Застосування гідрофобіну як емульгатора в буровому розчині та буровий розчин

1. Застосування гідрофобіну, що є поліпептидом загальної структурної формули (І): Хn-С 1-Х1-50-С2-Х0-5-С3-X1-100-С4-X1- 100-С 5-Х1-50-С6-Х0-5C7-Х1-50-C8-Xm , (І) де залишки X, які можуть бути різними або однаковими, означають будь-яку із 20 природних амінокислот: Phe, Leu, Ser, Туr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly, індекси n та m, що стоять при X, означають кількість амінокислот, залишки С1-С8 означають цистеїн, аланін, серин, гліцин, метіонін або треонін, причому щонайменше 4 з названих залишків С 1-С8 означають цистеїн, а індекси n та m незалежно один від одного означають натуральне число між 0 та 500, як емульгатора в буровому розчині. 2. Застосування за п.1, яке відрізняється тим, що гідрофобіном є злитий гідрофобін. 3. Застосування за пп.1 або 2, яке відрізняється тим, що гідрофобіном є злитий гідрофобін, вибраний з групи: yaad-Xa-dewA-his - SEQ ID NO: 20, yaad-Xa-rodA-his - SEQ ID NO: 22 або yaad-Xabasf1-his - SEQ ID NO: 24, причому yaad може бути також і скорочений партнер злиття yaad’, що містить від 20 до 293 амінокислот. C2 2 (19) 1 3 85012 Загалом, функцією бурового розчину є полегшення процесу буріння при відкритті нових покладів корисних копалин, наприклад нафти або природного газу. Часто це виявляється складним. При бурінні необхідно чинити підтримку, не тільки самому процесу буріння, а і транспортуванню осколків каміння, що утворюються під час буріння. Різець для розсвердлювання та бурові штанги необхідно змащувати та о холоджувати. Надалі, необхідно також компенсувати гідростатичний тиск родовища корисної копалини, завдяки чому часто буріння проводять з використанням підвищеної специфічної ваги. Також, стінки бурової свердловини мають бути укріплені обсадними трубами. Важливими властивостями комерційно доступних бурових рідин є, серед інших, придатна в'язкість та течкість, густина, термічна стійкість, емульгуюча та діспергуюча здатності, рН регуляція; не останню роль має також і безпечність по відношенню до навколишнього середовища. Оскільки пошук нової сировини ведуть у багатьох різномних місцях на землі, при цьому часто у далеко віддалених місцях, наприклад на морському узбережжі або у середині лісів, завжди існує необхідність у створені глибоких свердловин, та виникає попит на нові допоміжні засоби для буріння, особливо на допоміжні засоби для бурового розчину. Останній має відповідати високим технічним вимогам, повинен мати економне виробництво, яке може бути впроваджено безпосередньо перед місцем забою. Звідси слідує, що буровий розчин мусить бути стабільним при зберіганні та на протязі довгого часу залишатись придатним до використання. Надалі, особливо важливим є те, щоб буровий розчин при потраплянні до навколишнього середовища не призводив до довготривалої шкоди по відношенню до тварин та рослин. Гідрофобіни являють собою малі протеїни, що складаються з 100-150 амінокислот, та можуть бути одержані з волокнистих грибів, наприклад Schizophyllum commune. Вони, як правило, містять 8 цистеїнових одиниць на молекулу. Гідрофобіни мають виражену спорідненість до поверхні розділу фаз, і тому підходять для покриття поверхонь, наприклад, з метою зміни властивостей межі розділу фаз за рахунок утворення амфіфільних мембран. Так, наприклад, при отриманні гідрофільної поверхні, штучна речовина тефлон може бути вкрита за допомогою гідрофобінів. Гідрофобіни можуть бути виділені з природних джерел. Крім того, відомі синтетичні способи виробництва гідрофобінів та їх похідних. Наприклад, [німецька патентна заявка DE 10 2005 007 480.4] описує спосіб одержання гідрофобіну та його похідних. Застосування гідрофобіну для різноманітних використань вже було запропоновано як метод. Так, у [EP-A 05 016 962], описано застосування протеїнів для покращання розділення фаз, наприклад сумішей типу масло/вода або нафта/водна суміш. Спеціалістам відомо, що певна амфіфільна молекула, в залежності від використаної концентрації та навколишнього середовища, на межі роз 4 ділу фаз може мати як стабілізуючу, так як і дестабілізуючу дію. [WO 96/41882] запропоновував використання гідрофобінів у якості емульгаторів, згущувачів, поверхнево-активних речовин, для гідрофілізації гідрофобних поверхонь, для покращання вологостійкості гідрофільних субстратів, для одержання емульсій типу вода-у-маслі та масло-у-воді. Подалі, були запропоновані фармацевтичні застосування, такі як виробництво мазей чи кремів, а також косметичні застосування, такі як засоби для захисту шкіри або виготовлення шампунів для волосся, або засобів для ополіскування волосся. На додаток до цього, [WO 96/41882] описує склад засобів із вмістом гідрофобну дляфармацевтичних використань. [EP-A 1 252 516] описує покриття вікон, контактних лінз, біосенсорів, медичних пристроїв, посуду для досліджень або зберігань, корпусів кораблів, твердих частей, або рамки або корпусу легкових автомобілів розчином, що містить гідрофобін, при температурі від 30 до 80°C. [WO 03/53383] описує використання гідрофобіну для обробки кератинових матеріалів у косметичних цілях. [WO 03/10331] описує, що гідрофобін виявляє поверхнево-активні властивості. Так, описаний сенсор, вкритий гідрофобіном, наприклад для застосування у якості електроду вимірювання, до поверхні якого у подальшому були нековалентно прищеплені інші речовини, наприклад, електроактивні речовини, антитіла, чи ензими. [WO 2004/000880] представляє покриття поверхонь гідрофобіном або подібними речовинами. Крім того описано, що емульсії типу масло-у-воді або вода-у-маслі також можуть бути стабілізовані за рахунок додавання гідрофобіну. [WO 1/74864], що стосується протеїнів, подібних до гідрофобіну, також описує, що вони можуть бути використані для стабілізації дисперсій та емульсій. Принципово відомо також і використання протеїнів для розділу фаз. Так [GB 195,876] описує спосіб розбиття емульсій типу вода-у-маслі із використанням колоїдів. У якості колоїдів називають, як приклади, протеїни, такі як, желатина, казеїн, альбумін; або полісахариди, такі як каучук типу Gummi Arabicum або Gummi Tragacanth. [JP-A 11-169177] описує застосування протеїнів з ліпазною активністю для розбиття емульсій. [WO 01/60916] описує використання сумішей, що не містять тенсидів, і що складаються з, щонайменше, одного водорозчинного полісахариду, та, щонайменше, з одного водорозчинного полімеру, такого як поліетиленоксид, для різноманітних застосувань, серед яких описано також деемульгування сирої нафти. Жоден з цитованих документів не описує застосування гідрофобінів у якості допоміжного засобу для бурових розчинів. Предметом представленого винаходу є використання гідрофобінів у якості допоміжного засобу для бурових розчинів, при чому гідрофобін додають до бурового розчину, поперед іншим, саме у якості емульгатора. 