Спосіб виготовлення ентомоцидного препарату бацилотурінгу-м на основі bacillus thuringiensis var. thuringiensis л-4

Спосіб виготовлення біопрепарату для захисту рослин від листогризучих шкідників, який включає посів клітин штаму бактерій Bacillus thuringiensis var. thuringiensis Л-4, депонованого в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології C2 2 (19) 1 3 85074 13. 25.09.85) [1], який включає культивування Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 98 (основа препарату бітоксибациліну) в ферментері на середовищі з 3,0% кормових дріжджів, 1,5% кукурудзяної муки. Початкове рН середовища 7,0. Аерація 5л/хв., швидкість мішалки - 450 об/хв. Починаючи з 18 години культивування, кожні 30 хвилин відбирались проби бактеріальної суспензії; на 19 годину відмічали початок спороутворення і вносили додатково ферментолізат кормових дріжджів з 500мг % амінного азоту. На 36 годину ви хід спор був 5,8млрд. спор/см 3. Без внесення додаткового джерела азоту вихід спор був 4,3млрд./см 3 на 40 годину культивування. Недоліками цього способу є: додаткове внесення ферментолізату кормових дріжджів на стадії спороутворення з метою підвищення виходу спор бактерій; компоненти вищезазначеного середовища (кормові дріжджі і ферментолізат дріжджів) не виробляються в Україні; кукурудзяна мука потребує енергоємного процесу розмелу; титр спор в одержаному препараті невисокий. Відомий "Способ культивирования энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis "(Авторское свидетельство №1833523 АЗА 01N63/00, С12 N 1/20. Заявка № 4755532/13 от 27.07.89) [2], який включає культивування Bacillus thuringiensis var. thuringiensis ИПМ 1140 на середовищі такого складу (%) /дріжджі кормові - 3,5-4,3; джерело вуглеводу (по редукційним речовинам) - 1,7-2,3; (NH4)2HPO4 - 0,4-0,6; натрію тіосульфат - 0,07-0,12, початкове рН середовища після стерилізації - 8,08,2. Ферментація відбувалась 44-48 годин, титр спор на 48 годину становив 7,0млрд./см 3. Цей спосіб можна вважати прототипом. Недоліками цього способу є: використання кормових дріжджів, які не виробляються в Україні; кукурудзяної муки, кукурудзяного крохмалю; додаткове внесення тіосульфату натрію для підвищення титру спор і вмісту екзотоксину, а також підвищене значення рН. Відомий "Спосіб виготовлення пастоподібного ентомоцидного біопрепарату на основі бактерій Bacillus thuringiensis" (Патент України № 56033 А С12Р/04, C12N1/20, C12N3/00. Заявка 2002097414 12.09.2003) [3], який включає виготовлення препарату на середовищі такого складу (%): кукурудзяний екстракт - 2,0; меляса - 1,5; К2НРO4 - 0,02; КН2РO4 - 0,05. Початкове рН середовища - 7,4-7,8. На 48 годину культивування отримують титр спор 2,0млрд./см 3. Недоліками цього способу є: використання поживного середовища, яке не забезпечувало високий титр спор; отримання пасти проводили шляхом центрифугування концентрату, відокремлення і зливання надосадної рідини, залишаючи концентрат без водорозчинного екзотоксину, чим знижували ефективність препарату. Метою пропонованого нами винаходу є одержання вітчизняного бактеріального препарату на основі Bacillus thuringiensis var. thuringiensis Л-4 на збалансованому поживному середовищі без внесення додаткових компонентів, яке б забезпечило титр спор в концентраті суспензії не менше 810млрд./см 3. 4 Мета досягається шляхом використання більш дешевих і доступних в Україні складових середовища (меляса і кукурудзяний екстракт), енергозберігаючої технології культивування (зрілість культури у запропонованому середовищі досягається через 39-40 годин проти 44-48 годин у прототипу), одержання сухого порошку (вміст вологи - 8-10%) швидкорозчинного з приємним запахом, сушки через форсунки у нагрітому повітрі всього поживного середовища зі спорами, кристалами і токсинами, отримання кінцевого продукту з вмістом продуктивних спор у 1г - 45млрд., без додаткового внесення джерел азоту і вуглеводу. Крім того, виключається енергоємна стадія центрифугування концентрату суспензії. На запропонованому нами середовищі без додаткового джерела азоту, вуглеводу на 36 годину культивування титр продуктивних спор був 8,5млрд. в см 3. На 40 годину культивування 10,0млрд./см 3. Середовище має такий склад (%): кукурудзяний екстракт - 2,0; меляса - 2,0; (NH4)2HPO4 - 0 ,24; К2НРO4 - 