністю на помітно більш високому рівні, ніж з іншими послідовностями (наприклад, перевищувати фон щонайменше в 2 рази, 5 раз або 10 раз). Жорсткість умов залежить від послідовності й буде мінятися в різних ситуаціях. Шляхом контролю жорсткості умов гібридизації і/або промивання, можуть бути ідентифіковані цільові послідовності, які на 100 % комплементарні даному зонду (гомологічне зондування). Альтернативно, жорсткість умов може бути відкорегована, для того щоб допустити деяку некоректність спарювання в послідовностях, так що в цьому випадку буде виявлятися менший рівень подібності (гетерологічне зондування). В основному, зонд включає менш, чим приблизно 1000 або 500 нуклеотидів у довжину. 15 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У типовому випадку, жорсткість умов повинна бути такою, при якій концентрація солі становить менш, чим 1,5 М іона Na, звичайно концентрація становить від приблизно 0,01 до 1,0 іона Na (або інших солей) при pН 7,0-8,3 і температура становить 30 °C для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60 °C для довгих зондів (наприклад, понад 50 нуклеотидів). Потрібна жорсткість умов може бути також досягнута при додаванні дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Репрезентативні умови низької жорсткості включають гібридизацію в буферному розчині, що включає 30-35 % формаміду, 1 M NaСl, 1 % ДСН (додецилсульфат натрію) при температурі 37 °C і промивання в 1X-2X SSC (20X SSC=3,0 M NaСl/0,3 M цитрат натрію) при температурі 50-55 °C. Репрезентативні умови середньої жорсткості включають гібридизацію в розчині, що містить 40-45 % формаміду, 1,0 M NaСl, 1 % ДСН при температурі 37 °C і промивання в 0,5X-1X SSC при температурі 55-60 °C. Репрезентативні умови середньої жорсткості включають гібридизацію в розчині, що містить 50 % формаміду, 1 M NaСl, 1 % ДСН при температурі 37 °C і кінцеве промивання в 0,1X SSC при температурі 60-65 °C протягом щонайменше 20 хвилин. Необов'язково, промивні буфери можуть включати від приблизно 0,1 % до приблизно 1 % ДСН. Тривалість гібридизації в основному становить менш, чим 24 години, звичайно від приблизно 4 до приблизно 12 годин. Специфічність у типовому випадку являє собою функцію пост-гібридизаційних промивань, і найважливішими факторами є іонна сила й температура розчину для кінцевого промивання. У випадку ДНК-ДНК гібридів, Tm (точка плавлення) може бути приблизно визначена з рівняння Мейнкота й Валя (Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284): Tm=81,5 °C+16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61 (% form) - 500/L; де M означає молярність одновалентних катіонів, %GC означає процентний вміст гуанозинових і цитозинових нуклеотидів у ДНК, «% form" означає процентний вміст формаміду в гібридизаційному розчині й L означає довжину гібрида по кількості пар основ. Показник Tm означає температуру (при певних значеннях іонної сили й pН), при якій 50 % комплементарної цільової послідовності гібридизується з повністю підходящим для спарювання зондом. Промивання в типовому випадку проводяться щонайменше до досягнення рівноваги й досягнення низького фонового рівня гібридизації, що становить 2 години, 1 година або 30 хвилин. Показник Tm знижується приблизно на 1 °C для кожного 1 % некоректного спарювання; таким чином, Tm, умови гібридизації і/або промивання можуть бути відкореговані для досягнення гібридизації з послідовностями бажаної ідентичності. Наприклад, якщо йде пошук послідовностей з ідентичністю ≥90 %, Tm може бути знижений на 10 °C. В основному, умови жорсткості вибирають таким чином, щоб вони включали температуру приблизно на 5 °C нижче, чим Tm для конкретної послідовності і її комплементу, при певних значеннях іонної сили й pН. Однак, дуже жорсткі умови можуть включати гібридизацію і/або промивання при температурі на 1, 2, 3 або 4 °C нижче, чим Tm; умови середньої жорсткості можуть включати гібридизацію і/або промивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10 °C нижче, чим Tm; умови низької жорсткості можуть включати гібридизацію і/або промивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 °C нижче, чим Tm. Для будь-якого фахівця в даній галузі зрозуміло, що у використовуваному рівнянні, де відбиті умови гібридизації й промивання й бажане значення Tm, варіації у жорсткості розчинів гібридизації і/або промивання добре описані. Якщо бажаний рівень некоректного спарювання відповідає значенню Tm менш, чим 45 °C (водяний розчин) або 32 °C (розчин формаміду), концентрація SSC може бути підвищена, для того щоб можна було використовувати більш високу температуру. Вичерпний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот наведено в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); і Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York). Див. також Sambrook. Таким чином, виділені послідовності, які кодують Cry білок за даним винаходом й гібридизуються в жорстких умовах з Cry послідовностями, наведеними в даному описі, або з їхніми фрагментами, охоплюються різними варіантами здійснення даного винаходу. Наведені нижче терміни використовуються для опису подібності по послідовності між двома або більш нуклеїновими кислотами або полінуклеотидами: (a) "стандартна послідовність", (b) "вікно порівняння", (c) "ідентичність по послідовності", (d) "відсоток ідентичності по послідовності" і (e) "значна ідентичність". (a) У контексті даного опису, "стандартна послідовність" являє собою певну послідовність, використовувану як основу для порівняння послідовностей. Стандартна послідовність може являти собою підмножину або повністю специфічну послідовність, наприклад, вона може являти собою сегмент повнорозмірної послідовності кднк або генної послідовності або повну послідовність кднк або гена. 16 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (b) У контексті даного опису, термін "вікно порівняння" використовується для посилання на безперервний і певний сегмент полінуклеотидної послідовності, де полінуклеотидна послідовність у вікні порівняння може включати додавання або делеції (тобто гепи), щодо стандартної послідовності (яка не включає додавань або делецій) для проведення оптимального зіставлення двох послідовностей. В основному, вікно порівняння включає щонайменше 20 безперервних нуклеотидів у довжину й необов'язково може становити 30, 40, 50, 100 або більш нуклеотидів. Для фахівця в даній галузі зрозуміло, що для того, щоб уникнути високої подібності зі стандартною послідовністю через включення гепів у полінуклеотидну послідовність, у типовому випадку вводиться штраф за геп, і він віднімається із числа спарювань. Способи зіставлення послідовностей для їхнього порівняння добре відомі в даній галузі. Так, визначення відсотка ідентичності по послідовності між будь-якими двома послідовностями може бути проведене з використанням математичного алгоритму. Не обмежуючі приклади таких математичних алгоритмів включають алгоритм Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17; алгоритм для локального вирівнювання Smith et al. (1981) Adv.Appl. Math. 2:482; алгоритм для загального вирівнювання Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; метод пошуку для локального вирівнювання Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; алгоритм Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, у модифікації Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Комп'ютерне надання цих математичних алгоритмів може бути використане для порівняння послідовності з метою визначення ідентичності по послідовності. Такі комп'ютерні надання включають, без обмеження: CLUSTAL у програмі PC/Gene (доступна від Intelligenetics, Mountain View, California); програма ALIGN (версія 2.0) і GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA і TFASTA у пакеті програм по генетиці GCG Wisconsin Genetics Software Package, версія 10 (доступно від Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA). Зіставлення за допомогою таких програм може бути здійснене з використанням заданих параметрів. Програма CLUSTAL добре описана в літературі Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins etal.