Застосування гідрофобіну як деемульгатора у водних композиціях, спосіб розділення фаз та утворена композиція

1. Застосування щонайменше одного гідрофобіну загальної структурної формули (І): Хn-С 1-Х1-50-С2-Х0-5-С3-Х1-100-С4-Х1- 100-С 5-Х1-50-С6-Х0-5С7-Х1-50-C8-Хm, (І) де залишки X, які можуть бути різними або однаковими, означають будь-яку із 20 природних амінокислот: Phe, Leu, Ser, Туr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly, індекси n та m, що стоять при X, означають кількість амінокислот, залишки С1-С8 означають цистеїн, аланін, серин, гліцин, метіонін або треонін, причому щонайменше 4 з названих залишків С 1-С8 означають цистеїн, а індекси n та m незалежно один від одного означають натуральні числа між 0 та 500, 2 (19) 1 3 85011 4 Хn-С 1-Х1-50-С2-Х0-5-С3-Х1-100-С4-Х1- 100-С 5-Х1-50-С6-Х0-5С7-Х1-50-C8-Хm, (І) де залишки X, які можуть бути різними або однаковими, означають будь-яку із 20 природних амінокислот: Phe, Leu, Ser, Туr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly, індекси n та m, що стоять при X, означають кількість амінокислот, залишки С1-С8 означають цистеїн, аланін, серин, гліцин, метіонін або треонін, причому щонайменше 4 з названих залишків С 1-С8 означають цистеїн, а індекси n та m незалежно один від одного означають натуральні числа між 0 та 500. 10. Спосіб за п.9, який відрізняється тим, що щонайменше один гідрофобін є злитим гідрофобіном або його похідною. 11. Спосіб за п.10, який відрізняється тим, що злитий гідрофобін є щонайменше одним гідрофобіном, вибраним з групи: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 або SEQ ID NO: 24. 12. Спосіб за будь-яким з пп.9-11, який відрізняється тим, що композиція, яка містить щонайменше дві рідкі фази, вибрана з групи: композиції, що містять масло та воду, композиції, що містять пальне або паливні матеріали та воду, реакційні суміші, що містять щонайменше дві рідкі фази. 13. Спосіб за будь-яким з пп.9-12, який відрізняється тим, що щонайменше один гідрофобін використовують у кількості від 0,0001 до1000м.ч. у перерахунку на всю композицію. 14. Спосіб за п.13, який відрізняється тим, що композицією є композиція сирої нафти і води, та щонайменше один гідрофобін використовують у кількості від 1 до 800м.ч. у перерахунку на всю композицію. 15. Спосіб за п.13, який відрізняється тим, що композицією є композиція пального/паливного матеріалу і води, та щонайменше один гідрофобін використовують у кількості від 0,001 до 10м.ч. у перерахунку на всю композицію. 16. Спосіб за будь-яким з пп.9-15, який відрізняється тим, що до або після додавання щонайменше одного гідрофобіну підвищують температуру композиції, що містить щонайменше дві рідкі фази. 17. Композиція, що містить воду та щонайменше одну сполуку, вибрану з гр упи: пальне, паливні матеріали, сира нафта або розчинні у воді або маслі полімерні розчини, а також щонайменше один гідрофобін загальної структурної формули (І): Хn-С 1-Х1-50-С2-Х0-5-С3-Х1-100-С4-Х1- 100-С 5-Х1-50-С6-Х0-5С7-Х1-50-C8-Хm, (І) де залишки X, які можуть бути різними або однаковими, означають будь-яку із 20 природних амінокислот: Phe, Leu, Ser, Туr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly, індекси n та m, що стоять при X, означають кількість амінокислот, залишки С1-С8 означають цистеїн, аланін, серин, гліцин, метіонін або треонін, причому щонайменше 4 з названих залишків С 1-С8 означають цистеїн, а індекси n та m незалежно один від одного означають натуральні числа між 0 та 500, причому гідрофобін міститься у кількості від 0,0001 до 1000 м.ч. у перерахунку на всю композицію. 18. Композиція за п.17, яка відрізняється тим, що містить щонайменше одне пальне або паливний матеріал та гідрофобін або його похідну у кількості від 0,001 до 0,5м.ч. у перерахунку на всю композицію. 19. Композиція за п.18, яка відрізняється тим, що пальне або паливні матеріали вибрано з групи: бензин, дизельне або газотурбінне пальне. 20. Композиція за будь-яким з пп.17-19, яка відрізняється тим, що щонайменше один гідрофобін є злитим гідрофобіном. 21. Композиція за п.20, яка відрізняється тим, що злитим гідрофобіном є щонайменше один гідрофобін, вибраний з групи: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 або SEQ ID NO: 24. Даний винахід стосується застосування щонайменше одного гідрофобіну або щонайменше однієї похідної гідрофобіну для покращення розділення фаз у композиціях, що містять щонайменше дві рідкі фази, способу розділення щонайменше двох рідких фах у композиції, що містить щонайменше дві рідкі фази, а також рецептур, що містять щонайменше одну сполуку, вибрану із групи, яка включає пальне, паливні матеріали, сиру нафту або розчинні у воді або маслі полімерні розчини та щонайменше один гідрофобін або його похідні. Гідрофобіни представляють собою малі білки, що складаються з 100-150 амінокислот та можуть бути одержані з волокнистих грибів, наприклад Schizophyllum commune. Вони, як правило, містять 8 цистеїнових одиниць на молекулу. Гідрофобіни мають виражену спорідненість до поверхні розділу фаз і тому є придатними для нанесення покриття на поверхні, наприклад, з метою зміни властивостей межі розділу фаз шляхом утворення амфіфільних мембран. Так, наприклад, тефлон може бути покритий гідрофобінами при одержанні гідрофільної поверхні. Гідрофобіни можуть бути виділені з природних джерел. Крім того відомі інші способи одержання гідрофобінів та їх похідних. Так, наприклад, [DE 10 2005 007 480.4] описує спосіб одержання гідрофобінів та їх похідних. У рівні техніки застосування гідрофобінів було запропоновано для різних цілей. У [WO 96/41882] пропонують використовувати гідрофобіни як емульгатори, загусники, поверхнево-активні речовини, для гідрофілізації гідрофобних поверхонь, для покращання водостійкості гідрофільних субстратів, для одержання емульсій типу вода-у-маслі та масло-у-воді. Крім того були запропоновані застосування для фармацевтичних цілей, такі як виготовлення мазей або кремів, а також для косметичних цілей, такі як засоби для захисту шкіри або виготовлення шампунів для во 5 85011 лосся або ополіскувачів для волосся. [WO 96/41882] описує також композиції, зокрема композиції для фармацевтичного застосування, що містять гідрофобін. [EP-A 1 252 516] описує нанесення покриття на вікна, контактні лінзи, біосенсори, медичні прилади, посуд для здійснення досліджень або для зберігання, корпуси кораблів, тверді частинки або рами чи кузов легкових автомобілів розчином, що містить гідрофобін, при температурі від 30 до 80°C. [WO 03/53383] описує застосування гідрофобіну для обробки кератинових матеріалів у косметичних цілях. У [WO 03/10331] стверджують, що гідрофобін виявляє поверхнево-активні властивості. Так, описаний сенсор, покритий гідрофобіном, наприклад, для застосування як вимірювальний електрод, до поверхні якого нековалентно приєднані інші речовини, наприклад, електроактивні речовини, антитіла або ферменти. [WO 2004/000880] описує також спосіб нанесення покриття на поверхні за допомогою гідрофобіну або гідрофобін-подібних речовин. Крім того описано, що емульсії типу масло-у-воді або водау-маслі також можуть бути стабілізовані шляхом додавання гідрофобіну. У [WO 1/74864], що стосується гідрофобінподібних білків, також описано, що вони можуть бути використані для стабілізації дисперсій та емульсій. Застосування