0,051; мікроелементи - Mg, Mn, Fe, Zn, початкове рН до стерилізації 7,3-7,5. Приклад 1. Спосіб виготовлення бацилотурінгу-М здійснюється таким чином. Розмножували культур у бактерій на скошеному агарі, перевіряли чистоту культури. Готували поживне середовище такого складу (%): кукурудзяний екстракт - 2,0; меляса - 2,0; (NH4)2HPO4 - 0,24; К2НРO4 - 0,051; мікроелементи - Mg, Mn, Fe, Zn. Початкове pH 7,3-7,5. Розчини 50% кукурудзяного екстракту і меляси стерилізували окремо і вносили стерильними. Середовище розливали у колби і стерилізували за температури (118±2)°С 40 хвилин. Перевіряли якість стерилізації висівом однієї краплі середовища на м'ясо-пептонний агар. Готували маточну культур у шля хом двох послідовних пасажів в колбах з поживним середовищем на технологічній качалці (220об/хв), при температурі (30±2)°С протягом 18-20 годин. Культуру др угого пасажу (посівний матеріал) використовували для засіву виробничого середовища в кількості 0,5-1,0% від об'єму середовища у ферментері. Запропоноване середовище мало такі показники: pH - 7,0, загальні редукуючи речовини - 1,7%, амінний азот -0,095%. Відбір проб проводили через 1-2 години, перевіряли фізіологічний стан культури на мікроскопі, проводили контроль температури, pH. Витрати повітря становили - 14-16м 3/годину, тиск - 0,4 Бар, температура - 30±2°С. Кінець ферментації визначали за утворенням вільних спор в кількості не менше 30%, за pH - 8,0-8,4. На 36 годину ферментації отримували концентрат суспензії з титром продуктивних спор - 8,5млрд. /см 3. На 40 годину ферментації - 10 млрд./см 3. Після ферментації концентрат суспензії охолоджували у ферментері до температури оточуючого середовища, потім додавали 7-8% наповнювача і висушували на розпиленій сушці. На вході температура повітря становила -135°С, на виході 65°С. В результаті отримували сухий концентрат бактерій. 5 85074 Титр спор у концентраті визначали за методом Пастера, вміст b-ендотоксину - за методом Ялові 6 цина [4], (3-екзотоксину спектрофотометричним методом [5]. Таблиця 1 Характеристика ентомопатогенного препарату Концентрат, виготовлений у заводсь- Препарат 25% концентраких умовах ції 45 5-10 8 8 2-5 2-5 113 93 682,14 490,30 Через 20 годин росту колонії матові, пласкі, круглі з нерівними краями, діаметром 4,0мм - 6,0мм. Забарвлення кремове, структура дрібнозерниста, консистенція м'яка. Найменування Титр спор у 1 г порошку, млрд. Вологість, % Розчинність, хв. Наявність d-ендотоксину, мг/г Наявність b-екзотоксину, мг/л Типовість колоній Присутність сторонньої мікрофлори, % не більше Основну увагу приділяли не стільки кількості спор у наважці, скільки перевірці ефективності на шкідливих організмах, тому що при висушуванні спори злипаються по 2-200 штук, їх важко розділити і колонії ростуть як із одиничних спор так і із групи спор. Приклад 2. Ефективність застосування бацилотурінгу-М (25% концентрації) вивчали за умов польового досліду [6] на посівах картоплі сорту Луговська проти личинок колорадського жука. Дослід проводили на дерново-середньопідзолистому ґрунті. Площа облікової ділянки 6м 2, повторність 0,1 досліду 4-разова. Норма витрат препарату становила 25-30г на 100м 2 посівів картоплі. Рослини картоплі обробляли шляхом обприскування водною суспензією препарату. Обробку проводили три рази за період вегетації. Результати порівнювали з обробкою рослин біологічним препаратом бітоксибациліном. Анти фідантну дію препарату (зменшення інтенсивності живлення) вивчали в польових умовах, визначаючи масу личинок (по 25 шт.) різного віку по різним варіантам (табл. 2). Таблиця 2 Анти фідантна дія препаратів на личинки колорадського жука (в середньому за 2001-2005pp.) Варіант досліду Без хімічних і мікробних препаратів (контроль) Обприскування рослин картоплі бітоксибациліном Обприскування рослин картоплі пропонованим препаратом Інтенсивність поКількість пошкоджених рослин, % шкодження, %, (бали) Маса личинок в Загибель личинок порівнянні з контчерез 6 діб, % ролем, % 65 57(4) 100 24 14(2) 87 85 17 14(2) 81 91 Таблиця 3 Динаміка розвитку личинок колорадського жука на посівах картоплі (літо 2005 року) Варіант досліду 1 Контроль Середнє До обробки 27.06.04. 2 192 22 2 54 Кількість шкідників по дням обліку Кількість 1 обробка 27.06.05. 2 обробка 04.07.05. 