(1989) CABIOS 5:151-153; Corpet ef al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; and Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. Програма ALIGN заснована на алгоритмі Майерса й Міллера (Myers and Miller (1988) supra). При використанні програми ALIGN для порівняння амінокислотних послідовностей можуть використовуватися наступні параметри: РАМ120- вага залишку, штраф за довжину гепа 12, штраф за геп 4. Програми BLAST (Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403) засновані на алгоритмі Karlin and Altschul (1990) supra. Нуклеотидні пошуки в BLAST можуть бути проведені з використанням програми BLASTN, очки = 100, довжина слова = 12, для одержання нуклеотидних послідовностей, гомологічної нуклеотидної послідовності кодуючої білок за даним винаходом. Білкові пошуки BLAST можуть бути проведені з використанням програми BLASTX, очки = 50, довжина слова = 3, для одержання амінокислотних послідовностей, гомологічних білку або пептиду за даним винаходом. Для одержання гепірованних зіставлень для цілей порівняння може використовуватися програма Gapped BLAST (в BLAST 2.0), описана Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Альтернативно, може використовуватися PSI-BLAST (в BLAST 2.0) для проведення повторних пошуків, які виявляють віддалену подібність між молекулами. Див. Altschul et al. (1997) supra. При використанні BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, можуть використовуватися задані параметри відповідних програм (наприклад, BLASTN для нуклеотидних послідовностей, BLASTX для білків). Див. інтернет-сайт Національного Центру біотехнологічної інформації (National Center for Biotechnology Information) на www.ncbi.hlm.nih.gov. Зіставлення може також проводитися вручну при огляді. Якщо не зазначене інше, значення ідентичності/подібності по послідовності, наведені в даному описі, відносяться до значення, отриманого з використанням програми GAP, версії 10, з використанням наступних параметрів: % ідентичності і % подібності для нуклеотидної послідовності з використанням вагового значення геп 50, ваги довжини 3 і матриці nwsgapdna.cmp; % ідентичності і % подібності для амінокислотної послідовності з використанням вагового значення геп 8, ваги довжини 2 і матриці BLOSUM62; або будь-якої еквівалентної програми. Термін "еквівалентна програма" у контексті даного опису відноситься до будь-якої програми порівняння послідовностей, яка для двох розглянутих послідовностей дає зіставлення з ідентичним спарюванням нуклеотидних і амінокислотних залишків і таким же значенням ідентичності по послідовності, при порівнянні з відповідними результатами, отриманими при проведенні зіставлення по програмі GAP, версія 10. У програмі GAP використовується алгоритм Needleman and Wunsch (1970) supra для виявлення шляхом зіставлення двох повних послідовностей, які дають максимальне число 17 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спарювань і мінімальне число гепів. Програма GAP ураховує всі можливі варіанти вирівнювання й положення гепів і проводить вирівнювання з досягненням найбільшого числа спарених основ і найменшого числа гепів. Вона допускає штраф за створення гепів і штраф за розширення гепа в одиницях спарених основ. Програма GAP за кожний, геп, що вводиться знижує штраф за створення гепа в кількості спарювань. Якщо штраф за розширення гепа більше, ніж обране нульове значення, програма GAP повинна додатково давати винагороду за кожний, геп, що вводиться у довжині гепа, щораз за штраф по розширенню гепа. Задане значення штрафу по створенню гепа й задане значення штрафу по розширенню гепа у версії 10 пакета прикладних програм GCG Wisconsin Genetics Software Package для білкових послідовностей становлять 8 і 2, відповідно. Для нуклеотидних послідовностей задане значення штрафу по створенню гепа становить 50, а задане значення штрафу по розширенню гепа становить 3. Штрафи за створення гепа й розширення гепа можуть бути виражені у вигляді цілого числа, обраного із групи цілих чисел, що становлять від 0 до 200. Так, наприклад, штрафи за створення гепа й розширення гепа можуть становити 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 або більш. Програма GAP є лише одним представником сімейства найкращих програм по зіставленню. У цьому сімействі є багато інших представників, але жоден з них не відрізняється кращою якістю. Програма GAP характеризується чотирма показниками корисності його використання для зіставлення: якість, співвідношення, ідентичність і подібність. Якість являє собою метричну характеристику, що максимально підходить для зіставлення послідовностей. Співвідношення являє собою якість, розділене на кількість основ у більш короткому сегменті. Відсоток ідентичності являє собою відсоток символів, які фактично спаровуються. Відсоток подібності являє собою символи, які близькі. Символи, які перетинають гепи, ігноруються. Подібність підраховується в балах, коли значення рахункової матриці для пари символів вище або рівно 0,50, відзначається граничне значення подібності. Рахунковою матрицею, використовуваної у версії 10 пакета прикладних програм GCG Wisconsin Genetics Software Package, є BLOSUM62 (див. Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915). (c) У контексті даного опису, "ідентичність по послідовності" або "ідентичність", стосовно до двом послідовностям нуклеїнових кислот або поліпептидним послідовностям, відноситься до залишків у двох послідовностях, які є однаковими при їхньому вирівнюванні для досягнення максимальної відповідності уздовж певного вікна порівняння. Коли використовується відсоток ідентичності по послідовності стосовно до білка, уважається, що положення залишків, які не ідентичні, часто різняться по консервативних заміщеннях амінокислот, де амінокислотні залишки були заміщені іншими амінокислотними залишками із близькими хімічними властивостями (наприклад, по заряду або гідрофобності), так що, у цьому зв'язку, не міняються функціональні властивості молекули. Коли послідовності відрізняються по консервативним заміщенням, відсоток ідентичності по послідовності може бути підвищений для корегування консервативної природи заміщення. Говорять, що послідовності, які відрізняються по таких консервативних заміщеннях, характеризуються "подібністю по послідовності" або "подібністю". Способи проведення такого коректування відомі фахівцям у даній галузі. У типовому випадку, проводиться підрахунок консервативного заміщення у вигляді часткового, а не повного некоректного спарювання, що підвищує відсоток ідентичності по послідовності. Таким чином, наприклад, якщо ідентична амінокислота має бал один, а консервативному заміщенню дане нульове значення бала, то консервативному заміщенню привласнюється значення бала від 0 до 1. Балове значення консервативних заміщень розраховують, наприклад, відповідно до програми PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). (d) У контексті даного опису, "відсоток ідентичності по послідовності", означає значення, обумовлене при порівнянні двох оптимально вирівняних послідовностей уздовж вікна порівняння, де частина полінуклеотидної послідовності у вікні порівняння може включати додавання або делеції (тобто гепи), щодо стандартної послідовності (яка не включає додавання або делеції) для цілей оптимального зіставлення двох послідовностей. Відсоток розраховується при визначенні числа положень по обом послідовностях, у яких є присутньою ідентична основа нуклеїнової кислоти або ідентичний амінокислотний залишок, для виявлення числа спарених положень, а при розподілі числа спарених положень на загальне число положень у вікні порівняння й при множенні результату на 100 одержують значення відсотка ідентичності по послідовності. (e)(i) Термін "ідентичність по суті" у відношенні полінуклеотидних послідовностей означає, що полінуклеотид включає послідовність, яка характеризується щонайменше 70 %. 80 %, 90 % або 95 % або більшою ідентичністю по послідовності, при порівнянні зі стандартною послідовністю з використанням однієї з описаних програм зіставлення й з використанням 18 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стандартних параметрів. Для фахівця в даній галузі зрозуміло, що ці значення можуть бути відповідним чином відкореговані для визначення відповідної ідентичності білків, кодуючих двома нуклеотидними послідовностями, з врахуванням виродженості кодонів, амінокислотної подібності, положення рамки зчитування й т.