білків для розділення фаз загалом є відомим. [GB 195,876] описує спосіб розбиття емульсій типу вода-у-маслі з використанням колоїдів. Як колоїди використовують, наприклад, білки, такі як желатин, казеїн, альбумін, або полісахариди, такі як каучук типу Gummi Arabicum або Gummi Tragacanth. [JP-A 11-169177] описує застосування білків з активністю ліпази для розбиття емульсій. [WO 01/60916] описує використання сумішей, що не містять поверхнево-активні речовини та складаються із щонайменше одного водорозчинного білка, щонайменше одного водорозчинного полісахариду, а також щонайменше одного водорозчинного полімеру, такого як, наприклад, поліетиленоксид, для різних застосувань, серед яких також деемульгування сирої нафти. Жоден з цитованих документів не описує застосування гідрофобінів для розділення фаз. Перевага застосування білків полягає в тому, що йдеться про речовини природного походження, здатні до біологічного розпаду, які завдяки цьому не забруднюють навколишнє середовище. У багатьох випадках застосування у промислових масштабах, наприклад, для розділення емульсій типу сира нафта-у-воді, е фективність залежить від якомога більш швидкого розділення фаз. Задача винаходу полягає у розробці покращеного способу розділення фаз за допомогою білків. Згідно з винаходом ця задача вирішується застосуванням щонайменше одного гідрофобіну для 6 покращення розділення фаз у композиціях, що містять щонайменше дві рідкі фази. При цьому гідрофобін згідно з винаходом може бути застосований у будь-яких кількостях, доки він гарантує покращення розділення фаз у композиціях що містять щонайменше дві рідкі фази. Під "покращенням розділення фаз" в рамках даного винаходу розуміють, що розділення двох рідких фаз відбувається швидше при додаванні речовини у суміш, нім у цій самій суміші без додавання речовини або що розділення двох рідких фаз можливе лише при додаванні речовини. Під гідрофобіном у рамках даного винаходу розуміють також його похідні або модифіковані гідрофобіни. Коли мова йде про модифіковані або дериватизовані гідрофобіни, то мають на увазі, наприклад, гідрфобін-злиті білки або такі білки, що містять таку послідовність амінокислот, яка на щонайменше 60%, наприклад, на щонайменше 70%, зокрема на щонайменше 80%, особливо переважно на щонайменше 90% та зокрема особливо переважно на щонайменше 95% ідентична послідовності гідрофобіну та яка також до 50% або, наприклад, до 60%, зокрема до 70%, особливо переважно до 80% характеризується біологічними властивостями гідрофобіну, зокрема має властивість змінювати властивості поверхонь за рахунок їх покриття таким чином, що контактний кут водної краплини до та після нанесення покриття за допомогою білка на поверхню скла зростає на щонайменше 20°, переважно на щонайменше 25°, зокрема на щонайменше 30°. Несподівано з'ясували, що гідрофобіни або їх похідні покращують розділення щонайменше двох рідких фаз. Це є особливо вигідним, якщо необхідно досягти швидкого розділення фаз або запобігти утворенню емульсій. При цьому активними є вже менші кількості речовини. Крім того цю властивість використовують також, коди необхідно розбити вже існуючі емульсії. Сполуки, що розбивають емульсії, називають деемульгаторами. Таким чином даний винахід стосується також описаного вище застосування щонайменше одного гідрофобіну або щонайменше однієї його похідної, причому щонайменше один гідрофобін або щонайменше одну його похідну використовують як деемульгатор. Для визначення гідрофобінів вирішальне значення має структура, а не специфіка послідовності гідрофобіну. Послідовність амінокислот природного гідрофобіну дуже різноманітна, однак всі вони мають високохарактерний узор, що складається із 8 збережених залишків цистеїну. Ці залишки утворюють 4 внутрішньо-молекулярних дисульфідних містка. N- та С-термінальні залишки варіюються у широкому діапазоні. При цьому можуть бути наведені, наприклад, одержані відомими фахівцям технологіями молекулярної біології партнери злиття білки довжиною від 10 до 500 амінокислот. Крім того в рамках даного винаходу під гідрофобінами та їх по хідними розуміють білки із схожою структурою та функціональною еквівалентністю. 7 85011 Під терміном "гідрофобін" в рамках даного винаходу слід розуміти такі поліпептиди загальної структурної формули (І) Xn-C 1-Х1-50-С2–Х0-5-С3-Х1-100-С4- Х1-100-С5-Х1-50(І) С6-Х0-5-C7-Х1-50-С8-Хm причому X може означати будь-яку з 20 природних амінокислот (Phe, Leu, Ser, Туг, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, lle Met, Thr, Asn, Lys, VaI, Ala, Asp, GIu, GIy). При цьому X можуть бути різними або однаковими. Індекси, що стоять при X, означають кількість амінокислот, залишки C означають цистеїн, аланін, серин, гліцин, метіонін або треонін, при чому щонайменше 4 із названих залишків C означають цистеїн, а індекси n та m незалежно один від одного означають натуральні числа від 0 та 500, переважно від 15 до 300. Поліпептиди згідно з формулою (І) характеризуються також такою властивістю: вони після нанесення покриття на скляну поверхню при кімнатній температурі сприяють збільшенню контактного кута водної краплини на щонайменше 20°, переважно на щонайменше 25° та особливо переважно на 30°, відповідно у порівнянні із контактним кутом водної каплі такого ж розміру на непокритій скляній поверхні. С1-С8-амінокислотами є це переважно цистеїни; вони можуть бути замінені іншими амінокислотами, що мають подібне об'ємне заповнення, такими як переважно аланін, серин, треонін, метіонін або гліцин. Однак щонайменше 4, переважно щонайменше 5, особливо переважно щонайменше 6 та зокрема щонайменше 7 положень від C1 до C8 повинні складатися з цистеїну. Цистеїни можуть входити до складу білків згідно з винаходом у вигляді фрагментів або утворювати між собою дисульфідні містки. Особливу перевагу надають внутрішньомолекулярному формуванню містків C-C, зокрема таких, що містять щонайменше 1, переважно, 2, особливо переважно 3 та найбільш переважно 4 внутрішньо-молекулярних дисульфідних містка. У випадку описаного вище обміну цистеїну на амінокислоти із подібним просторовим заповненням переважно попарно заміщують такі С-положення, які одна з одною можуть утворювати внутрішньомолекулярні дисульфідні містки. Якщо у положеннях, позначених X, використовують цистеїни, серини, аланіни, гліцини, метіоніни або треоніни, то нумерація окремих С-позицій у загальній формулі може бути змінена відповідним чином. Для реалізації даного винаходу використовують переважно гідрофобіни загальної формули (II) Xn-C 1-Х3-25-С2-Х0-2-С3-Х5-50-С 4-Х2-35-С5-Х2-15-С6(IІ) X0- 2-C7-Х3-35-С8-Хm причому X, C та індекси, що знаходяться біля них, мають вказані вище значення, індекси n та m означають числа від 0 до 300, а білки відрізняються описаною вище зміною контактного кута, та у випадку щонайменше 6 залишків, позначених C, йдеться про цистеїн. Особливо переважно у випадку всіх залишків, позначених C, мають на увазі цистеїн. Особливу перевагу надають застосуванню гідрофобінів загальної формули (III) 8 Xn-C 1-Х5-9-С2-C3-Х11-39-С4-Х2- 23-С5-Х5-9-С6-C7-Х6(IIІ) 8 18-С -Xm причому X, C та індекси, що знаходяться біля них, мають вказані вище значення, індекси n та m означають числа від 0 до 200, а білки відрізняються описаною вище зміною контактного кута, та у випадку щонайменше 6 залишків, позначених C, йдеться