5 85012 Переважно, при цьому використовують гідрофобін типу злитий гідрофобін, особливо злитий гідрофобін, вибраний із пізніше описаної групи yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodAhis (SEQ ID NO: 22) або yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24), при чому yaad означає скрочений патрнер злиття yaad' з від 20 до 293 амінокислот. Бурові розчини, як правило, складаються з однієї або декількох рідин, таких як, наприклад, вода, сира нафта та додатків органічної природи, відповідно розчинюючих засобів, а також суспендованих, або розчинних твердих речовин. Відповідно до головного компоненту розчину, розрізняють водні бурові розчини, бурові розчини на основі нафти та синтетичні бурові розчини. Згідно з винаходом, перевагу віддають використанню бурового розчину на основі нафти (наприклад, дизелю, мінеральних масел). Також перевагу віддають застосуванню гідрофобіну (можна використовува ти одночасно декілька гідрофобінів) у кількості від 0,1 до 10.000м.ч., переважно від 1 до 1000м.ч., особливо від 1 до 600м.ч., кожен раз цифри віднесені до загального складу розчину). Це є однією з переваг використання гідрофобіну, оскільки кількість гідрофобну, що додається, значно менша, у порівнянні із звичайними емульгаторами, які додають у кількості від 2 до 10ваг.-%. Переважно, мова йде про буровий розчин на основі нафти, який містить, щонайменше, від 40 до 95ваг.-%, переважно, від 70 до 95ваг.-% одного компоненту типу масла (нафти), та від 2 до 80ваг.%, переважно, від 2 до 30ваг.-% води, а також, додаткові компоненти, якщо вони присутні. У якості додаткових компонентів виступають, наприклад, наступні речовини: a) Солі (такі як, наприклад, хлориди, броміди, карбонати лужних- та лужноземельних металів; такі солі часто служать також і для рН контролю), b) Добавки для збалансування втрат рідини (наприклад бентоніт, крохмаль, целюлоза, або їх похідні), c) Змочувальні агенти [для надання вищеназваним добавкам (наприклад бентоніту) змочуваності нафтою], d) Агенти для покращання текучості (які знижують гідравлічний опір, наприклад, акрилова смола, полісилоксани, поліуретани), е) Добавки для підвищення специфічної ваги бурової рідини (наприклад, барит, гематит, магнетит, ільменіт, сидерит, доломіт, кальцит, кам'яна сіль), f) Емульгатори (наприклад, солі жирних кислот, поліаміди), g) Інші добавки, такі як, наприклад, диспергатори, добавки для компенсації втрати рідини, такі як полімери, чи сополімери, аміни (наприклад поліакриламід), h) Добавки для збільшення в'язкості (наприклад бентоніт, палигорськіт). У переважному способі виконання винаходу, до складу розчину, окрім гідрофобіну, входить, щонайменше, одна речовина, що покращує утворення емульсій. Винахід стосується також способу буріння свердловин, особливо для знаходження та від 6 криття підземних копалин, особливо нафти та газу, при якому використовують буровий розчин, що містить, щонайменше, один гідрофобін, або його дериват. При цьому переважно застосовують вищеназвані злиті гідрофобіни. При бурінні найчастіше використовують буровий розчин на основі нафти, який містить від 40 до 95ваг.-%, щонайменше, одного нафтового компоненту (такого, як біодизель), від 2 до 60ваг.-% води (наприклад, прісної чи морської), а також, при необхідності, і інші компоненти. Надалі, предметом даного винаходу є буровий розчин, що містить хоча б один гідрофобін. В окремому випадку способу виконання винаходу, буровий розчин містить від 70 до 95ваг.-% хоча б одного компоненту типу нафта (наприклад, біодизелю), від 2 до 30ваг.-% води, та, при необхідності, до 13ваг.-% інших компонентів (наприклад, бентоніту та хлориду кальцію). Винахід також стосується і способу приготування бурового розчину, при якому компоненти гідрофобінів та інші компоненти бурового розчину щільно перемішують. Цей процес можна проводити на місці промислового виробництва продукту, а також перед самим місцем забою, наприклад, на буровій платформі. Використання протеїнів, таких як гідрофобін, у якості допоміжного засобу при бурінні, має, як перевагу, використання природних речовин або аналогів природних речовин, які підпадають під біологічну деградацію, і тому не призводять до довготривалого навантаження навколишнього середовища. При багатьох застосуваннях, які проводяться у великому масштабі, наприклад при бурінні нафтових родовищ, дуже бажаною є можливість довготривалої придатності допоміжного засобу. Задачею винаходу була розробка поліпшеного способу проведення буріння землі, із застосуванням спеціальних протеїнів. Під гідрофобіном, у рамках приведеного винаходу, розуміють також його похідні, відповідно, модифіковані гідрофобіни. Коли мова йде про модифіковані, відповідно, дериватизовані гідрофобіни, мають на увазі, наприклад, гідрфобін-злиті протеїни або такі протеїни, які містять таку послідовність амінокислот, що має, щонайменше, 60%, наприклад, щонайменше 70%, особливо, щонайменше, 80%, а особливо переважно, щонайменше, 90%, і дуже особливо переважно, щонайменше, 95% ідентичності з послідовністю гідрофобіну; а також такі, які до 50%, або, наприклад, до 60%, та, особливо, до 70%, а, особливо переважно, до 80%, володіють біологічними властивостями гідрофобіну; а, особливо, саме властивістю змінювати властивості поверхонь за рахунок їх покриття таким чином, що для скляної поверхні, обробленої таким протеїном, контактний кут водної краплини на цій поверхні зростає на, щонайменше, 20°, або переважно, на, щонайменше, 25°, а, особливо переважно, на, щонайменше, 30°, у порівнянні із скляною поверхнею до такої обробки. Несподівано було знайдено, що гідрофобін, або його деривати, покращають швидкість буріння при розвідці або відкритті покладів корисних копа 7 85012 лин. Така дія заснована на тому, що при цьому попереджується швидкий розділ фаз бурового розчину та матеріалу, який піднімають нагору. При цьому навіть невеликі кількості гідрофобіну надзвичайно ефективні. Для дефініції гідрофобінів вирішальне значення має структура, а не специфіка послідовності гідрофобіну. Послідовність амінокислот природного гідрофобіну дуже різноманітна, однак всі вони мають високохарактеристичний узор, що складається із 8 збережених залишків цистеїну. Ці залишки утворюють 4 вн утрішньо-молекулярних дисульфідних містка. N- та С-термінальні залишки варіюються у широкому діапазоні. Тут можуть бути, згідно технік молекулярної біології, відомим спеціалістам, приєднані партнери злиття - протеїни довжиною від 10 до 500 амінокислот. На додаток до цього, у сенсі даного винаходу під гідрофобінами та їх дериватами розуміють протеїни із схожою структурою та функціональною еквівалентністю. Під терміном "гідрофобін" у сенсі представленого винаходу треба розуміти наступні поліпептиди із загальною структурною формулою (І), Xn-C 1-Х1-50-С2–Х0-5-С3-Х1-100-С4-Х1-100-С5-Х1-50(І) С6-Х0-5-C7-Х1-50-С8-Хm причому X може відповідати будь-якій із 20 природних амінокислот (Phe, Leu, Ser, Туг, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, lle Met, Thr, Asn, Lys, VaI, Ala, Asp, GIu, GIy). При цьому Х може бути різним або однаковим. При цьому індекси, що стоять при X, означають кількість амінокислот, залишки C означають цистеїн, аланін, серін, гліцин, метіонін або треонін, причому щонайменше 4 з названих залишків типу C означають цистеїн; а індекси n та m, незалежно один від одного, відповідають натуральним числам між 0 та 500, переважно між 15 