п. Ідентичність по суті амінокислотних послідовностей для цих цілей в основному визначається ідентичністю на рівні щонайменше 60 %, 70 %, 80 %, 90 % або 95 % або більшої ідентичності по послідовності. Іншим показником того, що нуклеотидні послідовності значною мірою ідентичні, буде той факт, що дві молекули гібридизуються одна з одною у жорстких умовах. В основному, жорсткі умови вибирають таким чином, щоб температура була приблизно на 5 °C нижче, чим Tm для конкретної послідовності, при певних значеннях іонної сили й pН. Однак, жорсткі умови охоплюють температури, які від приблизно 1 °C до приблизно 20 °C нижче, чим Tm, залежно від бажаного ступеня жорсткості, як тут було описано. Нуклеїнові кислоти, які не гібридизуються одна з одною у жорстких умовах, усе ще будуть значною мірою ідентичними, якщо поліпептиди, які вони кодують, будуть по суті ідентичними. Це може мати місце, наприклад, у тому випадку, коли створюється копія нуклеїнової кислоти з використанням максимальної виродженості кодонів, що допускається генетичним кодом. Одним з показників того, що дві послідовності нуклеїнових кислот по суті ідентичні, є той факт, що поліпептид, кодуємий першою нуклеїновою кислотою, здатний до перехресної імунологічної реакції з поліпептидом, кодовуваним другою нуклеїновою кислотою. (e)(ii) Термін "ідентичність по суті" відносно пептиду показує, що пептид включає послідовність, яка щонайменше на 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або більш ідентична по послідовності стандартній послідовності уздовж установленого вікна порівняння. Оптимальне зіставлення для цих цілей може бути проведене з використанням алгоритму загального вирівнювання Needleman and Wunsch (1970) supra. Вказівкою на те, що дві пептидні послідовності по суті ідентичні, буде той факт, що один пептид здатний до імунологічної реакції з антитілами проти другого пептиду. Таким чином, пептид по суті ідентичний другому пептиду, наприклад, коли два пептиди відрізняються тільки по консервативному заміщенню. Пептиди, які « по суті подібні", мають загальні послідовності, як було зазначено вище, за винятком того, що положення залишків, які не ідентичні, можуть відрізнятися по консервативним амінокислотним змінам. Використання терміна "нуклеотидні конструкції" у контексті даного опису не слід розглядати як обмежуючі варіанти здійснення даного винаходу нуклеотидними конструкціями, що включають ДНК. Для фахівця в даний галузі зрозуміло, що нуклеотидні конструкції, зокрема, полінуклеотиди й олігонуклеотиди, що складаються із рибонуклеотидів і комбінацій рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів, можуть також використовуватися в способах, наведених у даному описі. Нуклеотидні конструкції, нуклеїнові кислоти й нуклеотидні послідовності за даним винаходом додатково включають усі комплементарні форми таких конструкцій, молекул і послідовностей. Крім того, нуклеотидні конструкції, нуклеотидні молекули й нуклеотидні послідовності за даним винаходом охоплюють усі нуклеотидні конструкції, молекули й послідовності, які можуть використовуватися в способах за даним винаходом для трансформації рослин, включаючи, без обмеження, ті нуклеотидні конструкції, молекули й послідовності, які складаються з дезоксирибонуклеотидів, рибонуклеотидів і їх комбінацій. Такі дезоксирибонуклеотиди й рибонуклеотиди включають як природні молекули, так і синтетичні аналоги. Нуклеотидні конструкції, нуклеїнові кислоти й нуклеотидні послідовності за даним винаходом також охоплюють усі форми нуклеотидних конструкцій, що включають, без обмеження, одноланцюгові форми, дволанцюгові форми, шпилькові форми, структури типу стебла й петлі й т.п. Інший варіант здійснення даного винаходу відноситься до трансформованого організму, такому як організм, обраний із групи, що складається з рослинних клітин і клітин комах, бактерій, дріжджів, бакуловірусів, найпростіших, нематод і водоростей. Трансформований організм включає: молекулу ДНК за даним винаходом, касету експресії, що включає зазначену молекулу ДНК, або вектор, що включає зазначену касету експресії, який може бути стабільно включений у геном трансформованого організму. Різні варіанти здійснення даного винаходу включають послідовності в конструкції ДНК для експресії в організмі, що представляє інтерес. Зазначена конструкція буде включати 5'- і 3'-регуляторні послідовності, оперативно пов'язані з послідовністю за даним винаходом. Термін "оперативно зв'язаний" у контексті даного опису відноситься до функціонального зв'язку між промотором і другою послідовністю, де промоторна послідовність ініціює й проводить транскрипцію послідовності ДНК, відповідної до другої послідовності. В основному, термін "оперативно зв'язаний" означає, що послідовності нуклеїнової кислоти, будучи зв'язаними, є безперервними і, де необхідно, з'єднують дві ділянки 19 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кодуючого білка, які безперервні й перебувають в одній рамці зчитування. Зазначена конструкція може додатково містити щонайменше один додатковий ген, який підлягає спільній трансформації в організм. Альтернативно, один або кілька додаткових генів можуть перебувати на багатьох конструкціях ДНК. Така конструкція ДНК включає велику кількість сайтів рестрикції для вбудовування послідовностей Cry токсину, транскрипція якого здійснюється регуляторними ділянками. Конструкція ДНК може також містити гени селектовуваного маркера. Конструкція ДНК буде включати в напрямку 5'-3' -транскрипції: ділянку ініціації транскрипції й трансляції (тобто промотор), послідовність ДНК за даним винаходом й ділянку термінації транскрипції й трансляції (тобто ділянка термінації), що функціонують в організмі, що виконують функцію хазяїна. Ділянка ініціації транскрипції (тобто промотор) може бути нативною, аналогічним, чужорідним або гетерологічним для організму-хазяїна і/або послідовності за даним винаходом. Додатково, промотор може являти собою природну послідовність або, альтернативно, синтетичну послідовність. Термін "чужорідний" у даному контексті означає, що зазначений промотор не знайдений у нативному організмі, у який уводять даний промотор. У тому випадку, коли промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" для послідовності за даним винаходом, уважається, що промотор не є нативним або природним промотором для оперативно зв'язаної послідовності за даним винаходом. У контексті даного опису, химерний ген включає кодуючу послідовність, оперативно пов'язану з ділянкою ініціації транскрипції, який є гетерологічним для кодуючої послідовності. Коли промотор є нативною або природною послідовністю, експресія оперативно зв'язаної послідовності міняється убік від експресії дикого типу, що приводить до зміни фенотипу. Ділянка термінації транскрипції може бути нативною для ділянки ініціації транскрипції, може бути нативною для оперативно зв'язаної послідовності ДНК, що представляє інтерес, може бути нативною для рослини-хазяїна або може бути отримана з іншого джерела (тобто буде чужорідною або гетерологічною для промотору, для розглянутої послідовності, для рослинихазяїна або будь-якої їхньої комбінації). Підходящі ділянки доступні з Ti-плазміди A.tumefaciens, такі як ділянки термінації октопінсинтази й нопалін-синтази. Див. також Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet.262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon ef al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogenefa (1990) Plantcell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; і Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. Де це прийнятне, нуклеїнова кислота може бути оптимізована для підвищення експресії в організмі-хазяїні. Так, коли організмом-хазяїном є рослина, можуть бути синтезовані синтетичні нуклеїнові кислоти з використанням кращих для рослини кодонів для підвищення експресії. Обговорення використання кращих для рослини кодонів наведене, наприклад, у роботі Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol.92:1-11. Наприклад, хоча послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом можуть експресуватися й в однодольних, і у дводольних рослинах, послідовності можуть бути модифіковані для відповідності специфічним кодоновим перевагам і перевагам по вмісту GC в однодольних і дводольних рослин, оскільки, як було показано, ці переваги