про цистеїн. Особливо переважно у випадку всіх залишків, позначених C, мають на увазі цистеїн. У випадку залишків Xn та Хm мова може йти про такі послідовність пептидів, що природно також зв'язані з гідрофобіном. Крім того у випадку одного або обох залишків мова може йти також про таку пептидну послідовність, яка природно не зв'язана із гідрофобіном. Під нею розуміють також такі залишки Xn та/або Хm, в яких пептидна послідовність, що природно зустрічається в гідрофобіні, продовжена за рахунок пептидної послідовності, що природно не зустрічається в гідрофобіні. Якщо під Xn та/або Хm розуміють пептидні послідовності, що природно не зв'язані з гідрофобіном, то довжина таких послідовностей становить, як правило, щонайменше 20, переважно щонайменше 35, особливо переважно щонайменше 50 та найбільш переважно щонайменше 100 амінокислот. Такий природно не зв'язаний із гідрофобіном залишок надалі називають також партнером злиття. Цим самим виражають те, що гідрофобіни можуть складатися із щонайменше однієї частини гідрофобну та однієї частини партнеру злиття, які разом в такій формі не зустрічаються в природі. Частина партнеру злиття може бути вибрана із великої кількості білків. Також із однієї частиною гідрофобіну можуть бути зв'язані кілька партнерів злиття, наприклад, біля термінальної аміногрупи (Xn), та біля термінальної карбоксильної групи (Хm) частини гідрофобіну. Крім того, наприклад, два партнери злиття можуть бути зв'язані з одним положенням (Xn або Хm) білка згідно з винаходом. Особливо придатними партнерами злиття є такі білки, що природно зустрічаються в мікроорганізмах, зокрема в E соlі або Bacillus subtilis. Прикладами таких партнерів злиття є послідовності yaad (SEQ ID NO: 15 та 16), уаае (SEQ ID NO: 17 та 18) та тіоредоксин. Особливо придатними є також фрагменти або похідні цих зазначених послідовностей, які охоплюють лише одну частину, наприклад від 70 до 99%, переважно від 5 до 50% та особливо переважно від 10 до 40% зазначених послідовностей, або в яких окремі амінокислоти або нуклеотиди змінені у порівнянні із зазначеною послідовністю, причому показники в% стосуються відповідно числа амінокислот. В іншій переважній формі виконання злитий гідрофобін поряд із партнером злиття як групу Xn або Хm містить також так званий домен спорідненості (мітка спорідненості / хвіст спорідненості). При цьому йдеться про принципово відомий вид та спосіб утворення якірних угр упувань, які можуть вступати у взаємодію з певними комплементарними групами та можуть бути використані для полегшення обробки і очищення білків. Прикладами таких доменів спорідненості є (His)k-, (Arg) k-, (Asp)k-, (Phe)k- або (Cys)k-групи, причому k загалом 9 85011 означає натуральне число від 1 до 10. Переважно йдеться про (His)k-груп у, причому k означає від 4 до 6. Білки, які згідно з винаходом використовують як гідрофобіни або їх похідні, можуть також бути модифіковані у своїй поліпептидній послідовності, наприклад, шляхом глікозилювання, ацетилювання або також шляхом поперечного зшивання, наприклад, із глютаровим альдегідом. Однією з властивостей використовуваних згідно з винаходом гідрофобінів або їх похідних є зміна поверхневих властивостей у випадку поверхонь, покритих білками. Зміни поверхневих властивостей експериментально визначають шляхом вимірювання контактного кута водної краплини до та після нанесення покриття на поверхню за допомогою білка та підраховують різницю обох вимірювань. Спосіб вимірювання контактного кута загалом відомий фахівцям. Вимірювання здійснюють при кімнатній температурі з використанням водних крапель об'ємом 5мкл та скляних пластин як субстрату. Точні експериментальні умови такого придатного методу вимірювання контактного кута представлені у експериментальній частині. За описаних там умов використовувані згідно з винаходом злиті білки характеризуються властивістю збільшувати контактний кут на щонайменше 20°, переважно на щонайменше 25°, особливо переважно на щонайменше 30°, відповідно у порівнянні із контактним кутом водної краплини такого ж розміру на непокритій поверхні скла. Особливу перевагу при здійсненні даного винаходу надають гідрофобінам типу dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, які структурно охарактеризовані у наведеному нижче протоколі послідовностей. Мова може йти також лише про їх частини або похідні. Крім того кілька частин гідрофобіну, переважно 2 або 3 частини однакової або різної структури, можуть бути зв'язані між собою та із відповідною придатною поліпептидною послідовністю, яка природно не зв'язана з гідрофобіном. Згідно із винаходом особливо придатними є також злиті білки yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) або yaad-Xabasf1-his (SEQ ID NO: 24) із представленими у дужках поліпептидними послідовностями, а також послідовностями нуклеїнових кислот, що їх кодують, зокрема послідовностями відповідно до SEQ ID NO: 19, 21, 23. Крім того особливу перевагу надають також білкам, які, виходячи із представлених в SEQ ID NO. 20, 22 або 24 поліпептидних послідовностей, одержують обміном, інсерцією або делецією щонайменше однієї, до 10, переважно 5, особливо переважно 5% всіх амінокислот та які мають щонайменше 50% біологічних властивостей вихідних білків. Під біологічною властивістю білків розуміють описану вище зміну контактного кута на щонайменше 20°. Особливо придатними похідними для здійснення винаходу є одержані шляхом скорочення партнеру злиття yaad залишки, похідні від yaadXa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) або yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 10 24). Замість повноцінного партнеру злиття yaad (SEQ ID NO: 16), який складається з 294 амінокислот, може бути вигідно використаний скорочений залишку yaad. Скорочений залишок повинен містити щонайменше 20, переважно щонайменше 35 амінокислот. Так, наприклад, може бути використаний скорочений залишок, що містить від 20 до 293, переважно з від 25 до 250, особливо переважно від 35 до 150 та, наприклад, від 35 до 100 амінокислот. Місце розділення між гідрофобіном та партнером або партнерами злиття може бути використане для виділення чистого гідрофобіну в недериватизованій формі (наприклад, шляхом розщеплення на метіонін під дією BrCN, фактора Xa, ентерокінази, тромбіну, TEV (протеази вірусу Tobacca etch), і т.