та 300. Полі пептиди, що відповідають формулі (І), надалі характеризуються такою властивістю. Після вкриття ними скляної поверхні при кімнатній температурі, спостерігається збільшення контактного куту водної краплини на, щонайменше 20°, а переважно, на, щонайменше 25°, та, особливо переважно, на 30°, відповідно кожен вимір у порівнянні із контактним кутом водної каплі такого ж розміру на чистій непокритій скляній поверхні. Амінокислоти, названі від C1 до C8 - це переважно цистеїн; також вони можуть бути заміщені на інші амінокислоти, що мають схоже об'ємне заповнення: аланін, серін, треонін, метіонін чи гліцин. Звичайно, мають бути хоча б чотири, а переважно, хоча б п'ять, та особливо переважно, хоча б 6, та, най особливо переважно, хоча б 7 положень від C1 до C8, що складаються з цистеїну. Згідно винаходу, фрагменти цистеїну у протеїнах можуть знаходитись або у відновленій формі, або у формі дисульфідних містків, утворених один з другим. Особливу перевагу має формування внутрішньо-молекулярних містків C-C, а особливо таким чином, що утворюється щонайменше один, переважно, 2 та, особливо переважно, 3, та дуже переважно, 4 внутрішньо-молекулярних дисульфідних містків. При вищеописаному обміну цистеїну на амінокислоти із подібним просторовим запов 8 ненням, заміщують попарно переважно такі Спозиції, які можуть утворювати вн утрішньо молекулярні дисульфідні містки одна із одною. Якщо у положенні, позначеному X, використовують Цистеїн, Серін, Аланін, Гліцин, Метіонін або Треонін, нумерація окремої С-позиції у загальній формулі може бути змінена відповідно. Для реалізації представленого винаходу, використовують переважно гідрофобіни із загальною формулою (II), Xn-C 1-Х3-25-С2-Х0-2-С3-Х5-50-С 4-Х2-35-С5-Х2-15-С6(IІ) X0- 2-C7-Х3-35-С8-Хm причому X, C та індекси, що знаходяться при них, мають вищеназвані значення; індекси n та m відповідають числам між 0 та 300; та протеїни відрізняються вищеописаною зміною контактного куту; та йдеться про, щонайменше, 6 залишків цистеїну, позначених як C. Особливу перевагу віддають саме такому випадку, коли всі залишки типу C відповідають цистеїну. Особливо переважним є використання гідрофобінів із загальною формулою (III), Xn-C 1-Х5-9-С2-C3-Х11-39-С4-Х2- 23-С5-Х5-9-С6-C7-Х6(IIІ) 8 18-С -Xm причому X, C та індекси, що знаходяться при X, мають вищеназвані значення, індекси n та m відповідають числам між 0 та 200; та протеїни відрізняються вищеописаною зміною контактного куту; та йдеться про, щонайменше, 6 залишків цистеїну, позначених як C. Особливу превагу віддають випадку, коли всі залишки C - це цистеїн. Щодо залишків Xn та Хm, мова може йти про такі послідовність пептидів, що природно також пов'язані із гідрофобіном. Але окрім цього, стосовного одного або обох залишків, мова може йти також про таку пептидну послідовність, яка природно не пов'язана із гідрофобіном. Під нею розуміють також такі залишки Xn та/або Хm, в яких пептидна послідовність, що природно зустрічається в гідрофобіні, продовжена за рахунок пептидної послідовності, що природно не зустрічається в гідрофобіні. Якщо під Xn та/або Xm, йдеться про пептидні послідовності, що природно не пов'язана із гідрофобіном, такі послідовності, як правило, мають щонайменше, 20, переважно, щонайменше, 35, та особливо переважно, щонайменше, 50 та зовсім особливо переважно, щонайменше, 100 амінокислот у довжину. Такий, природно не пов'язаний із гідрофобіном залишок, у наступному тексті має бути також позначений як злитий партнер. Цим має бути виражено те, що гідрофобіни можуть складатися з, щонайменше однієї частини гідрофобну, та однієї частини злитого партнеру, що разом в такій формі не зустрічаються в природі. Частина злитого партнеру може бути вибрана із великого числа протеїнів. Також із однієї частиною гідрофобіну можуть бути зв'язані декілька партнерів злиття, наприклад на термінальній аміногрупі (Xn), та на термінальній карбоксильній групі (Хm) частини гідрофобіну. Також, наприклад, два партнери злиття можуть бути прищеплені до однієї позиції (Xn або Хm) протеїну у відповідності із винаходом. 9 85012 Особливо придатними партнерами злиття виступають такі протеїни, що природно зустрічаються у мікроорганізмах, особливо у E. соlі або Bacillus subtilis. Прикладами таких партнерів злиття є послідовності yaad (SEQ ID NO: 15 та 16), уаае (SEQ ID NO: 17 та 18), та тіоредоксин. Добре придатними є також фрагменти або деривати таких названих послідовностей, які охоплюють лише одну частину, наприкладвід 70 до 99%, переважно від 5 до 50%, та особливо переважно, від 10 до 40% названих послідовностей; або в яких одиничні амінокислоти, відповідно, нуклеотиди, заміщено на названу послідовність, при чому процентні дані відносяться до числа амінокислот. Надалі, у переважному способі виконання, злитий гідрофобін біля партнеру злиття - групи Xn або Хm, має також так-названу область спорідненості (мітка спорідненості / хвіст спорідненості). Тут йдеться про принципово відомі види та способи утворення якірних угр упувань, які можуть вступати до обмінних взаємодій з певними комплементарними групами, та можуть служити для полегшеної обробки та очищенню протеїнів. Приклади таких доменів спорідненості включають у себе (His)k-, (Arg)k-, (Asp)k-, (Phe) k- чи (C ys)k-гр упи, причому k, в загальному випадку, відповідає натуральному числу від 1 до 10. Переважно, мова йде про (His)k-групy, причому k дорівнює від 4 до 6. Згідно винаходу, використані у якості гідрофобіну або його похідних протеїни можуть також бути модифіковані у поліпептидній послідовності, наприклад, шляхом глікозилювання, ацетилювання або також шляхом поперечної зшивки наприклад, із глютаровим альдегідом. Однією властивістю гідрофобінів, що використовують згідно винаходу, та, відповідно, їхніх дериватів, є зміна поверхневих властивостей поверхонь, якщо вони були вкриті цими протеїнами. Зміна поверхневих властивостей експериментально визначається шляхом вимірювання контактного куту водної краплини до і після вкриття поверхні протеїном, та обчисленням величини - різниці обох вимірів. Виконання вимірювання контактного куту принципово відомо спеціалістам. Виміри проводять при кімнатній температурі, із використанням водних крапель об'ємом 5мкл та із використанням, у якості субстратів, скляних пластин. Як приклад, точні експериментальні умови методу, придатного для вимірювання контактного куту, представлені у експериментальній частині. За умов, там описаних, злиті протеїни, що застосовані згідно із винаходом, володіють властивістю збільшувати контактний кут на, щонайменше, 20°, а переважно, щонайменше, на 25°, а, особливо переважно, на щонайменше 30°, кожен раз у порівнянні із контактним кутом водної краплини такого ж розміру на невкритій поверхні скла. Особливу перевагу при виконанні даного винаходу віддають гідрофобінам типу dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfi, basf2, які структурно охарактеризовані у наступному протоколі послідовностей. Також мова може йти лише про частину або дериват такого гідрофобіну. Крім того, декілька 10 частин гідрофобіну, переважно 2 або 3, однакової або різної структури, можуть