різняться (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Так, кращий для кукурудзи кодон для конкретної амінокислоти може бути отриманий з відомих генних послідовностей кукурудзи. Використання кодонів кукурудзи для 28 генів з рослин кукурудзи описано в таблиці 4 у роботі Murray et al., supra. У даній галузі відомі способи синтезу кращих рослин генів. Див., наприклад, патенти США NoNo. 5380831 і 5436391 і Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498,. Відомі інші модифікації послідовності, які підвищують експресію гена в клітині-хазяїні. Вони включають елімінацію послідовностей, що кодують неправильні сигнали поліаденілювання, сигнали для сайт-сплайсингу екзона-інтрону, транспозон-подібні повтори й інші добре описані послідовності, які можуть бути несприятливими для генної експресії. Вміст GC у послідовності може бути відкорегований до середніх рівнів для даної клітини-хазяїна, який розраховується з урахуванням відомих генів, експресуємих у клітині-хазяїні. Термін « Клітина-хазяїн" у контексті даного опису відноситься до клітини, яка містить вектор і підтримує реплікацію і/або експресію вектора експресії. Клітини-Хазяїна можуть являти собою прокаріотичні клітини, такі як E. coli, або еукаріотичні клітини, такі як клітини дріжджів, комах, земноводних або ссавців або однодольних або дводольних рослин. Прикладом клітини-хазяїна однодольної рослини є Клітина-хазяїн кукурудзи. Коли це можливо, послідовність модифікують, для того, щоб уникнути можливого утворення вторинних шпилькових структур мРНК. 20 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Касети експресії можуть додатково містити 5'-лідерні послідовності. Такі лідерні послідовності можуть діяти в напрямку підвищення трансляції. Лідери для трансляції відомі у даній галузі й включають: лідер пікорновірусу, наприклад, EMCV лідер (5'-некодуюча ділянка енцефаломіокардиту) (Elroy-Stein (1989) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); лідери потівірусу, наприклад, TEV лідер (Etch вірус тютюну) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), MDMV лідер (вірус мозаїки, що викликає карликовість кукурудзи), білок зв'язування з важким ланцюгом імуноглобуліну людини (BiР) (Macejak etal. (1991) Nature 353: 90-94); нетрансльовуваний лідер із мРНК для білкової оболонки вірусу мозаїки люцерни (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625); лідер вірусу мозаїки тютюну (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); лідер вірусу хлорозу кукурудзи (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). Див. також Della-Cioppa etal. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968. При виготовленні касети експресії можуть використовуватися різні касети ДНК для одержання послідовності ДНК у потрібній орієнтації і, де це можливо, у відповідній рамки зчитування. У цьому зв'язку, можуть використовуватися адаптори або лінкери для сполуки фрагментів ДНК, або можуть проводитися інші маніпуляції для створення підходящих сайтів рестрикції, видалення надлишкової кількості ДНК, видалення сайтів рестрикції або т.п. Із цією метою, може проводитися мутагенез in vitro, відновлення праймерів, рестрикція, відпал, повторне заміщення, наприклад, переходи й перестановки. У практиці здійснення даного винаходу може використовуватися безліч промоторів. Промотори можуть бути обрані з урахуванням бажаного результату. Нуклеїнові кислоти можуть бути об'єднані з конститутивними, тканино-переважними, індуцибельними або іншими промоторами для експресії в організмі-хазяїні. Підходящі конститутивні промотори для використання в рослинній клітині-хазяїні включають, наприклад, ядерний промотор Rsyn7 промотору й інші конститутивні промотори, описані в WO 99/43838 і патенті США No. 6072050; ядерний промотор CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); актин рису (McЕlroy etal. (1990) Plant Cell 2:163-171); убіхітин (Christensen et al.(1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 and Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol.18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten etal. (1984) EMBOJ. 3:2723-2730); ALS промотор (патент США No. 5659026) і т.п. Інші конститутивні промотори включають, наприклад, промотори, описані в патентах США NoNo. 5608149, 5608144, 5604121, 5569597, 5,466,785, 5399680, 5268463, 5608142 і 6177611. Залежно від бажаного результату, може бути корисно проводити експресію гена з використанням індуцибельного промотору. Особливий інтерес для регуляції експресії нуклеотидних послідовностей за даним винаходом в рослинах представляють промотори, індуковувані ушкодженням. Такі індуковувані ушкодженням промотори можуть відповідати на ушкодження, викликане поїданням комах, і включають ген інгібітору протеїнази картоплі (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 494498); wun1 і wun2, патент США No. 5428148; win1 і win2 (Stanford et al.(1989) Mol. Gen. Genet. 215: 200-208); системін (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76); MPI ген (Corderok et al.(1994) Plant J. 6(2): 141-150); і т.п., включені в даний опис як посилання. Додатково, у способах і нуклеотидних конструкціях за даним винаходом можуть використовуватися промотори, індуковувані патогеном. Такі індуковувані патогеном промотори включають промотори з патогенез-родинних білків (PR білки), які індукуються після інфекції патогеном, наприклад, PR білки, SAR білки, бета-1,3-глюканаза, хітиназа й т.п. Див., наприклад, Redolfi et al. (1983) Neth. J.Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; і Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Див. також патент WO 99/43819, включений у якості посилання. Представляють також інтерес промотори, які експресуються локально, у сайті або поруч із сайтом інфекції патогеном. Див., наприклад, Marineau etal. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch et al.(1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; і Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Див. також Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J.3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; патент США No. 5750386 (індукція нематодою); посилання, що містяться в них. Особливий інтерес представляє індуцибельний промотор для Prms гена кукурудзи, експресія якого індукується патогеном Fusarium moniliforme (див., наприклад, Cordero et al. (1992) Physiol.Mol. Plant Path. 41:189-200). 21 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Хімічно регульовані промотори можуть використовуватися для модуляції експресії генів у рослині шляхом нанесення екзогенного хімічного регулятора. Залежно від мети, промотор може являти собою хімічно індуковуваний промотор, коли нанесення хімічної речовини індукує генну експресію, або хімічно репресуючий промотор, коли нанесення хімічної речовини пригнічує експресію гена. Хімічно індуковувані промотори відомі в даній галузі й включають, без обмеження, ln2-2 промотор кукурудзи, який активується бензолсульфонамідними гербіцидними рятувальниками, GST промотор кукурудзи, який активується гідрофобними електрофільними сполуками, які використовуються в якості гербіцидів, застосовуваних до сходів, і PR-1a промотор тютюну, який активується саліциловою кислотою. Інші, хімічно регульовані промотори, що представляють інтерес включають реагуючі на стероїди промотори (див., наприклад, індуковуваний глюкокортикоїдами промотор, описаний Schena et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 і McNellis etal. (1998) Plant J. 14(2):247-257) і тетрациклініндуковувані й тетрациклін-репресуючи промотори (див., наприклад, Gatz etal. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 і патенти США NoNo. 5814618 і 5789156), де всі зазначені роботи включені як посилання. Тканино-переважні промотори можуть використовуватися для досягнення підвищеної експресії пестицидного білка в конкретній тканині рослини. Тканино-переважні промотори включають промотори, описані в: Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):13311341; Van Camp et al.(1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol.23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; і Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Такі промотори можуть бути модифіковані, при необхідності, для ослаблення експресії. Кращі для лисття промотори відомі в даній галузі. Див., наприклад, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco etal. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; і Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590. Кращі для коріння або корнеспецифічні промотори відомі й можуть бути обрані з багатьох доступних літературних джерел або виділені de novo з різних сумісних видів. Див., наприклад, Hire ef al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (корнеспецифічний ген глютамінсинтетази сої); Keller and Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (корнеспецифічний контрольний елемент в GRP 1.8 гени французької квасолі); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (корнеспецифічний промотор гена маннопін-синтази (MAS) з Agrobacterium tumefaciens); і Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (повнорозмірний клон кДНК, що кодує цитозольну глютамінсинтетазу (GS), який експресується в коріннях і кореневих клубеньках сої). Див. також Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7):633-641, де описано два корнеспецифичних промоторів, виділені з генів гемоглобіну небобового азотфиксатора Parasponia andersonii і родин небобової рослини, що не фіксує азот, Trema tomentosa. Промотори цих генів були з'єднані з репортерним геном бета-глюкоронидази й уведені в небобову рослину Nicotiana tabacum і в бобову рослину Lotus corniculatus, і в обох випадках зберігалася корнеспецифічна промоторная активність. Leach and Aoyagi (1991) описують аналіз промоторів високо експресуємих індуцируємих у коріннях генів rolc і rold з Agrobacterium mizogenes (див. Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Вони зробили висновок, що енхансер і тканинопереважні детермінанти ДНК дисоціюють у цих промоторах. Teeri et al. (1989) використовував злиття гена з lacz і показав, що Т-DNA ген Agrobacterium, що кодує октопінсинтазу, особливо активний в епідермісі кінчиків корінь і що ген TR2' є корнеспецифічним в інтактній рослині й стимулюється ушкодженням тканини лисття, що є особливо бажаною комбінацією характеристик для використання з інсектицидним або ларвицидним геном (див. EMBO J 8(2):343-350). Ген TR1', злитий з nptii (неоміцинфосфотрансфераза II), демонстрував аналогічні характеристики. Додаткові корненайкращі промотори включають промотор гена Vfenod-grp3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759772); і промотор rolb (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691). Див. також патенти США NoNo. 5837876, 5750386, 5633363, 5459252, 5401836, 5110732 і 5023179. "Специфічні для насіння" промотори включають як "специфічні для насіння" промотори (промотори, які активні в ході розвитку насіння, такі як промотори білків, зберігающегося насіння), так і промотори « насіння, що проростають, » (промотори, активні при проростанні насіння). Див. Thompson et al. (1989) Bioessays 10:108, де зазначена робота включена як посилання. Такі кращі для насіння промотори включають, без обмеження, Cim1 (цитокиніндуковуваний мессенджер); cz19B1 (зеїн кукурудзи розміром 19 кДа); і milps (міо-інозит-1 22 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фосфат-синтаза) (див. патент США No. 6225529, включений у якості посилання). Гамма-зеін і Glob-1 являють собою специфічні для ендосперму промотори. У випадку дводольних рослин, специфічні для насіння промотори включають, без обмеження, β-фазеолін, напін, β-конгліцинин квасолі, соєвий лектин, круциферин і т.п. У випадку однодольних рослин, специфічні для насіння промотори включають, без обмеження, зеїн кукурудзи розміром 15 кДа, зеїн розміром 22 кДа, зеїн розміром 27 кДа, g-зеїн, waxy, shrunken 1, shrunken 2, глобулін 1 і т.п. См також включений у якості посилання патент WO 00/12733, у якому описуються кращі для насіння промотори з генів end1 і end2. Промотор, який характеризується "кращою" експресією в конкретній тканині, експресується в цій тканині на більш високому рівні, ніж в іншій, щонайменше однієї рослиній тканині. Деякі тканиро-переважні промотори демонструють практично ексклюзивну експресію в конкретній тканині. Коли бажаний низький рівень експресії, використовують слабкі промотори. В основному, термін "слабкий промотор" використовується в даному описі для позначення промотору, який направляє експресію кодуючої послідовності, на низькому рівні. При низькому рівні експресії утворюються від приблизно 1/1000 транскриптів до приблизно 1/100,000 і до приблизно 1/500,000 транскриптів. Альтернативно, термін "слабкий промотор" також означає промотори, які направляють експресію тільки в деяких клітинах, але не в інших, з досягненням низького рівня експресії. У тому випадку, коли промотор направляє експресію на неприйнятно високих рівнях, частині промоторної послідовності можуть бути делетировані або модифіковані для зниження рівнів експресії. Такі слабкі конститутивні промотори включають, наприклад, ядерний промотор Rsyn7 промотору (WO 99/43838 і патент США No. 6072050), ядерний промотор 35S Camv і т.п. Інші конститутивні промотори включають, наприклад, промотори, описані в патентах США NoNo. 5608149, 5608144, 5604121, 5569597, 5466785, 5399680, 5268463, 5608142 і 6177611, включених у якості посилання. В основному, касета експресії включає селектовуваний маркерний ген для селекції трансформованих клітин. Селектовувані маркерні гени використовуються для селекції трансформованих клітин або тканин. Маркерні гени включають гени, що кодують резистентність до антибіотиків, такі як гени, що кодують неоміцин-фосфотрансферазу II (NEO) і гігроміцинфосфотрансферазу (HPT), а також гени, що надають резистентність до гербіцидних з'єднань, таким як глюфозинат амонію, бромоксиніл, імідазолінони й 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). Додаткові приклади підходящих селектуємих маркерних генів включають, без обмеження, гени, що кодують резистентність до хлорамфеніколу (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); метотрексату (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; і Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 76:807-820); стрептоміцину (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 270:86-91); спектиноміцину (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); блеоміцину (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); сульфонаміду (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 75:127-136); бромоксиніл у (Stalker et al. (1988) Science 30 242:419-423); гліфозату (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481; і серійні заявки на патенти США NoNo. 10/004357 і 10/427692); фосфінотрицину (Deblock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Див. також Yarranton (1992) Curr. Opin.Biotech. 3: 506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu etal. (1987) Ce//48: 555-566; Brown et al. (1987) Ce//49: 603-612; Figge et al. (1988) Ce//52: 713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86: 2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3952-3956; Bairn et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072-5076; Wyborski etal. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb etal. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); и Gill et al. (1988) Nature 334: 721-724 Зазначені роботи включені як посилання. Наведений вище перелік селектовуваних маркерних генів не слід розглядати як обмежуючий. Будь-який селектовуваний маркерний ген може використовуватися в практиці здійснення даного винаходу. Способи за даним винаходом включають уведення поліпептиду або полінуклеотиду в рослину. Термін "уведення" означає надання рослині полінуклеотиду або поліпептиду в такому 23 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 режимі, що зазначена послідовність одержує доступ усередину клітини рослини. Способи за даним винаходом не залежать від конкретного методу введення полінуклеотиду або поліпептиду в рослину, головне, щоб зазначені полінуклеотид або поліпептиди одержували доступ усередину щонайменше однієї клітини рослини. Способи введення полінуклеотиду або поліпептидів у рослини відомі в даній галузі й включають, методи стабільної трансформації, методи тимчасової трансформації й методи, засновані на застосуванні вірусів. "Стабільна трансформація" означає, що нуклеотидна конструкція, уведена в рослину, інтегрувалася в геном рослини й здатна передаватися потомству. "Тимчасова трансформація" означає, що полінуклеотид уведений у рослину й не інтегрований у геном рослини або поліпептид уведений у рослину. Протоколи трансформації, а також протоколи введення нуклеотидних послідовностей у рослину можуть варіювати, залежно від типу рослини й рослинної клітини, т.