д.). Злиті білки можуть також бути послідовно генеровані з партнеру злиття, наприклад yaad або уаае, та інших гідрофобінів з різними послідовностями, наприклад, DewA-RodA або Sc3-DewA, Sc3RodA. Крім того можуть бути використані фрагменти гідрофобіну (наприклад, N- або С-кінцеві скорочення) або мутеїн, що мають до 70% гомології. Вибір оптимальної конструкції кожен раз відбувається з урахуванням відповідного використання, тобто рідких фаз, які необхідно розділити. Використовувані згідно з винаходом гідрофобіни або відповідно гідрофобіни, що входять до складу рецептур згідно із винаходом, можуть бути одержані хімічним шляхом відомими способами пептидного синтезу, наприклад, шляхом твердофазного синтезу Меррифілда. Гідрофобіни, що зустрічаються у природі, можуть бути виділені з природних джерел придатними методами, наприклад, згідно з [Wosten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) або WO 96/41882]. Одержання злитих білків можна переважно здійснювати способами генної інженерії, згідно з якими один з партнерів злиття та одну з послідовностей нуклеїнових кислот, що кодує частину гідрофобіну, зокрема послідовність ДНК, комбінують таким чином, що в одному організмі-хазяїні за рахунок генної експресії комбінованої послідовності нуклеїнових кислот утворюється бажаний білок. Такий спосіб одержання описаний, наприклад, у [DE 10 2005 007 480]. При цьому придатними організмами-хазяїнами (продуктивними організмами) для зазначеного способу одержання можуть бути прокаріоти (включаючи Archaea) або еукаріоти, особливо бактерії, включаючи галобактерії та Metanococceen, грибки, клітини комах, клітини рослин та ссавців, особливо переважно Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (або відповідно споріднені клітини), та ін. Предметом винаходу є також застосування експресійних конструктів, що містять регуляторну під генетичним контролем послідовність нуклеїнових кислот, послідовність нуклеїнових кислот, що кодує використовуваний згідно з винаходом полі 11 85011 пептид, а також вектори, включаючи щонайменше один із цих експресійних конструктів. Переважно використовувані конструкти у напрямку 5'-проти течії по відношенню до відповідної послідовності, що кодує, включають промотор, а у напрямку 3'-за течією - термінаторну послідовність, а також, в разі потреби, інші звичайні регулятивні елементи, причому в кожному випадку вони оперативно зв'язані з послідовністю, що кодує. Під поняттям "оперативно зв'язані" в рамках даного винаходу розуміють послідовну організацію промотору, послідовності, що кодує, термінатора та, в разі потреби, інших регулятивни х елементів таким чином, що кожен із регулятивних елементів може виконувати свою визначену функцію в процесі експресії послідовності, що кодує. Прикладами оперативно-з'єднуваних послідовностей є цільові (таргетної) послідовності, а також енхансери, поліаденілювальні сигнали і т.п.. Інші регулятивні елементи включають здатні до селекції маркери, ампліфікаційні сигнали, джерела реплікації і т.п.. Придатні регуляторні послідовності описані, наприклад, в [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]. На додаток до цих регуляторних послідовностей може відбуватися також природне регулювання цих послідовностей власними структурними генами, яке може бути, в разі потреби, генетично змінене таким чином, що природне регулювання виключається, а генна експресія підвищується. Переважний конструкт нуклеїнових кислот містить також одну або кілька так званих енхансерних послідовностей, функціонально зв'язаних з промотором, які сприяють підвищенню експресії послідовності нуклеїнових кислот. Крім того на 3'-кінці послідовності ДНК можуть бути вставлені додаткові переважні послідовності, такі як додаткові регуляторні елементи або термінатори. Нуклеїнові кислоти можуть входити до складу конструкту у вигляді однієї або кількох копій. В конструкті можуть також бути присутні інші маркери, такі як резистентність по відношенню до антибіотиків або гени ауксотрофії, в разі потреби, для селекцію в конструкті. Переважні для одержання регуляторні послідовності містяться, наприклад, у промоторах, таких як cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, Ipp-lac-, Iaclq-T7-, Т5-, Т3-, gal-, trc-, аrа-, rhaP (rhaPBAD) SP6-, lambda-PR- чи imlambda-P-промотори, які вигідно використовують у грам-негативних бактеріях. Інші корисні регуляторні послідовності наявні, наприклад, у грам-позитивних промоторах ату та SP02, в дріжджових або грибкових промоторах ADC1, MFalpha, AC, Р-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Крім того для регуляції можуть бути використані також штучні промотори. Конструкт нуклеїнових кислот для експресії у організмі-хазяїні вигідним чином вставляють у вектор, наприклад, плазміду або фаг, який сприяє оптимальній генній експресії у організмі-хазяїні. Під векторами окрім плазмідів та фагів розуміють також всі інші відомі фахівцям вектори, наприклад, 12 віруси, такі як SV40, CMV, бакуловірус та аденовірус, транспосони, IS-елементи, фазміди, косміди та лінійні або циркулярні ДНК, а також система Agrobacterium. Ці вектори можуть бути автономно репліковані в організмі-хазяїні або хромосомно репліковані. Придатними плазмідами, є, наприклад, в £ coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, рКС30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-Ill"3-B1, tgt11 або pBdCI, в Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 або plJ361, в Bacillus pUB110, pC194 або pBD214, в корінобактеріях pSA77 або pAJ667, у грибках pALS1, plL2 або рВВ116, у дріжджах 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 або pEMBL Ye23, або в рослинах pLGV23,pGHIac+, pBIN19, pAK2004 або pDH51. Зазначені плазміди представляють малу груп у можливих плазмідів. Інші плазміни відомі фа хівцям та можуть бути взяті, наприклад, із книжки Cloning Vectors [Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018]. Переважно конструкт нуклеїнових кислот для експресії інших генів додатково містить також 3'та/або 5'-термінальні регуляторні послідовності для прискорення експресії, які залежно від організму-хазяїна та гену або генів вибирають для оптимальної експресії. Ці регуляторні послідовності повинні сприяти цільовій експресії генів та експресії білків. Залежно від організму-хазяїна це має означати, що ген лише після індукції піддають експресії або надекспресії або ген відразу піддають експресії та/або надекспресії. Регуляторні послідовності або фактори можуть при цьому позитивно впливати на генну експресію вставлених генів і таким чином підвищувати її. Так, наприклад, підсилення регуляторних елементів, переважно, на транскрипційному рівні може відбуватися завдяки використанню сильних транскрипційних сигналів, таких як промотори та/або "енхансери". Поряд з цим можливим є також підсилення трансляції, наприклад, завдяки покращенню стабільності мРНК. Відповідно до іншої форми виконання вектора вектор, що містить конструкт нуклеїнових кислот або саму нуклеїнову кислоту, переважно у формі лінійної ДНК може бути введений у мікроорганізм та гетерологічною або гомологічною рекомбінацією інтегрований в геном організму-хазяїна. Ця лінійна ДНК може складатися із лінеаризованого вектора, такого як плазміда, або лише із конструкту нуклеїнових кислот або самої нуклеїнової кислоти. Для оптимальної експресії гетерологічних генів в організмах вигідно змінювати послідовності нуклеїнових кислот відповідно до специфічного використання в даному організмі кодонів "codon usage". Використання кодонів може бути легко визначене комп'ютерним аналізом інших відомих генів відповідного організму. Експресійну касету одержують злиттям придатного промотору з придатною послідовністю нуклеїнових кислот, що кодує, а також із термінаторним або поліаденілювальним сигналом. З цією 13 85011 метою використовують звичайні технології рекомбінації та клонування, наприклад такі, що описані в [T. Maniatis, E. F.Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); а також в T. J. Silhavy, M. L Berman, L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) та в Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley lnterscience (1987)]. Рекомбінантний конструкт нуклеїнових кислот або генний конструкт для експресії у придатному організмі-хазяїні вставляють переважно у специфічний для хазяїна вектор, який обумовлює оптимальну експресію гену в організмі-хазяїні. Такі вектори відомі фахівцям та можуть бути взяті, наприклад, з "Cloning Vectors" [Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985]. За допомогою векторів можуть бути одержані рекомбінантні мікроорганізми, які, наприклад, трансформуються щонайменше одним вектором та можуть бути використані для виробництва гідрофобінів або їх похідних згідно з винаходом. Переважно описані вище рекомбінантні конструкти вводять у придатну систему хазяїна та піддають експресії. При цьому використовують переважно відомі фа хівцям звичайні методи клонування та трансфекції, такі як, наприклад, співосадження, злиття протопластів, електропорація, ретровірусна трансфекція і т.п., з метою введення названих нуклеїнових кислот у відповідну експресійну систему для експресії. Придатні системи описані, наприклад, в [Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley lnterscience, New York 1997, або Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2. AuIl, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. Крім того можуть бути одержані гомологічно рекомбіновані мікроорганізми. З цією метою одержують вектор, який містить щонайменше один фрагмент використовуваного гену або одну послідовність, що кодує, в яку, в разі потреби, введена щонайменше одна амінокислотна делеція, адиція або субституція з метою зміни послідовності, наприклад, з метою функціонального руйнування ("Knockout"-вектор). Введена послідовність може бути, наприклад, гомологом із використаного мікроорганізму або походити із джерела -ссавців, дріжджів або комах. Вектор, використовуваний для гомологічної рекомбінації, альтернативно може бути виконаний таким чином що ендогенний ген при гомологічній рекомбінації піддається мутації або іншим змінам, однак при цьому все ще кодує функціональний білок (наприклад, регуляторна зона, розміщена проти течії, може бути змінена таким чином, що при цьому змінюється експресія ендогенного білка). Змінений відрізок використовуваного згідно з винаходом гену знаходиться у гомологічному рекомбінаторному векторі. Конструкція векторів, придатних для гомологічної рекомбінації, описана, наприклад, у [Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503]. 14 Як рекомбінантні організми-хазяїни для таких нуклеїнових кислот або таких конструктів нуклеїнових кислот можуть бути використані загалом усі прокаріоти або еукаріоти. Переважно як організмихазяїни використовують мікроорганізми, такі як бактерії, грибки або дріжджі. Вигідним є використання грам-позитивних або грам-негативних бактерій, переважно бактерій із родини Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae або Nocardiaceae, особливо переважно бактерій роду Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium або Rhodococcus. Організми, які використовують у описаному вище способі одержання злитих білків, вирощують або культивують відомими фахівцям способами залежно від організму-хазяїна. Мікроорганізми, як правило, вирощують у рідкому середовищі що містить джерело вуглецю здебільшого у формі цукру, джерело азоту здебільшого у формі органічних джерел азоту, таких як дріжджевий екстракт або солей, такі як сульфат амонію, слідові елементи, такі як солі заліза, марганцю та магнію; а також, в разі потреби, вітаміни, при температурі від 0 до 100°C, переважно від 10 до 60°С, в атмосфері кисню. При цьому значення рН живильної рідини можна тримати сталим, що означає, що в процесі культивації значення рН може бути регульованим або не регульованим. Культивацію можна здійснювати періодично, напівперіодично або безперервно. Живильні речовини можна ввести на початку ферментації або напівбезперервно чи безперервно додавати в ході реакції. Ферменти можуть бути виділені з організмів описаним у прикладах способом або використані для реакції у вигляді сирого екстракту. Використовувані згідно з винаходом гідрофобіни або їх функціональні біологічно активні фрагменти можуть бути одержані способом рекомбініатного одержання, причому культивують мікроорганізм, що продукує поліпептид, в разі потреби, індукують експресію білків, після чого останні виділяють із культури. Таким чином, в разі потреби, білки можуть бути одержані у великих промислових масштабах. Рекомбініантний мікроорганізм може бути культивований та ферментований відомими способами. Бактерії можуть розмножуватися, наприклад, у TB- або LB-середовищі при температурі від 20 до 40°C та значенні рН від 6 до 9. Зокрема придатні умови культивації описані, наприклад, у [T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Якщо білки не виділяються у культиваційне середовище, то клітини розкривають та із лізату одержують продукт відомими способами виділення. Клітини можуть бути розкриті на вибір шляхом високочастотного ультразвуку, високого тиску, наприклад, у французькій комірці, що працює під високим тиском, осмолізом, під дією детергентів, за допомогою літичних ферментів або органічних розчинників, гомогенізаторів або комбінації кількох із описаних способів. 15 85011 Очищення білків можна здійснювати відомим хроматографічними способами, таким як молекулярно-ситова хроматографія (гель-фільтрація), хроматографія на Q-сефарозі, іонообмінна хроматографія та гідрофобна хроматографія, а також іншими звичайними способами, такими як ультрафільтрація, кристалізація, висолювання, діаліз та натуральний гель-електрофорез. Придатні способи описані, наприклад, у [Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York oderin Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]. Особливо вигідним для полегшення виділення та очищення може бути оснащення злитих гідрофобінів спеціальних якірних групами, що можуть зв'язуватись із відповідними комплементарними групами твердих носіїв, зокрема з придатними полімерами. Такі тверді носії можуть бути використані, наприклад, як наповнювачі для хроматографічних колонок, і таким чином можна значно підвищува ти ефективність розділення. Такі способи розділення відомі як афінна хроматографія. Для вбудовування якірних груп при одержанні білків можуть бути використані векторні системи олігонуклеотиди, які продовжують кДНК на певну кількість нуклеотидних послідовностей і таким чином кодують змінені білки або злиті білки. Для полегшення очищення модифіковані білки включають використовувані як якірні групи так звані мітки, такі як, наприклад, модифікація, відома як гексагістидиновий якір. Модифіковані гістидиновими якорями злиті гідрофобіни можуть бути очищені, наприклад, з використанням нікель-сефарози як наповнювача для колонки. Крім того злитий гідрофобін може бути елюйований із колонки за допомогою придатного елюенту, наприклад, розчину імідазолу. При здійсненні спрощеного способу очищення можна відмовитись від хроматографічного очищення. Для цього клітини спочатку виділяють із ферментативного бульйону з використанням придатного методу, наприклад, шляхом мікрофільтрації або центрифугування. Потім клітини можуть бути розкриті за допомогою придатних методів, наприклад, за допомогою описаних вище методів, після чого фрагменти клітин відділяють від тілецьвключень. Останнє може здійснювати центрифугуванням. Потім тільця-включення можуть бути розкриті відомими методами з метою вивільнення злитих гідрофобінів. Це можна здійснювати, наприклад, за допомогою кислот, основ та/або детергентів. Тільця-включення, що містять використовувані згідно з винаходом злиті протеїни, можуть бути повністю розкриті, як правило, при використанні 0,1M NaOH протягом приблизно 1 години. Чистота одержаних таким способом злитих гідрофобінів становить, як правило, від 60 до 80ваг.