бути з'єднані між собою, та, відповідно, скріплені у придатній поліпептидній послідовності, що природно не поєднана із гідрофобіном. Згідно із винаходом, особливо придатними є злиті протеїни yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) або yaad-Xabasf1-his (SEQ ID NO: 24) із поліпептидною послідовністю, представленою у скобках, а також що закодовані послідовностями нуклеїнових кислот, особливо послідовностями, згідно SEQ ID NO: 19, 21, 23. Також, особливу перевагу віддають протеїнам, що, ви ходячи із представлених поліпептидних послідовностей SEQ ID NO. 20, 22 або 24 шляхом обміну, включення або видалення, виявляють щонайменше одну, до 10, переважно 5, особливо переважно 5% всіх амінокислот, та ще володіють біологічними властивостями вихідних протеїнів, щонайменше, на 50%. Під біологічною активністю протеїнів розуміють вже описану зміну контактного куту, на, щонайменше, 20°. Для виконання винаходу особливо підходять деривати yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaadXa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) або yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24), одержані через скорочення залишку похідного від злитого партнеру yaad. Замість повноцінного yaad-партнеру злиття (SEQ ID NO: 16) який складається з 294 амінокислот, може бути вигідним введення скороченого залишку yaad. Скороченй залишок має містити хоча б 20, переважно, хоча б 35 амінокислот. Наприклад, може бути введений скорочений залишок, що складається з від 20 до 293, переважно з від 25 до 250, особливо переважно, з від 35 до 150, та, як приклад, з від 35 до 100, амінокислот. Щілина - місце розщеплення, - між гідрофобіном та партнером, або, відповідно, партнерами злиття, може бути використана для того, щоб виділяти чистий гідрофобін у недериватизованій формі (наприклад, шляхом розщеплення метіоніну дією BrCN, дією фактору Xa-, ентерокінази, тромбіну, TEV (протеази вірусу Tobacca etch), і так далі). Подалі, злитий протеїн можне бути генерований з партнеру злиття, наприклад yaad або уаае, та інших гідрофобінів різноманітних послідовностей, наприклад, DewA-RodA або Sc3-DewA, Sc3RodA, послідовно, тобто один за одним. Також, можуть бути введені і фрагменти гідрофобіну (наприклад, N- або С-кінцеві скорочення) або мутеїну, що мають до 70% гомології. Вибір оптимальної конструкції кожен раз проводиться відносно відповідного використання, а саме використання для розділення рідких фаз. Використані згідно винаходу гідрофобіни, і відповідно, Гідрофобіни, що містяться у формулюваннях згідно із винаходом, можуть бути одержані хімічним шляхом за відомими способами пептидного синтезу, наприклад, шляхом твердофазного синтез Меррифілда. Гідрофобіни, що зустрічаються у природі, можуть бути, при використанні придатних методів, виділені з природних джерел. Наприклад, так, як у 11 85012 посиланні [Wosten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122129 (1994) або WO 96/41882]. Одержання злитих ротеїнів може бути проведено переважним чином за способом генної інженерії, при якому один з партнерів злиття та одну з послідовностей нуклеїнових кислот, що кодує частину гідрофобіну, особливо послідовність ДНК, комбінують таким чином, що в одному з організміхазяіні утворюється бажаний протеїн за рахунок генної експресії комбінованої послідовності нуклеїнових кислот. Подібний спосіб виробництва описаний наприклад, у [DE 10 2005 007 480]. Підходящі організми-хазяїни (організми - продуктанти) для названого способу виробництва при цьому можуть бути прокаріотами (включаючи Archaea) або еукаріотами, особливо бактеріями, включаючи галобактерії та Metanococceen, гриби, клітини комах, клітини рослин та ссавців, при цьому особливу перевагу віддають Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (наприклад, споріднені клітини), та ін. Основою винаходу є також використання конструктів-експресій, що містять регуляторну під генетичним контролем послідовність амінокислот, та одну послідовність амінокислот, що кодує поліпептид згідно із винаходом, а також вектори, включаючи, щонайменше, один з цих експресійконструктів. Переважним чином, вставлені конструкти о хоплюють промотор у напрямку 5'- проти течі від кожної кодуючої послідовності, та термінаторну послідовність у напрямку 3'- по течії, а також, при необхідності, інші звичайні регулятивні елементи, причому в кожному випадку вони оперативно зв'язані з послідовністю, що кодує. Під терміном «оперативно зв'язані» в рамках даного винаходу розуміють послідовну організацію промотору, кодувалаьної послідовностіта, при необхідності, подальших регулятивних елементів таким чином, що кожен з регулятивних елементів може виконувати свою функцію згідно установці при експресії послідовності, що кодує. Прикладами оперативно-з'єднуваних послідовностей є таргетні (цільові) послідовності такі як Enhancer (підсилювач), сигнал полуаденілювання, та інші їм подібні. Інші регулятивні елементи охоплюють такі, що можна вибирати, маркери, сигнали ампліфікації (підсилення), джерела реплікації, та їм подібні. Придатні регуляторні послідовності це такі, що описані, наприклад, у [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]. На додаток до цих регуляторних послідовностей, також може існувати природна регуляція цих послідовностей власними генними структурами, що може бути відповідно, генетично змінена таким чином, що природна регуляція виключається, а генна експресія підвищується. Переважний конструкт нуклеїнових кислот містить, для корисності, також одну або більше такназваних, послідовностей-підсилювачів, функціонально пов'язаних із промотором, які уможливлю 12 ють підвищення експресії послідовності нуклеїнових кислот. Також на 3'- кінці послідовності ДНК можуть бути вставлені додаткові корисні послідовності, такі як додаткові регуляторні елементи або термінатори. Нуклеїнові кислоти можуть міститися у конструкті як одна або декілька копій. В конструкті можуть бути присутні також інші маркери, такі як антибіотико-резистентність або ауксотропін комплементарні гени, що при необхідності селекціонують для конструкту. Корисні для виробництва регуляторні послідовності містяться, наприклад, у промотрах, таких як cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, Ipp-lac-, IaclqT7-, Т5-, Т3-, gal-, trc-, ага-, rhaP (rhaPBAD) SP6-, lambda-PR- чи imlambda-P-промотор, які знаходять корисне використання у грам-негативних бактеріях. Наступні корисні регуляторні послідовності наявні, наприклад, у грам-позитивних промоторах ату та SP02, в дріжджових або грибкових промоторах ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH1 TEF, rp28, ADH. Також для регуляції можуть бути використані штучні промотори. Конструкт нуклеїнових кислот вставляють для експресії у організм-хазяїн, вигідним чином, у вектор (носій), який вставляють у плазмід або фаг, який надає можливості оптимальній генній експресії у хазяїні. Під вектором-носієм, окрім плазмідів та фагів, розуміють також всі інші відомі спеціалістам вектори, також, наприклад, віруси, такі як SV40, C MV, Baculovirus та Adenovirus, транспосони, IS-елементи, фазміди, косміди та лінійні