е однодольна ця рослина або дводольна, що підлягає трансформації. Підходящі способи введення нуклеотидних послідовностей у клітини рослин і наступного вбудовування в геном рослини включають мікроін'єкцію (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), електропорацію (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606), трансформацію з використанням Agrobacterium (патенти США NoNo. 5563055 і 5981840), прямий генний перенос (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722), і обробку швидкими балістичними частками (див, наприклад, патенти США NoNo. 4945050, 5879918, 5886244 і 5932782; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); і McСabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); і Lecl трансформацію (WO 00/28058). Стосовно до картопляної трансформації див. Tu et al. (1998) Plant Molecular Biology 37: 829-838 і Chong et al. (2000) Transgenic Research 9:71-78. Інші процедури трансформації описані в роботах: Weissinger et al.(1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (цибуля); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (соя); McСabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (соя); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (соя); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (соя); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (рис); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (кукурудза); Klein etal. (1988) Biotechnology 6:559-563 (кукурудза); патенти США NoNo. 5240855, 5322783 і 5324646; Klein et al. (1988) Plant Physiol.91: 440-444 (кукурудза); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833839 (кукурудза); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; патент США No. 5736369 (зернові); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (пилок); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (whisker-опосередкована трансформація); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (електропорація); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 і Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (рис); Osjoda et al.(1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (кукурудза, через Agrobacterium tumefaciens), які, усі, включені в даний опис як посилання. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу, послідовності за даним винаходом можуть бути введені в рослину з використанням різних методів тимчасової трансформації. Такі методи тимчасової трансформації включають, без обмеження, уведення білка Cry токсину або його варіантів і фрагментів безпосередньо в рослину або введення транскрипту Cry токсину в рослину. Такі методи включають, наприклад, мікроін'єкцію або бомбардування частками. Див., наприклад, Crossway et al. (1986) Mol Gen. Genet. 202: 179-185; Nomura et al. (1986) Plant Sci. 44: 53-10 58; Hepler et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 2176-2180 and Hush ef al. (1994) The Journal of Cell Science 107: 775-784, де всі зазначені роботи включені в даний опис як посилання. Альтернативно, полінуклеотид Cry токсину може бути тимчасово трансформований у рослину з використанням процедур, відомих у даній галузі. Такі процедури включають системи на основі вірусного вектора й осадження полінуклеотиду таким чином, що попереджається наступне вивільнення ДНК. Таким чином, транскрипція такої пов'язаної із часткою ДНК може відбуватися, але частота, з якої вона вивільняється для інтеграції в геном, дуже знижена. Такі методи включають використання часток, покритих поліетиламіном (PEI; Sigma #P3143). У даній галузі відомі способи цільового вбудовування полінуклеотиду в конкретне положення в рослинному геномі. В одному варіанті, вбудовування полінуклеотиду в бажаному положенні в геномі досягається з використанням сайт-специфічної системи рекомбінації. Див., наприклад, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855 і W099/25853, які включені в якості посилання. Загалом, процедура полягає в тому, що полінуклеотид за даним винаходом може втримуватися в касеті переносу, фланкований двома неідентичними сайтами рекомбінації. Касету переносу вводять у рослину, у геном якої її слід стабільно включити в 24 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 цільовому сайті, який фланкований двома неідентичними сайтами рекомбінації, відповідними до сайтів у касеті переносу. Підходяща рекомбіназа є. і касета переносу інтегрується в цільовий сайт. Таким чином, полінуклеотид, що представляє інтерес, буде інтегрований у конкретному положенні хромосоми в рослинному геномі. Клітини, трансформовані таким чином, можуть бути вирощені з одержанням рослин, з використанням стандартних способів. Див., наприклад, McСormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Ці рослини можуть бути потім вирощені й далі вони будуть запилюватися тим же трансформованим штамом або іншими штамами, і отриманий гібрид буде відрізнятися конститутивною або індуцибельною експресією ідентифікованою бажаною фенотиповою характеристикою. Може бути вирощено два або більш поколінь, для гарантії того, що експресія бажаної фенотипової характеристики стабільно підтримується й успадковується й що зібрані насіння також будуть підтримувати експресію бажаної фенотипової характеристики. Нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть бути введені в рослину шляхом контакту рослини з вірусом або нуклеїновими кислотами вірусу. В основному, такі методи включають уведення потрібної нуклеотидної конструкції в молекулу вірусної ДНК або РНК. Відомо, що рекомбінантні білки за даним винаходом можуть спочатку синтезуватися у вигляді частини вірусного поліпротеїну, який пізніше може бути процесований шляхом протеолізу in vivo або in vitro з бажаного пестицидного білка. Відомо також, що такий вірусний проліпротеїн, що включає щонайменше частину амінокислотної послідовності пестицидного білка за даним винаходом, може мати бажану пестицидну активність. Такі вірусні поліпротеїни й нуклеотидні послідовності, які їх кодують, охоплюються галуззю даного винаходу. У даній галузі відомі способи одержання рослин з використанням нуклеотидних конструкцій і утворенням кодуючих ними білків у рослинах, які включають молекули вірусної ДНК або РНК. Див., наприклад, патенти США NoNo. 5889191, 5889190, 5866785, 5589367 і 5,316,931, які включені в даний опис як посилання. Інші варіанти здійснення даного винаходу відносяться до матеріалу для розмноження рослин, застосовоному до рослини, що трансформується, за даним винаходом, що включає, без обмеження, насіння, коренеплоди, качани, бульби, лисття й черешки коріння і стебла. Даний винахід у всіх варіантах свого здійснення може використовуватися для трансформації будь-якого виду рослини, що включає, без обмеження, однодольні й дводольні рослини. Приклади рослин, що представляють інтерес, включають, без обмеження, кукурудзу (Zea mays), Brassica sp. (наприклад, B. napus, B. rapa, B.juncea), зокрема, види Brassica, використовувані в якості джерел масла з насіння, люцерну (Medicago sativa), рису (Oryza sativa),жито (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), проса (наприклад, пенісетум рогозовидний (Pennisetum glaucum), проса звичайного (Panicum miliaceum), проса італійського (Setaria italica), проса пальчастого (Eleusine coracana)), соняшника (Helianthus annuus), сафлор (Carthamus tinctorius), пшениці (Triticumaestivum), сої (Glycine max), тютюну (Nicotiana tabacum), картоплі (Solanumtuberosum), арахісу (Arachis hypogaea), бавовни (Gossypium barbadense Gossypium hirsutum), солодкої картоплі {Ipomoea batatus), касави (Manihot esculenta),кави (Coffea spp.), кокосу {Cocos nucifera), ананасу {Ananas comosus), цитрусового дерева (Citrus spp.), какао (Theobroma cacao), чаю (Camellia sinensis), банану (Musa spp.), авокадо (Persea amehcana), інжиру (Ficus casica), гуаву (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), оливки (O/ea europaea), папайю (Carica papaya), горіху кешью (Anacardium