% відносно кількості всіх білків. Розчини, одержані описаним вище спрощеним способом очищення, можуть бути без подальшого очищення використані для реалізації даного винаходу. Одержані описаним вище способом гідрофобіни можуть бути використані безпосередньо як зли 16 ті білки або після розщеплення та відділення партнеру злиття як "чисті" гідрофобіни. Якщо відділення партнеру злиття є передбаченим, то рекомендують вбудовувати у злитий білок можливе місце розділення (специфічне місце розпізнавання для протеаз) між частиною гідрофобіну та частиною партнеру злиття. Як місце розділення особливо придатними є такі пептидні послідовності, які не зустрічаються ані у частині гідрофобіну, ані у частині партнеру злиття, що легко визначається біоінформативними засобами. Особливо придатними є, наприклад, розщеплення на метіонін під дією BrCN або опосередковане протеазою розщеплення під дією фактору Xa, ентерокінази, тромбіну, TEV (протеази вірусу Tobacca etch), і т.д.). Згідно з винаходом гідрофобіни або їх похідні можуть бути можуть бути використані для покращення розділення фаз у композиціях, що містять щонайменше дві рідкі фази. При цьому мова може йти про будь-які композиції, доки вони містять щонайменше дві рідкі фази. Зокрема мова може йти про композиції, які перед додаванням щонайменше одного гідрофобіну або його похідної існували у формі емульсії. При цьому в рамках даного винаходу композиції окрім щонайменше двох рідких фаз може містити також інші фази. Під щонайменше двома рідкими фазами мають на увазі дві рідкі фази різної густини, наприклад, масло та воду, два водних розчини різної густини, паливо та воду, пальні матеріали та воду або розчинник та воду. При цьому під водним розчином в рамках даного винаходу розуміють розчини, що містять воду, в разі потреби, у комбінації з іншим розчинником. Кожна з рідких фаз може при цьому в раках винаходу містити інші речовини. Згідно з винаходом під маслом розуміють сиру нафту. Придатними розчинниками є всі рідини, які утворюють двофазні суміші з водою, зокрема органічні розчинники, наприклад, етери, ароматичні сполуки, такі як толуол або бензол, спирти, алкани, алкени, циклоалкани, циклоалкени, естери, кетони, нафтени або галогеновані вуглеводні. Тому відповідно до іншої форми виконання даний винахід стосується описаного вище застосування щонайменше одного гідрофобіну або щонайменше однієї його похідної, причому композицію, що містить щонайменше дві рідкі фази, вибирають із такої групи: - композиції, що містять масло, переважно сиру нафту, та воду, - композиції, що містять пальне або паливні матеріали та воду, - реакційні суміші, що містять щонайменше дві рідкі фази. В рамках даного винаходу композиції може містити і інші фази, наприклад, тверду або рідку фазу, зокрема тверду фазу. Гідрофобіни або їх похідні згідно з винаходом можуть бути використані для всіх відомих фахівцям цілей. Зокрема в рамках винаходу їх використовують як деемульгатор у сумішах бензин/вода, як деемульгатор в інших сумішах пальне або па 17 85011 ливний матеріал/вода, для розділення фаз при здійсненні хімічних реакцій, зокрема у промислових масштабах, для розщеплення емульсій на сиру нафту та воду в процесі видобування або одержання нафти, а також для знесолення сирої нафти екстрагуванням сирої нафти водою та подальшим розщепленням одержаної емульсії. Як хімічні процеси у великих промислових масштабах використовують всі зазначені процеси, при здійсненні яких необхідно досягти розділення фаз, наприклад, гідроформілювання поліізобутенів на кобальтових каталізаторах, причому виділення каталізатору здійснюють у воді. Гідрофобіни або їх похідні згідно з винаходом використовують також для покращення розділення фаз композицій, що містять щонайменше дві рідкі фази, які зустрічаються в ході реакції, тобто які утворюються в ході реакції або внаслідок додавання розчинника або іншого компонента. Застосування гідрофобінів або їх похідних згідно з винаходом сприяє скороченню часу розділення фаз, а втрата цінних речовин може бути обмежена. Крім того згідно з винаходом можливим є також покращення процесу розділення фаз композицій, що містять щонайменше дві водні фази різної густини, причому під водною фазою розуміють фазу, що містить воду, в разі потреби, у комбінації з іншим розчинником. Згідно з винаходом гідрофобіни або їх по хідні можуть бути використані, наприклад, для покращення процесу розділення фаз при фракціонуванні полімерів у водних системах. При цьому фракціонують зокрема розчинні у воді полімери. Загалом використовують всі відомі фахівцям розчинні у воді та маслі полімери, зокрема полі акрилати та їх співполімери, молекулярно-масовий розподіл або полідисперсність яких становить понад 1,1. Емульсії можуть бути розбиті шляхом додавання деемульгаторів. Так, наприклад, видобута нафта існує, як правило, у вигляді відносно стабільної емульсії типу вода-у-маслі, які залежно від виду родовища може містити до 90ваг.% води. При переробці та очищенні сирої нафти після виділення більшої частини води в осад випадає нафта, яка містить ще приблизно від 2 до 3ваг.% води. Разом з нафтою вона утворює стабільну емульсію, яку неможливо повністю виділити навіть центрифугуванням та додаванням звичайних деемульгаторів. Це є проблематичним, оскільки вода з одного боку характеризується високим вмістом солей і таким чином сприяє корозії, а з іншого боку залишкова вода збільшує об'єм речовини при транспортуванні та зберіганні, що пов'язано з підвищенням витрат. Згідно з винаходом з'ясували, що гідрофобіни або їх похідні можуть бути особливо вигідно застосовані для покращення процесу розділення фаз в таких композиціях. В даному випадку розділення досягається дуже швидко. З метою досягнення оптимальної дії деемульгатор необхідно вибирати з урахуванням виду емульгованих масел та жирів, а також беручи до уваги, в разі потреби, наявні емульгатори та поверхнево-активні речовини. Розбиття емульсій додатково можна вигідно здійснювати при підвищеній 18 температурі, наприклад, від 0 до 100°C, переважно від 10 до 80°C, зокрема від 20 до 60°C. Інші можливості застосування згідно з винаходом включають, наприклад, деемульгування просочених емульсій при виготовленні ДСП та в текстильній промисловості, а також емульсій лікарських речовин. Ще однією можливістю застосування є розділення емульсій органічно оброблених відпрацьованих вод, наприклад, промислових стічних вод, зокрема одержаних внаслідок обробки металу, наприклад, змащувальноохолоджувальних рідин при обробці металів, у шкіряній промисловості та на нафтоочисних заводах, а також із природних джерел, в яких утворюються емульсії на основі масла та води. Такі стічні води одержують, наприклад, при переробці нафти на нафтоочисних заводах та в нафто хімічних установках. Перед завантаженням таких вод у очисні пристрої необхідно відділити масляні залишки, які часто існують у формі емульсії. Ще одна можливість застосування полягає у розділенні емульсій типу масло-у-воді або вода-умаслі, які використовували як змащувальноохолоджувальні рідини