або циркулярні ДНК, такі як олстема-Agrobacterium. Ці вектори можуть бути автономно репліковані в організмі хазяїна або хромосомально репліковані. Придатними плазмідами, є, наприклад, в E. coli - pLG338, pACYC184, PBR322, pUC18, pUC19, Рkс30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-lll"3-B1, tgt11 або pBdCI, у Streptomyces -plJ101, plJ364, plJ702 або plJ361, у бактерій - pUB110, pC194 або pBD214, у Corynebacterium pSA77 або pAJ667, у грибах - pALS1, plL2 або рВВ116, у дріжджах 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 або pEMBL Ye23, або у рослин - pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 або pDH51. Названі плазміди представляють малий вибір можливих плазмідів. Спеціалістам відомі і інші плазміди, які можуть бути взяті, наприклад, з книжки [«Cloning Vectors» (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)]. Корисно, якщо конструкт нуклеїнових кислот для експресії генів, надалі містить також додатково 3'-та/або 5'-термінальні регуляторні послідовності для прискорення експресії, які вибирають для оптимальної експресії згідно із вибраним організмом - хазяїном, та геном або генами. Ці регуляторні послідовності мають уможливити цільову експресію генів та протеїнів. Це, як приклад, може означати, в залежності від організмухазяїну, що ген експримується або надекспримується вже після індукції, або що він експримується або над-експримується відразу. 13 85012 Регуляторні послідовності, відповідно, фактори, при цьому можуть впливати на генну експресію вставлених генів, переважним чином, позитивно та, за рахунок цього, її підвищувати. Таким чином, може відбуватися підсилення регуляторних елементів, переважно, на транскрипційну площину, при цьому використовують сильні транскрипційні сигнали, такі як промотори та/або підсилювачі "Enhancer". Наряду з цим також можливе і підсилення трансляції, під час чого, наприклад, покращується стабільність m-РНК. У іншому способі оформлення вектору, конструкт н уклеїнових кислот або вектор, що містить нуклеїнові кислоти, переважно у формі лінійної ДНК, також може бути введений у мікроорганізм та бути інтегрований в геном організму-хазяїну шляхом гомологічних або гетерологічних рекомбінацій. Ця лінійна ДНК може складатися із лінеарізованого вектору, такого як плазмід, або конструкту нуклеїнових кислот, або з нуклеїнових кислот. Для оптимальної експресії гетерологічного гену в організмі корисною є зміна послідовності нуклеїнових кислот, що відповідає специфічному використаному в даному організмі використанню кодонів "codon usage". Використання кодонів може бути легко визначено шляхом компьютерного моделювання для інших, відомих генів даних організмів. Отримання касети експресії проводиться шляхом злиття придатного промотору з придатною послідовністю нуклеїнових кислот, що кодує, а також із термінатором або сигналом поліаденілювання. Для цього використовують швидкі рекомбінаторні технології та технології клонування, наприклад такі, що описані у [T. Maniatis, E. F.Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); а також у T. J. Silhavy, M. L. Berman, L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) та у Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley lnterscience (1987)]. Рекомбінантний конструкт нуклеїнових кислот, відповідно, генний конструкт, для експресії вставляють у придатний організм-хазяїн, а найкорисніше у специфічний для хазяїна вектор, який обумовлює оптимальну експресію гену у хазяїні. Такі вектори відомі спеціалістам, та можуть бути, наприклад, взяті з ["Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]. За допомогою векторів можуть бути одержані рекомбінантні мікроорганізми, які наприклад трансформуються, щонайменше, одним вектором та можуть бути використані для продукції гідрофобінів або їх дериватів згідно із винаходом. Вигідним чином вищеописані рекомбінантні конструкти вводять та експримують у придатній системіхазяїні. При цьому вигідним є використання відомих спеціалістам швидких методів клонування та трансфекції, таких як наприклад, співосадження, злиття протопластів, електропорація, ретровірусна трансфекція, з метою введення названих нуклеїнових кислот у відповідні системи експресії для 14 експресії. Придатні системи описані у [Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley lnterscience, New York 1997, або Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. Також можуть бути синтезовані гомологічно рекомбіновані мікроорганізми. Для цього виробляють вектор, який містить, щонайменше, один відрізок одного використаного гену, або одну послідовність, що кодує, в якій, відповідно, щонайменше, одну амінокислоту було видалено/вставлено/заміщено, щоб змінити послідовність, наприклад, функціонально перервати ("Knосkоut'-вектор). Введена послідовність може бути, наприклад, гомологом із використаного мікроорганізму, або похідною від джерела - ссавців, дріжджів, або комах Вектор, використаній у гомологічній рекомбінації, альтернативно може бути побудований таким чином що ендогенний ген при гомологічній рекомбінації піддається мутації, або змінюється якось інакше, але при цьому все ще кодує функціональний протеїн (наприклад, регуляторна зона, вставлена проти течії, може бути змінена таким чином, що при цьому змінюється експресія ендогенного протеїну). Змінений відрізок використаного, згідно з винаходом, гену, знаходиться у гомологічному рекомбінаторному векторі. Конструкція векторів, що придатні для гомологічної рекомбінації, описана, наприклад, у [Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503]. У якості рекомбінантних організмів - хазяїнів для таких нуклеїнових кислот або таких конструктів нуклеїнових кислот можуть бути використані у принципі будь-які прокаріоти або еукаріоти. Вигідним є використання як організмів - хазяїнів мікроорганізмів, таких як бактерій, грибів, або дріжджів. Вигідним є використання грам-позитивних або грам-негативних бактерій, переважно бактерій із родини Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae або Nocardiaceae, особливо переважно, бактерій типу Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium або Rhodococcus. Організми, використані у вищеописаному протоколі для отримання злитих протеїнів, вирощують, або відповідно, культивують способом, відомим спеціалістам, у відповідності до організму. Мікроорганізми, як правило, вирощують у рідкому середовищі що містить джерело вуглецю, як правило у формі Сахару; джерело нітрогену, загалом у формі органічних джерел, таких як дріжджевий екстракт, або солей, таких як сульфат амонію; слідові елементи, такі як солі заліза, мангану, та магнію; а також вітаміни; при температурі між 0 та 100°C, переважно між 10 та 60°C, під атмосферою кисню. При цьому рН харчового середовища під час вирощування можна тримати сталим, що означає що рН може бути регульованим або ні. Вирощування можна проводити порційним "batch" способом, напівпорційним "semi-batch" способом або неперервним способом. Харчові речовини 15 85012 можуть бути введені до початку ферментації, або бути добавлені вже у процесі напівнеперервним або неперервним способом. Ензими можуть