3 обробка 11.07.05 пошкодже30.06.05 03.07.05 07.07.05 10.07.05 14.07.05 17.07.05. них рос1-2в. 3-4 в. 1-2в. 3-4 в. 1-2в. 3-4 в. 1-2в. 3-4 в. 1-2в. 3-4 в. 1-2в. 3-4 в. лин, % 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 181 604 14 448 21 884 211 290 130 41 426 313 52 382 140 413 74 492 145 39 154 216 117 2 480 13 651 26 666 161 331 368 318 212 111 8 492 29 511 10 339 359 505 233 639 364 197 16 490 49 506 33 596 219 291 221 250 305 80 7 85074 8 Продовження таблиці 3 Варіант досліду 1 Обприскування бітоксибциліном Середнє Відроджені Обприскування пропонованим препаратом Середнє Відроджені До обробки 27.06.04. 2 79 4 75 6 41 124 52 71 62 Кількість шкідників по дням обліку Кількість 1 обробка 27.06.05. 2 обробка 04.07.05. 3 обробка 11.07.05 пошкодже30.06.05 03.07.05 07.07.05 10.07.05 14.07.05 17.07.05. них рос1-2в. 3-4 в. 1-2в. 3-4 в. 1-2в. 3-4 в. 1-2в. 3-4 в. 1-2в. 3-4 в. 1-2в. 3-4 в. лин, % 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 12 222 61 1 148 71 53 7 67 179 22 122 51 1 20 38 61 5 321 2 43 1 108 2 37 2 78 7 73 144 56 60 65 3 34 4 53 1,25 217 0,5 46 0,5 110 0,5 56 1,5 46 14 15 -39 -215 -110 -5 -6 67 2 331 15 139 4 181 23 94 28 57 21 103 2 886 11 287 2 467 33 157 59 30 37 126 4 700 1 562 5 771 2 336 85 157 37 45 3 83 78 454 33 284 35 124 16 85 3 500 7 267 3 468 23 218 52 92 28 20 -35 -370 -15 -292 -19 -7 Примітка: 1. Бітоксибацилін з титром спор - 300х106/мл 2. Новий препарат з титром спор - 50х106/мл Ентомопатогенну дію біопрепарату визначали за загибеллю личинок колорадського жука, динаміка розвитку (табл. 3) личинок колорадського жука свідчила, що при обробці пропонованим препаратом на 5 добу гине 91%. Біопрепарат мав захисну дію 6-7 діб, потім з'являлись нові відроджені личинки, проти яких потрібна повторна обробка. Препарат бацилотурінг-М на основі ентомопатогенних бактерій В. thuringiensis Л-4, що використовувся в польовому досліді, виявляючи високу ентомоцидність, різко обмежуючи чисельність личинок колорадського жука, забезпечив надійний захист картоплі, що сприяло значному приросту урожаю та поліпшенню якості бульб (табл. 4). За ефективністю новий біопрепарат бацилотурінг-М не поступався біопрепарату бітоксибациліну. Таблиця 4 Урожай картоплі сорту Луго вська на дерново-середньо-підзолистому ґрунті при застосуванні біопрепаратів на основі В.thuringiensis (в середньому за 2001-2005pp.) Приріст урожаю ц/га % 4 5 Варіант досліду Урожай, ц/га Товарність, % 1 Без хімічних і мікробних препаратів /контроль/ Обприскування рослин картоплі бітоксибациліном Обприскування рослин картоплі пропонованим препаратом 2 3 84 55,7 156 79,8 72 85,7 167 81,6 83 98,8 Таким чином, запропонований спосіб виготовлення нового біопрепарату бацилотурінгу-М на основі Bacillus thuringiensis var. thuringiensis Л-4 дозволяє підвищити вихід спор ентомопатогенних бактерій в порівнянні зі способом прототипу, використовуючи збалансоване поживне середовище. В результаті препарат являє собою високоефективний і екологічно безпечний засіб захисту картоплі та інших сільськогосподарських культур від листогризучих шкідників. Література: 1. А.С.1833523 A3 СССР A 01N 63/00, С 12 N 1/20.3аявка 4755532/13 от 27.07.89. Способ культивирования энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis. (Н.И.Шашкина, Н.Б. Мурзинцева, Р.П.Комарских, В.В.Шевцов, А.И.Тур и др.) 2. А.С. 1399916 Al A 01 N 63/00. Заявка 3958349/28-13 от 25.09.85. Способ культивирования энтомопатогенных бактерий. (Л.Ю.Замыцкий, К.Б. Алибеков, В.А. Румянцев и В. И. Коровкин). 3. Патент України №56033 А 7 С12Р1/04, С 12N1/20, C12N3/00. Заявка 2002097414 від 12.09.2002. Спосіб виготовлення пастоподібного ентомоцидного біопрепарату на основі бактерій Bacillus thuringiensis. (Патика В.П. Мельничук Т.М., Кузнецова Л.М., Шерстобоєва О.В., Татарін Л.М., Патика T.I.). 9 85074 4. Рекомендации к практикуму по бактериозам насекомых. - Саранск, 1985.-118 с. 5. Данилова Э.Б., Барбашова Н.М. Спектрофотометрическое определение р-экзотоксина в культуральной жидкости Bacillus thuringiensis // Труды ВНИИСХМ. - Л., 1985. - 55.- C.115-117. Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 10 6. Доспехов Б.А. Ме тодика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - 5-е изд., доп. и перераб. - М.: Агропромиздат, 1985.-351 с. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601