та які підлягають рециклюванню. Суміші води та масла також осаджуються, наприклад, на борту кораблів як трюмна вода. При цьому розділення емульсій є необхідним з метою відділення води та зменшення кількості розчинника, який необхідно видалити. Кількість використовуваного гідрофобіну або його похідної можна варіювати у широкому діапазоні, причому кількість переважно залежить від самої композиції та компонентів, що входять до її складу. Якщо композиція містить, наприклад, речовини, які уповільнюють або погіршують розділення щонайменше двох рідких фаз, наприклад, поверхнево-активні речовини або емульгатори, то переважно використовують більшу кількість гідрофобіну або його похідної. Оскільки масла, переважно сира нафта, складаються із суміші багатьох хімічних сполук, то через різний хімічний склад масла, водної та сольової частини, а також конкретних умов розділення емульсії, таких як температура, тривалість розділення, вид введення та взаємодія з іншими компонентами суміші, вид емульгатора необхідно узгоджувати з конкретними умовами. Несподівано з'ясували, що вже незначні кількості гідрофобіну або його похідної сприяють покращенню процесу розділення фаз. Щонайменше один гідрофобін або його похідну згідно з винаходом можна використовувати у будь-якій придатній кількості. Як правило, щонайменше один гідрофобін або його похідну використовують у кількості від 0,0001 до 1000м.ч. у перерахунку на всю композицію, переважно у кількості від 0,001 до 500м.ч., особливо переважно від 0,01 до 200м.ч. або від 0,01 до 100м.ч. та найбільш переважно від 0,1 до 50м.ч.. В рамках даного винаходу показник м.ч. означає мг на кг. Таким чином даний винахід відповідно до іншої форми виконання стосується описаного вище застосування, причому щонайменше один гідро 19 85011 фобін або щонайменше одну його похідну використовують у кількості від 0,0001 до 1000м.ч., у перерахунку на всю композицію. Необхідну концентрацію фахівці визначають залежно від виду композиції, що підлягає деемульгуванню. Якщо у випадку композиції мають на увазі композицію, що містить пальне або паливні матеріали та воду, то гідрофобін або його похідну використовують, як правило, у кількості від 0,001 до 10м.ч., переважно від 0,005 до 2м.ч., зокрема від 0,01 до 1м.ч., особливо переважно від 0,05 до 0,5м.ч. та найбільш переважно від 0,01 до 0,1м.ч.. Якщо у випадку композиції мають на увазі композицію, що містить сиру нафту та воду, то гідрофобін або його похідну використовують, як правило, у кількості від 1 до 1000м.ч., переважно від 1 до 800м.ч., зокрема від 5 до 500м.ч., особливо переважно від 10 до 200м.ч. та найбільш переважно від 15 до 100м.ч., наприклад, від 20 до 50м.ч.. Якщо у випадку композиції мають на увазі композицію, що містить дві водні фази різної густини, які можуть бути утворені, наприклад, при фракціонуванні розчинних у воді полімерів, то гідрофобін або його похідну використовують, як правило, у кількості 1 до 1000м.ч., переважно від 1 до 500м.ч., зокрема від 5 до 250м.ч., особливо переважно від 10 до 200м.ч. та найбільш переважно від 15 до 100м.ч.. Згідно з винаходом композиція окрім щонайменше одного гідрофобіну або його похідної може містити також інші сполуки, що покращують процес розділення фаз. При цьому мова може йти про всі сполуки, які, як відомо фахівцям, використовують для таких цілей. Додатковими сполуками, придатними для покращення процесу розділення фаз, є зокрема сполуки, використовувані як агенти розщеплення емульсій при видобуванні сирої нафти, такі як оксиалкільовані фенолформальдегідні смоли, блокспівполімери EO та ПО, з шиті діепоксиди, поліаміди або їх алкоксиляти, солі сульфонових кислот, етоксильовані жирні аміни, сукцинати, а також описані в [DE 10 2005 006 030.7] для таких цілей сполуки. Таким чином даний винахід відповідно до іншої форми виконання стосується описаного вище застосування, причому поряд із щонайменше одним гідрофобіном або щонайменше однією його похідною використовують також щонайменше одну іншу сполуку, яка покращує процес розділення фаз. Відповідно до іншого аспекту даний винахід стосується також способу розділення щонайменше двох рідких фаз у композиції, що містить щонайменше дві рідкі фази, включаючи додавання щонайменше одного гідрофобіну або щонайменше однієї його похідної у композицію. При цьому під композицію розуміють описану вище композицію, що містить щонайменше дві рідкі фази. Відповідно до ще однієї переважної форми виконання даний винахід стосується такого способу, причому композицію, що містить щонайменше дві рідкі фази, вибирають із такої групи: 20 - композиції, що містять масло, переважно сиру нафту, та воду, - композиції, що містять пальне або паливні матеріали та воду, - реакційні суміші, що містять щонайменше дві рідкі фази. Загалом в рамках даного винаходу гідрофобіни або їх похідні можуть бути використані у будьяких кількостях, які сприяють покращенню процесу розділення фаз. Зокрема гідрофобін або його похідну використовують у кількості від 0,0001 до 1000м.ч., у перерахунку на всю композицію. Крім того винахід стосується також описаного вище способу, причому щонайменше один гідрофобін або щонайменше одну його похідну використовують у кількості від 0,0001 до 1000м.ч., у перерахунку на всю композицію. Переважні кількості для відповідних систем були зазначені вище. Спосіб згідно з винаходом може також включати інші стадії, наприклад, такі, що покращують процес розділення фаз або розбиття емульсій. При цьому мова може йти про підвищення температури або центрифугування. Таку стадію можна здійснювати до, під час або після додавання щонайменше одного гідрофобіну або його похідної. Відповідно до ще однієї переважної форми виконання даний винахід стосується такого способу, причому спосіб до або після додавання щонайменше одного гідрофобіну або щонайменше однієї його похідної включає підвищення температури композиції, що містить щонайменше дві рідкі фази. Згідно з винаходом додають гідрофобіни або їх по хідні, наприклад, рецептури, що містять пальне або паливні матеріали. При контакті композиції з водою це сприяє швидкому розшаруванню або запобігає утворенню емульсій. Утворення емульсій, наприклад, у резервуарах для зберігання, потребує здійснення додаткових витратних стадій очищення композиції. Крім того у сиру нафту переважно додають гідрофобіни або їх похідні, наприклад, з метою запобігання утворенню емульсії. Рецептура, що містить пальне або паливні матеріали, в рамках даного винаходу може містити також інші добавки, які зазвичай входять до складу таких композицій. Придатні добавки описані, наприклад, в [WO 2004/087808]. Тому даний винахід стосується також рецептури, що містить щонайменше одну сполуку, вибрану із групи, яка включає пальне, паливні матеріали, сиру нафту або розчинні у воді чи маслі полімерні розчини та щонайменше один гідрофобін або його похідну. Кількість використовуваного гідрофобіну або його похідної можна варіювати залежно від інших добавок, доки гарантується покращення процесу розділення фаз при контакті рецептури з водою. Згідно з винаходом кількість використовуваного гідрофобіну або його похідної становить від 0,0001 до 1000м.ч., переважно від 0,001 до 500м.ч., особливо переважно від 0,01 до 100м.ч.. Таким чином даний винахід стосується описаної вище рецептури, що містить гідрофобін або 21 85011 його похідну у кількості від 0,0001 до 1000м.