бути виділені з організмів або використані для реакції у вигляді сирого екстракту, згідно із способами, описаними у прикладах. Використані згідно із винаходом гідрофобіни, або їх функціональні біологічно активні фрагменти, можуть бути виго товлені способом рекомбініатного виробництва, за яким культивують мікроорганізм, що продукує поліпептид, та, відповідно, індукують експресію протеїну, після чого виділяють останній з культури. Таким чином, за бажанням, протеїни можуть бути вироблені у виробничих масштабах. Рекомбініантний мікроорганізм може бути культивований та ферментований відомими способами. Бактерії можуть розмножуватися, наприклад, у TB- або LB-середовищі при температурі від 20 до 40°C та рН від 6 до 9. Зокрема, придатні умови культивації описані, наприклад, у [T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Якщо протеїни не виділяються у к ультиваційне середовище, надалі клітини розкривають та отримують продукт згідно відомих способів ізолювання протеїнів із лізату. Клітини можуть бути розкриті, на вибір, шляхом високочастотного ультразвуку, високого тиску, як наприклад, у французькій комірці, що працює під високим тиском, шляхом осмосу, шляхом дії детергентів, ензиматичним шляхом, або дією органічних розчинників, гомогенізаторів, або шляхом комбінації декількох з приведених способів. Очищення протеїнів може бути проведене відомим хроматографічним способом, таким, як молекулярно-ситова хроматографія (гельфільтрація), хроматографія на Q-сефарозі, іонообмінна хроматографія та гідрофобна хроматографія, а також іншими звичайними способами, такими як ультрафільтрація, кристалізація, висалювання, діаліз, та натуральний гельелектрофорез. Придатні способи описані, наприклад, у [Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]. Особливо вигідним для полегшення ізолювання та очищення, може бути надання злитим гідрофобінам спеціальних якірних угр упувань, що можуть зв'язуватись із відповідними комплементарними групами твердих носіїв, особливо придатних для цієї мети полімерних носіїв. Такі тверді носії можуть бути використані як наповнювачі для хроматографічних колонок, і саме таким чином та способом ефективність розділення, як правило, значно підвищується. Такі способи розділення відомі як афінна хроматографія. Для вбудовування якірного угр упування при одержанні протеїну може бути використана система векторів або олігонуклеотидів, яка продовжує кДНК на певну послідовність нуклеотидів, і, таким чином, кодує змінений протеїн, або злитий протеїн. Для полегшення очищення модифіковані протеїни охоплюють у якості якірних угр упувань, так названі, діючі 16 мітки "Tags", так як, наприклад, у відомій модифікації гекса-гістидиновим якорем. Злиті гідрофобіни, модифіковані гістидиновим якорем, можуть бути очи щені із використанням нікель-сефарози, у якості наповнювача для колонки. Надалі, злитий гідрофобін може бути елюйований із колонки із застосуванням придатного елюенту, наприклад, розчину імідазолу. У спрощеному способі очищення можна відмовитись від хроматографічного очищення Для цього клітини спочатку виділяють із ферментативного бульйону із застосуванням придатного методу, наприклад, шляхом мікрофільтрації або центрифугування. Потім клітини можуть бути розкриті за допомогою придатних методів, наприклад, вже вищеописаних методів, а потім фрагменти клітин відділяють від тілець включень (inclusion bodies) Остання процедура може бути вигідно проведена шляхом центрифугування. В кінці, тільця включень можуть бути розкриті за принципово відомими методами, для вивільнення злитих гідрофобінів. Це можна робити, наприклад, дією кислот, основ, та/або детергентів. Тільця включень, що містять використані згідно із винаходом злиті протеїни, можуть бути повністю розчинені, як правило, вже дією 0,1M NaOH на протязі близько 1 години. Чистота одержаних за даним способом злитих протеїнів дорівнює, як правило, 60 до 80ваг.%, відносно кількості всіх протеїнів. Розчин, отриманий згідно описаного, полегшеного способу очищення, може бути застосований для реалізації даного винаходу без подальшого очищення. Гідрофобіни, одержані як описано, можуть бути використані прямо відразу, як злиті протеїни, або після їх розщеплення та відділення від партнерів злиття, як «чисті» гідрофобіни. Якщо передбачається відділення від партнерів злиття, рекомендується у протеїн злиття вбудовувати потенціальне місце розщеплення між частиною гідрофобіну та частиною партнеру злиття (специфічне місце впізнавання для протеаз). У якості місця розщеплення особливо підходять такі пептидні послідовності, які не зустрічаються ні у частині гідрофобіну, ні у частині партнеру злиття, що легко визначається біоінформативними засобами Особливо придатним є розщеплення метіонину дією BrCN, або опосередковане протеазою розщеплення з фактором Xa-, ентерокіназою, тромбіном, TEV (протеазою вірусу Tobacca etch). Згідно із винаходом, гідрофобіни або їх деривати можуть бути впроваджені у бурові розчини, що містять, щонайменше, одну рідку фазу. При цьому може йтися про будь-який склад розчину, доти доки у складі міститься, щонайменше, одна рідка фаза, а особливо така фаза, що базується на маслі (нафті). До складу розчину, у рамках даного винаходу, можуть входити також інші фази. Згідно із винаходом, стосовно складу бурових розчинів на основі масла (нафти), мають на увазі нафту, переважно біодизель, внутрішній олефін, α-олефін, естер рослинного походження, парафін, або суміш на його основі. Придатними розчинниками виступають, наприклад, органічні розчинники, такі як естери, ароматичні сполуки, такі як толуол, спирти, алкани, ал 17 85012 кени, циклоалкени, естери, кетони, нафтени, або галогенвмісні вуглеводні. Для досягнення оптимальної дії, буровий розчин може бути пристосований у відповідність до способу буріння, а також у відповідність до наявних у землі речовин (руди, солі, земляні копалини). Буріння із застосуванням бурового розчину може бути додатково підтримане за рахунок підвищених температур, наприклад від 0 до 400°C, наприклад від 30 до 200°C, особливо від 40 до 150°C. Кількість введеного гідрофобну, або його похідних, може бути варійована у широкому діапазоні, при чому вигідним є розрахунок кількості саме згідно до складу бурового розчину та, відповідно, по відношенню до інших компонентів. Буровий розчин, (особливо, його густина), маєпідходити до відповідних умов, таких як, наприклад, стан геологічного утворення, що мають бурити, глибина буріння, тиск та температура. Несподівано було знайдено, що вже незначні кількості гідрофобну, або його дериватів, призводять до покращання стабільності бурових розчинів та, завдяки цьому, процесу буріння. Щонайменше один гідрофобін, або його дериват, має бути введений в придатній кількості, згідно із винаходом. Як правило, вводиться щонайменше один гідрофобін, або його дериват, у кількості від 0,1 до 10.000м.ч., відповідно до загального складу; переважно, у кількості від 1 до 1000м.ч., а особливо переважно у кількості від 1 до 600м.ч., та дуже особливо переважно, у кількості від 4 до 500м.ч. У рамках даної заявки показник м.