occidentale), макадамского горіху (Macadamia integrifolia), мигдалю (Prunusamygdalus), цукрового буряку {Beta vulgaris), цукрового очерету (Saccharum spp.), овсу, ячміню, городини, декоративних рослин й хвойних. Городини включають томати (Lycopersicon esculentum), латук (наприклад, Lactuca sativa), зелену квасолю (Phaseolus vulgaris), лімську квасолю (Phaseolus limensis), горох (Lathyrus spp.) і представників роду Cucumis, таких як огірок (C. sativus),канталупа (C. cantalupensis) і мускусна диня (C. melo). Декоративні рослини включають азалію (Rhododendron spp.), гортензію (Macrophylla hydrangea), гібіскус (Hibiscus rosasanensis),троянди (Rosa spp.), тюльпани (Tulipa spp.), жовті нарциси (Narcissus spp.), петуньї (Petunia hybrida), гвоздику (Dianthus caryophyllus), пуансетію (Euphorbia pulcherrima) і хризантему. Хвойні рослини, які можуть використовуватися в практиці здійснення даного винаходу, включають, наприклад, сосни, такі як сосна ладанна (Pinus taeda), сосна Елліота (Pinus elliotii), жовта сосна (Pinus ponderosa), сосна скручена, широкохвойна (Pinuscontorta) і промениста сосна (Pinus radiata); дугласову ялицю (Pseudotsuga menziesii);тсугу західну (Tsuga canadensis); ялину ситхенску (Picea glauca); червону деревину (Sequoia sempervirens); справжні ялиці, такі як сріблиста ялиця (Abies amabilis) і бальзамна ялиця (Abies balsamea); і кедри, такі як кедр червоний західний (Thuja plicata) і аляскинский жовтий кедр (Chamaecyparis nootkatensis). Рослини за даним винаходом включають культурні 25 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рослини (наприклад, кукурудзу, люцерну, соняшник, Brassica, сою, бавовну, сафлор, арахіс, сорго, пшеницю, просо, тютюн і т.п…), такі як рослини кукурудзи й сої. Газонна трава включає, без обмеження: однолітній м′ятлик (Poa annua);однолітній плевел (Lolium multiflorum); м′ятлик сплюснений (Poa compressa); вівсяницю (Festuca rubra); мітлицю (Agrostis tenuis); мітлицю повзучу (Agrostis palusths); пирій гребенчатий (Agropyron desertorum); пирій пустирний (Agropyron cristatum); вівсяницю жестковату (Festuca longifolia); м′ятлик луговий (Poa pratensis); їжакову збірню (Dactylis glomerata); плевел багаторічний (Lolium perenne);вівсяницю червону (Festuca rubra); мітлицю білу (Agrostis alba);м′ятлик звичайний (Poa trivialis);вівсяницю овечу (Festuca ovina); багаття м'яке (Bromus inermis); вівсяницю гігантську (Festuca arundinacea); тимофіївку (Phleum pretense); мітлицю оксамитову (Agrostiscanina); уніолу колосисту (Puccinellia distans); пирій західний (Agropyron smithii); бермудську траву (Cynodon spp.); августинову траву (Stenotaphrum secundatum); цойсію японську (Zoysia spp.); гречку помітну (Paspalum notatum); килимову траву (Axonopus affinis); траву-багатоніжку (Eremochloa ophiuroides); траву кикуйю (Pennisetum clandesinum); траву паспалон (Paspalum vaginatum); пасовищну траву блакитну (Bouteloua gracilis); бізонову траву (Buchloe dactyloids); бутелуа короткопоникающую (Bouteloua curtipendula). Рослини, що представляють інтерес, включають зернові рослини, які дають насіння, що представляють інтерес, олійні рослини й бобові. Насіння, що представляють інтерес, включають зернові насіння культур, таких як кукурудза, пшениця, ячмінь, рис, сорго, жито, просо й т.п. Олійні рослини включають бавовну, сою, сафлор, соняшник, Brassica, кукурудзу, люцерну, пальму, кокос, льон, рицину, оливки й т.п. Бобові рослини включають боби й горох. Боби включають гуар, ріжкове дерево, фенхель, сою, садову квасолю, вигну китайську, боби маш, лімську квасолю, стручкову квасолю, сочевицю, турецький горох і т.п. У деяких варіантах здійснення даного винаходу, послідовності нуклеїнових кислот за даним винаходом можуть бути об'єднані з будь-якою комбінацією полінуклеотидних послідовностей, що представляють інтерес, для створення рослин з бажаним фенотипом. Наприклад, полінуклеотиди за даним винаходом можуть бути об'єднані з будь-якими іншими полінуклеотидами, що кодують поліпептиди, що володіють пестицидною і/або інсектицидною активністю, такі як інші Bt токсичні білки (описані в патентах США NoNo. 5366892, 5747450, 5736514, 5723756, 5593881 і Geiser et al. (1986) Gene 48:109), пентин (описаний у патенті США No. 5981722) і т.п. Отримані комбінації можуть також включати множинні копії кожного з полінуклеотидів, що представляють інтерес. Полінуклеотиди за даним винаходом можуть бути також об'єднані з будь-яким іншим геном або комбінацією генів для одержання рослин з безліччю комбінацій бажаних ознак, що включають, без обмеження, ознаки, бажані для корму тварин, такі як гени, що визначають високий вміст масла (наприклад, патент США No. 6232529); збалансованість по амінокислотному складу (наприклад, гордотіоніни (патенти США NoNo. 5990389, 5885801; 5885802 і 5703049)); високий вміст лізину в ячмені (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106; and WO 98/20122) і високий вміст метіоніну в білках (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359; і Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); підвищену розщеплюємість (наприклад, модифіковані білки зберігання (серійна заявка на патент США No. 10/053410, зареєстрована 7 листопада 2001 р.); і тіоредоксини (серійна заявка на патент США No. 10/005429, зареєстрована 3 грудня 2001 р.)), включені в даний опис як посилання. Полінуклеотиди за даним винаходом також можуть бути об'єднані з елементами, бажаними для досягнення резистентності до захворювань або гербіцидів (наприклад, гени детоксикації фумонизину (патент США No. 5792931)); з генами авірулентності й резистентності до захворювання (Jones et al.(1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; і Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); з мутантами по ацетолактат-синтазі (ALS), які ведуть до резистентності до гербіцидів, що включають такі мутації як S4 і/або Hra; з інгібіторами глютамінсинтази, такими як фосфінотрицин або баста (наприклад, bar ген); і елементами, що визначають резистентність до гліфозату (EPSPS ген і GAT ген, описаний у серійних заявках на патент США NoNo. 10/004357 і 10/427692); і з елементами, що сприяють досягненню ознак, бажаних для обробки або процесингу продуктів, таких як високий вміст масла (наприклад, патент США No. 6232529); модифіковані масла (наприклад, гени десатурази жирних кислот (патент США No. 5952544; WO 94/11516)); модифіковані крохмалі (наприклад, ADPGпірофосфорилази (AGPаза), крохмаль-синтази (SS), ветвящие крохмаль ферменти (SBE) і ферменти, що знижують розгалуження крохмалю (SDBE)); і полімери біопластиків (наприклад, патент США No. 5602321; бета-кетотіолаза, полігідроксибутират-синтаза й ацетоацетил-кoaредуктаза (Schubert et al.(1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847) сприяють експресії полігідроксиалканоатів (PHA)), опис яких включено в якості посилання. Можна також поєднувати 26 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полінуклеотиди за даним винаходом з полінуклеотидами, що визначають агрономічні ознаки, такі як чоловіча стерильність (див., наприклад, патент США No. 5583210), міцність стебла, час цвітіння, або з елементами, що визначають метод трансформації, такими як регуляція клітинного циклу й цільовий вплив на ген (наприклад, WO 99/61619, WO 00/17364, WO 25 99/25821), опис яких включено в якості посилання. Зазначені об'єднані комбінації можуть бути створені по будь-якому способу, що включає, без обмеження, перехресне запліднення рослин за традиційною методикою або по методу TOPCROSS® або шляхом генетичної трансформації. Якщо об'єднання ознак було здійснено шляхом генетичної трансформації рослини, що представляють інтерес полінуклеотидні послідовності можуть бути об'єднані в будь-який час і в будь-якому порядку. Наприклад, трансгенна рослина, що включає один або кілька бажаних ознак, може використовуватися в якості мішені для введення інших ознак шляхом наступної трансформації. Зазначені ознаки можуть уводитися одночасно по протоколу спільної трансформації з полінуклеотидами, що представляють інтерес, у зв'язку з будь-якою їхньою комбінацією в касетах трансформації. Наприклад, якщо слід увести дві послідовності, те зазначені дві послідовності можуть утримуватися в окремих касетах трансформації (транс) або втримуватися в одній і тій же касеті трансформації (цис). Експресія послідовностей може направлятися тим самим промотором або різними промоторами. У деяких випадках, може бути бажане вводити касету трансформації, яка буде пригнічувати експресію полінуклеотиду інтерес, що представляє. Вона може бути об'єднана з будь-якою комбінацією інших касет супресії або касет суперекспресії для створення бажаної комбінації ознак у рослині. Відомо також, що полінуклеотидні послідовності можуть бути об'єднані в бажанім положенні генома з використанням системи сайт- специфічної рекомбінації. Див., наприклад, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855, і W099/25853, які включені в даний опис як посилання. Композиції за даним винаходом знаходять застосування в захисті різними способами рослин, насіння і продуктів рослин. Наприклад, зазначені композиції можуть використовуватися в рамках способу, який включає внесення ефективної кількості пестицидної композиції в середовище проживання шкідника по процедурі, обраній із групи, що полягає з розбризкування, розпилення, розкидання або нанесення покриття на насіння. Перед тем, як матеріал для розмноження рослин (плід, коренеплід, бульба, бульбоцибулина, зерна, насіння), особливо насіння, продаються в якості комерційного продукту, його звичайно обробляють захисним покриттям, що включають гербіциди, інсектициди, фунгіциди, бактерициди, нематоциди, молюскоциди або суміші декількох таких препаратів, якщо бажане, у комбінації з іншими носіями, поверхнево-активними речовинами або сприятливими нанесенню допоміжними речовинами, звичайно використовуваними при одержанні композиції, для забезпечення захисту проти ушкодження, викликаного бактеріальними, грибними шкідниками або тваринами-шкідниками. Для обробки насіння, захисне покриття може наноситися на насіння або шляхом просочування коренеплодів або зерен рідкою композицією або шляхом нанесення на них покриття з об'єднаної вологої або сухої композиції. Додатково, в особливих випадках можливе застосування інших способів нанесення на рослину, наприклад, обробка бруньок або плодів. Насіння рослин за даним винаходом, що включають нуклеотидну послідовність, що кодує пестицидний білок за даним винаходом, можуть бути оброблені захисним покриттям для насіння, що включають сполуки, використовуване для обробки насіння, таке як, наприклад, каптан, карбоксин, тирам, металаксил, піриміфос-метил і інші, які звичайно використовуються при обробці насіння. В одному варіанті, захисне покриття для насіння, що включає пестицидну композицію за даним винаходом, використовують одне або в комбінації з одним із захисних покриттів для насіння, звичайно використовуваних при обробці насіння. Відомо, що гени, що кодують пестицидні білки, можуть використовуватися для трансформації патогенних організмів для комах. Такі організми включають бакуловіруси, гриби, найпростіші, бактерії й нематоди. Ген, що кодує пестицидний білок за даним винаходом, може бути введений у підходящому векторі в мікробний організм-хазяїн, і зазначений хазяїн далі може бути внесений у середовище проживання або в рослину або у тварину. Термін "уводиться" у контексті вбудовування нуклеїнової кислоти в клітину означає "трансфекцію" або "трансформацію" або "трансдукцію" і відноситься до тем посиланням по включенню нуклеїнової кислоти в еукаріотичну клітину, де нуклеїнова кислота могла бути включена в клітину (наприклад, у хромосому, плазміду, пластиду або мітохондріальну ДНК), з наступним перетворенням в автономний реплікон, або де вона тимчасово експресувалася (наприклад, трансфікована мРНК). Можуть бути обрані мікроорганізми-хазяї, у відношенні яких відомо, що вони займають "фітосферу" (філоплан, 27 UA 108348 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 філосферу, ризосферу і/або ризоплан) однієї або декількох культур, що представляють інтерес. Зазначені організми можуть бути обрані таким чином, щоб вони були здатні успішно конкурувати в конкретнім навколишньому середовищі з мікроорганізмами дикого типу, забезпечуючи стабільне/у підтримку й експресію гена, експресуючого пестицидний білок, і бажане, забезпечуючи підвищений захист пестициду від розкладання й інактивації в навколишньому середовищі. Такі мікроорганізми включають бактерії, водорості й гриби. Особливий інтерес представляють мікроорганізми, такі як бактерії, наприклад, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc і Alcaligenes, гриби, зокрема, дріжджі, наприклад, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula і Aureobasidium. Особливий інтерес представляють такі фітосферні види бактерій, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli і Azotobacter vinelandii, і фітосферні види дріжджів, такі як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C.laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми. Доступна безліч способів для введення гена, експресуючого пестицидний білок, у мікроорганізм-хазяїн в умовах, які дозволяють стабільна підтримка й експресію даного гена. Наприклад, можуть бути сконструйовані касети експресії, які включають, що представляють інтерес нуклеотидні конструкції, оперативно пов'язані з регуляторними сигналами транскрипції й трансляції, для експресії нуклеотидних конструкцій, і нуклеотидну послідовність, гомологічну послідовності в організмі-хазяїні, що приводить до інтеграції і/або до функціонування системи реплікації в хазяїні, що приведе до інтеграції або уводити, увести до ладу стабільній підтримці. Регуляторні сигнали транскрипції й трансляції включають, без обмеження, промотори, старт-сайти ініціації транскрипції, оператори, активатори, енхансери, інші регуляторні елементи, сайти зв'язування з рибосомою, кодон ініціації, сигнали термінації й т.п. Див., наприклад, патенти США NoNo. 5039523 і 4853331, EPO 0480762A2; Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Maniatis ef al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), далі "Sambrook II"; Davis et al., eds. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, New York; посилання, що й утримуються в роботах Підходящі клітини-хазяї, у випадку яких клітини, що містять пестицидний білок, обробляються для продовження активності пестицидного білка в клітині, коли оброблена клітина вноситься в середовище проживання одного або декількох шкідників, можуть включати прокаріотів або еукаріотів, які звичайно обмежені тими клітинами, які не утворюють речовин, токсичних для вищих організмів, таких як ссавці. Однак, організми, які утворюють речовини, токсичні для вищих організмів, можуть використовуватися в тому випадку, коли токсин нестабільний або рівень нанесення досить низький, що дозволить уникнути якої-небудь можливості токсичності для організму-хазяїна ссавця. У якості хазяїв, особливий інтерес представляють прокаріоти й нижчі еукаріоти, такі як гриби. Репрезентативні приклади прокаріотів, і Грам-негативних, і Грам-позитивних, включають Enterobacteriaceae, такі як Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella і Proteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, такі як Rhizobium; Spirillaceae, такі як фотобактерія, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, такі як Pseudomonas і Acetobacter, Azotobacteraceae і Nitrobacteraceae. У число еукаріотів включаються гриби, такі як Phycomycetes і Ascomycetes, які включають дріжджі, такі як Saccharomyces і Schizosaccharomyces;і дріжджі Basidiomycetes, такі як Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces і т.п. Характеристики, що представляють особливий інтерес при виборі клітини-хазяїна для цілей продукції пестицидного білка, включають легкість уведення гена пестицидного білка в організм хазяїна, доступність систем експресії, ефективність експресії, стабільність білка в організміхазяїні й наявність допоміжних генетичних якостей. Характеристики, що представляють інтерес у випадку використання в якості пестицидної мікрокапсули, включають захисні якості для пестициду, такі як товсті клітинні стінки, пігментація й внутрішньоклітинне впакування або утвір тіл включення; афіність для листів; відсутність токсичності для ссавців; атрактивність для поїдання шкідниками; легкість знищення й фіксації без ушкодження токсину й т.п. Інші фактори включають легкість створення композиції й роботи з нею, економічність, стабільність при зберіганні й т.п. 28