ч. означає мг на кг. Бурові розчини, які відповідають винаходу, можуть бути скомбіновані з іншими додатковими компонентами та добавками. Тут, як приклад, мають бути названі масла-носії без або із вираженою детергент-активністю. Придатні мінеральні масла-носії - це фракції що утворюються при переробці нафти, такі як Brightstock, або базова нафта із в'язкістю, як, наприклад, у класі SN 500-2000; але також і ароматичні вуглеводні, парафіни та алкококсіспирти. Також придатним, згідно із винаходом, є відомий як "hydrocrack oil" продукт гідрокрекінгу нафти, а саме така фракція, що утворюється при рафінуванні нафти (фракція після вакуумної перегонки із інтервалом кипіння від близько 360 до 500°C, що отримується із природної нафти шляхом каталітичного гідрування під високим тиском та ізомеризації, а також видалення парафінів). Так само придатними є суміші вищеназваного мінерального масла-носія. Прикладами придатних до застосування згідно із винаходом синтетичних масел-носіїв є наступні вибрані масла: поліолефіни (поліальфаолефіни або внутрішні поліолефіни, поліестери, поліалкоксилати, поліетери, аліфатичні поліетераміни, алкілфенол - ініційовані поліетери, алкілфенол - ініційовані поліетераміни та естери карбонових кислот із довголанцюговими спиртами. Прикладами придатних поліолефінів є олефінполімери із Mn=400 до 1800, на основі, перед усім, полібутену або поліізобутену (гідровані або негідровані). 18 Наступні придатні системи масла-носія, наприклад описані у [DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DE-A 43 09 074, EP-A 0 452 328 та EP-A 0 548 617], на які тут було зроблено певний наголос. Названі масла-носії вводять у показаних кількостях, придатних для відповідного застосування, за вибором фахівців. Інші звичайні добавки - це інгібітори корозії, наприклад, на основі амонійних солей органічних карбонових кислот, що здатні до утворення плівок, або на основі гетероциклічних ароматичних сполук, у випадку корозійного захисту кольорових металів; антиоксиданти або стабілізатори, наприклад, на основі амінів; інші традиційні емульгатори; антистатики; металоцени, такі як фероцени; лубриканти (Lubricity-Additive), такі як певні жирні кислоти, алкенільовані естери бурштинової кислоти, Біс-(гідроксиалкіл)аміни жирного ряду, гідроксиацетамід або рицинова олія; барвники (маркери), добавки для компенсації втрати рідини (наприклад, полімери), речовини для встановлення густини, модифікатори реологічних властивостей, такі речовини, які утворюють внутрішній фільтрувальний осад (наприклад, бентоніт чи глини), вапно, або інші емульгатори. При необхідності додають також аміни для зниження величини рН. Винахід висвітлено ближче на наступних прикладах Приклади Приклад 1 Підготовчі роботи для клонування yaadHis 6/yaaE-HiS6 За допомогою олігонуклеотидів НаІ570 та НаІ571 (HaI572/HaI573) проводять полімеразну цепну реакцію. Як темплати, використовують геномні ДНК Bakteriums Bacillus subtilis. Отриманий фрагмент ПЦР містить кодуючу послідовність генів yaaD/уааЕ від Bacillus subtilis, а на кінцях, Ncol, відповідно BgIII, обмежуючі або рестриктивні сегменти - стики. Фрагмент ПЦР очищюють та розрізають за допомогою обмежууючи х-рестриктивних ендо-нуклеаз Ncol та BgIII. Ці фрагменти ДНК використовують у якості вставки, та клонують у перед цим лінеаризованому, за допомогою обмежууючи х-рестриктивних ендонуклеаз Ncol та BgIII, векторі pQE60 від фірми Qiagen. Таким чином створені вектори pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5 можуть бути застосовані для експресії протеїнів, що складаються з YAAD::HIS6, відповідно, YAAE::HIS6 . Приклад 2 Клонування yaad-гідрофобіну DewA-His 6 За допомогою олігонуклеотидів HKaM 416 und KaM 417 проводять полімеразну цепну реакцію. Як темплати, використовують геномні ДНК плісеневих грибків Aspergillus nidulans. Отриманий фрагмент ПЦР містить послідовність гену dewA, що кодує гідрофобін, та N-термінальний сегмент для розщеплення факторХа протеїназою. Фрагмент ПЦР очищюють та розрізають за допомогою обмежуую 19 85012 чих-рестриктивних ендонуклеаз ВаmНІ. Ці фрагменти ДНК використовують у якості вставки, та клонують у перед цим лінеарізованому, за допомогою обмежуючої-рестриктивноїендонуклеази BgIII, векторі pQE60YAAD#2. Таким чином створений вектор #508 може бути застосований для експресії злитих протеїнів, що складаються з YAAD::Xa::dewA::HIS 6. Приклад 3 Клонування yaad-гідрофобіну RodA-His 6 Клонування плазміду #513 відбувається аналогічно до плазміду #508, із використанням олігонуклеотидів KaM 434 та KaM 435. Приклад 4 Клонування yaad- гідрофобіну BASFI-His 6 Клонування плазміду #507 відбувається аналогічно до плазміду #508 із використанням олігонуклеотидів KaM 417 та KaM 418. У якості темплатів ДНК застосовують синтетично синтезовану послідовність ДНК - гідрофобін BASF1 (дивись додаток, SEQ ID NO. 11 та 12). Приклад 5 Клонування yaad-гідрофобіну BASF2-His 6 Клонування плазміду #506 відбувається аналогічно до плазміду #508, із використанням олігонуклеотидів KaM 417 та KaM 418. У якості темплатів ДНК застосовують синтетично синтезовану послідовність ДНК - гідрофобін BASF2 (дивись додаток, SEQ ID NO. 13 та 14). Приклад 6 Клонування yaad- гідрофобіну SC3-His 6 Клонування плазміду #526 відбувалось анологічно до плазміду #508 із використанням олігонуклеотидів KаМ464 та KаМ465. У якості темплатів ДНК застосовують кДНК від Schyzophyllum commune (дивись додаток, SEQ ID NO. 9 та 10). Приклад 7 Ферментація рекомбінантних штаммів Е.соlі yaad-гідрофобіну DewA-His 6 Інокуляція 3мл рідкого середовища LB (LB - це клеруема суміш сахару-сирця Il кристалізації) з штаммом Е.соlі, що експримуе yaad-гідрофобін DewA-His 6, у тр убочці Грейнера на 15мл. Інкубація на протязі 8 годин при 37°С на встряхувачі із швідкістю 200 оборотів за хвилину. Кожні 21л колби Ерленмейера із дефлекторами, що містять 250мл LB середовища (+100мкг/мл ампциліну), відповідно, заражають 1мл культури та інкубують на протязі 9 годин при 37°С на встряхувачі із швідкістю 180 оборотів за хвилину. 13,5л LB-середовища (+100мкг/мл ампциліну) у 20л ферментаторі заражають 0,5л культури (оптична густина при 600нм 1:10, виміряна відносно H2O). При оптичній густині на 60нм близько ~3,5 додають 140мл 100мМ розчину IPTG. Після 3 годин ферментації ферментативний бульон охоло 20 джують до 10°C та центрифугують. Клітковий центрифуга т використовують для подальшого очищення. Приклад 8 Очищення рекомбінантних гідрофобін-вмісних злитих протеїнів 100г кліткового центрифугату (100-500мг гідрофобіну) доводять до 200мл буферним натрійфосфа тним розчином (50мМ, рН7,5), та ресуспендують. Суспензію обробляють за допомогою приладу Ultraturrax Тур Т25 (Janke und Kunkel; IKALabortechnik) на протязі 10 хвилин та, вслід за цим, інкубують на протязі 1 години, при кімнатній температурі із 500 одиницями бензонази (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) для утворення нуклеїнових кислот. Перед розкриттям клітин, суспензію фільтрують на скляному картуші (Р1). Для розкриття та для розрізання залишкового геномного ДНК проводять два етапи гомогенізації при 1.500бар (мікрофлюідізатор М-110ЕН; Microfluidics Corp.). Гомогенізат центрифугують (Sorvall RC-5B, ротор GSA, центрифузійні стакани ємністю 250мл, 60 хвилин, 4°C, 12.000 оборотів за хвилину, 23.000g), залишок поміщають на лід та центрифугат повторно суспендують у 100мл натрійфосфа тного буфер у з рН7,5. Центрифугування та повторне суспендування повторюють тричі, причому натрій-фосфатний буферний розчин при третьому повторі містить 1% SDS. Після повторного суспендування суміш перемішують протягом однієї години та проводять заключне центрифугування (Sorvall RC-5B, ротор GSA, центрифузійні стакани ємністю 250мл, 60 хвилин, 4°С, 12.000 оборотів за хвилину, 23.000г). Згідно аналізу SDS-PAGE, гідрофобін міститься у рідкій фазі після заключного центрифугування (Зображення 1). Досліди показують, що гідрофобін міститься у відповідних клітинах E. соlі, ймовірно, у формі тілець включення. 50мл рідкої фази, що містить гідрофобін, наносять на нікель-сефарозну високоефективну колонку об'ємом 50мл 17-5268-02 (Amersham), яку було урівноважено пропусканням буферу Tris-CI з концентрацією 50мМ із рН8,0. Потім колонку миють буферним розчином Tris-CI з концентрацією 50мМ та рН8,0, після чого проводять елюювання гідрофобіну за допомогою буферного розчину Tris-CI із рН8,0 та концентрацією 50мМ, що містить 200ммоль імідазолу. Для видалення імідазолу проводять діаліз розчину проти буферного розчину Tris-CI із рН8,0 та концентрацією 50мМ. Зображення 1 показує очищення отриманих гидрофобинів: Слід А: Нанесення на нікель-сефарозну колонку (розведення 1:10) Слід В: Проток= стадія промивки елюату Сліди C-E: оптична густина 280 максимумів елюйованих фракцій (WP1, WP2, WP3) Слід F показує нанесений маркер. Гідрофобін з Фіг. має молекулярну вагу прибл. 53000 D. Маленькі смуги частково репрезентують продукти розщеплення гідрофобіна. Приклад 9 Перевірка технічного застосування; Характеризування гідрофобіна за зміною контактного кута при змочуванні скляної платівки краплиною води. 21 85012 Субстрат: Скло (Віконне скло, південно-німецьке скло, Манхайм): Використовують гідрофобин, очищений за прикладом 8. - Концентрація гідрофобіна у розчині: 100мкг/мл, крім того, розчин містить 50мМ Naацетатний буфер а також 0,1% поліоксиетилен (20)-сорбитан-монолауреат (Tween® 20)), рН розчину - 4 - Скляні пластини занурюють в цей розчин протягом ночі (при температурі 80°C), Після цього скляні пластини, вкриті гідрофобіном, виймають з розчину, та миють дистильованою водою, - Після цього проводять інкубацію пластин протягом 10 хвилин при 80°C у 1-% розчині SDS у дистильованій воді, - Проводять наступне промивання пластин у нових порціях дистильованої води. Проби висушують на повітрі і вимірюють контактний кут вкритих пластин краплиною води (5мкл) при кімнатній температурі. Контактний кут вимірюють на пристрої Contact Angle System OCA 15+, програмне забезпечення SCA 20.2.0. (Листопад 2002). Вимірювання проводять за рекомендаціями виробника. Необроблене скло мало контактний кут змочування 30±5°; Скло, яке було оброблено гідрофобіном, згідно прикладу 8 (yaad-dewA-his 6), мало контактний кут змочування 75±5°. ==> Збільшення кута змочування: 45° Приклад 10 Отримання бурового розчину на основі нафти, який містить концентрат гідрофобіну (yaad-XadewA-His 6) Концентрат гідрофобіну у кількості a) 0м.ч. b) 10м.ч. c) 100м.ч. d) 10.000м.ч. використовували у препараті, який містив 222мл біодізеля, а також 61мл 21-% розчину хлориду кальцію. Із використанням пристрою для емульгування (Ultra Turrax T50), були приготовлені різноманітні емульсії при 2000, 6000 та 10000 обертах за хвилину та часу перемішування, що дорівнював 5 і 10 хвилинам. Для кожного зразка бурового розчину емульсії були проведені емульгаційні тести (аналогічно DIN 51415). При цьому компоненти змішували один з одним із використанням наведених умови (час обертання та швидкість обертання). Після цього спостерігали проходження процесу розшарування, в залежності від часу обертання. Оцінка проводилась за допомогою стандартів, при цьому використовували наступні позначення: 1 - відповідає повному розшаруванню емульсії, 2 - відповідає частковому розшаруванні при відокремленні води, 3 - відповідає невстановленому розшаруванню емульсії. 22 Результати вимірювання для приведених концентрацій гідрофобіну наведені у таблиці. Оцінку розшарування фаз проводили кожний раз через 1 хвилину, 24 години та 48 годин (щоразу при кімнатній температурі 23°C). Також, надалі проводили експерименти при постійній температурі, що дорівнювала 80°C. Таблиця Приклад Умов и 10 а (порів 5хв . 6000об./хв . няння) 10 а (порів 10хв . 6000об./хв. няння) 10b 5хв . 6000об./хв . 10b 10хв . 6000об./хв. 10с 5хв . 6000об./хв . 10с 10хв . 6000об./хв. 10d 5хв . 6000об./хв . 10d 10хв . 6000об./хв. 1хв . 24 48 24год., год. год. 80°С 3 1 1 1 3 1 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 2 2 2 3 Коментар: Без додавання гідрофобіну А спостерігалось прискорене розшарування бурового розчину. Відмітка 1 не є сприйнятою у практиці нафтобуріння. Навіть у найменшій кількості гідрофобіни вже надають емульгуючого ефекту. Вже 10м.ч. гідрофобіну (менш ніж 1мг) призводять до прийнятного результату. У разі застосування більших дозувань гідрофобіну виявляється ще кращій результат, в особливості, стосовно термічної стабільності. Відповідність назв послідовностей послідовністям ДНК та поліпептидів в протоколі послідовностей dewA послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 1 dewA послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 2 rodA послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ IDNO: 3 rodA послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 4 hypA послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 5 hypA послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 6 hypB послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 7 hypB послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 8 sc3 послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 9 sc3 послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 10 basfi послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 11 basfi послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 12 basf2 послідовність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 13 basf2 послідовність поліпептидів SEQ ID NO: 14 yaad послідовність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 15 yaad послідовність поліпептидів SEQ ID NO: 16 уаае послідовність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 17 уаае послідовність поліпептидів SEQ ID NO: 18 yaad-Xa-dewA-his послідов ність ДНК та SEQ ID NO: 19 поліпептидів yaad-Xa-dewA-his послідовність поліпеп- SEQ ID NO: 20 тидів yaad-Xa-rodA-his послідов ність ДНК та SEQ ID NO: 21 поліпептидів yaad-Xa-rodA-his послідовність поліпеп- SEQ ID NO: 22 тидів yaad-Xa-basf1-his послідов ність ДНК та SEQ ID NO: 23 поліпептидів yaad-Xa-basf1-his послідов ність поліпеп- SEQ ID NO: 24 тидів 23 85012 24 25 85012 26 27 85012 28 29 85012 30 31 85012 32 33 85012 34 35 85012 36 37 85012 38 39 85012 40 41 85012 42 43 85012 44 45 85012 46 47 85012 48 49 85012 50 51 85012 52 53 85012 54 55 85012 56 57 85012 58 59 85012 60