ч., у перерахунку на всю рецептур у. Якщо у випадку рецептури мають на увазі суміш, що містить сиру нафту, то гідрофобін або його похідну використовують у цій рецептурі, як правило, у кількості від 1 до 1000м.ч., переважно від 10 до 800м.ч., зокрема від 10 до 500м.ч.. Якщо у випадку рецептури мають на увазі суміш, що містить пальне або паливні матеріали, то гідрофобін або його похідну використовують у цій рецептурі, як правило, у кількості 0,001 до 0,5м.ч., переважно від 0,005 до 0,3м.ч., зокрема від 0,01 до 0,2м.ч.. Таким чином даний винахід відповідно до ще однієї форми виконання стосується описаної вище рецептури, причому рецептура містить щонайменше одне пальне або паливний матеріал та гідрофобін або його похідну у кількості від 0,001 до 0,5м.ч., у перерахунку на всю рецептур у. В рамках даного винаходу під паливними матеріалами мають на увазі, наприклад, легке, середнє або важке рідке паливо. В рамках даного винаходу під пальним розуміють, наприклад, бензин, дизельне пальне або газотурбінне пальне. Особливу перевагу надають бензину. Пальне може містити інші добавки. Звичайні добавки загалом відомі фахівцям. Придатні добавки та розчинники описані, наприклад, в [WO 2004/087808]. Згідно з винаходом придатними добавками є, наприклад, добавки, що проявляють активність детергентів та/або уповільнюють зношування клапанів (надалі позначені детергентні присадки). Така детергентна присадка містить щонайменше один гідрофобний вуглеводневий залишок, середньочисельна молекулярна вага Mn якої становить від 85 до 20 000г/моль, та щонайменше одну полярну груп у, вибрану із таких сполук: (a) моно- або поліаміногрупи, що містять до 6 атомів азоту, причому щонайменше один атом азоту проявляє основні властивості; (b) нітрогрупи, в разі потреби, у комбінації з гідроксильними групами; (c) гідроксильні групи у комбінації з моно- або поліаміногрупами, причому щонайменше один атом азоту проявляє основні властивості; (d) карбоксильні групи або їх солі з лужними або лужноземельними металами; (e) групи суль фонових кислот або їх солі з лужними або лужноземельними металами; (f) поліокси-С 2-С4-алкіленові групи, що на кінці містять гідроксильні групи, моно-або поліаміногрупи, причому щонайменше один атом азоту проявляє основні властивості, або карбаматні групи; (g) групи естерів карбонових кислот; (h) похідні від ангідриду бурштинової кислоти групи у комбінації з гідрокси- та/або аміно- та/або амідо- та/або імідогрупами; та/або (і) групи, одержані реакцією Манніха заміщених фенолів з альдегідами та моно- або поліамінами. Середньочисельна молекулярна вага (Mn) гідрофобного вуглеводневого залишку, що входить до складу згаданих вище детергентних добавок та 22 контролює достатню розчинність у пальному, становить від 85 до 20000, зокрема від 113 до 10000, передусім від 300 до 5000. Типовим гідрофобним вуглеводневим залишком, зокрема у комбінації з полярними групами (а), (с), (h) та (і), є залишок поліпропенілу, полібутенілу та поліізобутенілу, Mn якого становить відповідно від 300 до 5000, зокрема від 500 до 2500, передусім від 700 до 2300. Прикладами згаданих ви ще гр уп детергентних присадок є такі: Присадки, що містять моно- або поліаміногрупи (а), представляють собою переважно поліалкенмоно- або поліаленполіаміни на основі поліпропену або звичайного (тобто такого, що подвійні зв'язки якого знаходяться переважно посередині) полібутену або поліізобутену, Mn якого становить від 300 до 5000г/моль. Якщо при одержанні присадок виходять із полібутену або поліізобутену, подвійні зв'язки якого знаходяться переважно посередині (здебільшого у бета- та гама-положенні), то при цьому використовують хлорування та подальше амінування або окислення подвійного зв'язку повітрям або озоном до одержання карбонільних або карбоксильних сполук та подальше амінування у відновлювальних умовах. Для здійснення амінування можуть бути використані аміни, такі як, наприклад, аміак, моноаміни або поліаміни, такі як диметиламінопропіламін, етилендіамін, діетилентриамін, триетилентетрамін або тетраетиленпентамін. Відповідні присадки на основі поліпропену описані зокрема в [WO 94/24231]. Іншими переважними присадками, що містять моноаміногрупи (а), є продукти гідрування продуктів взаємодії поліізобутенів, ступінь полімеризації P яких становить від 5 до 100, та оксидів азоту або сумішей оксидів азоту та кисню, що зокрема описані в [WO 97/03946]. Іншими переважними присадками, що містять моноаміногрупи (а), є сполуки, одержані із епоксидів поліізобутену взаємодією з амінами та подальшою дегідратацією або відновленням аміноспиртів, описані зокрема в [DE-A 196 20 262]. Присадками, що містять нітрогрупи (b), в разі потреби, у комбінації з гідроксильними групами, є переважно продукти взаємодії поліізобутенів, ступінь полімеризації P яких становить від 5 до 100 або від 10 до 100, та оксидів азоту або сумішей оксидів азоту та кисню, що описані зокрема в [WO 96/03367 та WO 96/03479]. Ці продукти взаємодії, як правило, представляють собою суміші чистих нітрополіізобутенів (наприклад, альфа-, бетадинітрополіізобутен) та змішаних гідроксинітрополіізобутенів (наприклад, альфа-нітро-бетагідроксиполіізобутен). Присадки, що містять гідроксильні групи у комбінації з моно- або поліаміногрупами (с), представляють собою зокрема продукти взаємодії епоксидів поліізобутену, одержаних переважно із поліізобутену, що містить переважно кінцеві подвійні зв'язки, Mn якого становить від 300 до 5000, та аміаку, моно- або поліамінів, описані зокрема в [EP-A 0 476 485]. Присадки, що містять карбоксильні групи або солі цих груп та лужних або лужноземельних ме 23 85011 талів (d), представляють собою переважно співполімери C2-C40-олефінів та малеїнового ангідриду, загальна молярна маса яких становить від 500 до 20000, карбоксильні групи яких повністю абр частково перетворені на солі лужних або лужноземельних металів, а залишок карбоксильних груп піддають взаємодії зі спиртами та або амінами. Такі присадки відомі зокрема з [EP-A 0 307 815]. Такі присадки загалом використовують для запобігання зношуванню клапанів, вони можуть, як описано в [WO 87/01126], бути вигідно використані у комбінації зі звичайними паливними детергентами, такими як полі(ізо)бутенаміни або поліетераміни. Присадки, що містять групи сульфонових кислот або їх солі з лужними або лужноземельними металами (e), переважно представляють собою солі лужних або лужноземельних металів та алілового естеру сульфобурштинової кислоти, описані зокрема в [EP-A 0 639 632]. Такі присадки використовують в основному для запобігання зношуванню клапанів, вони можуть бути вигідно використані у комбінації зі звичайними паливними детергентами, такими як полі(ізо)бутенаміни або поліетераміни. Присадки, що містять поліокси-С 2-С4алкіленові групи (f), переважно представляють собою поліетери або поліетераміни, одержані взаємодією С 2-С60-алканолів, C6-C30-алкандіолів, моноабо ді-С2-С30-алкіламінів, С1-С30алкілциклогексанолів або C1-C30-алкілфенолів та від 1 до 30моль етиленоксиду та/або пропілен оксиду та/або бутилен оксиду на гідроксильну групу або аміногрупу, а у випадку поліетерамінів - подальшим відновлювальним амінуванням аміаком, моноамінами або поліамінами. Такі продукти описані зокрема в [EP-A 0 310 875, EP-A 0 356 725, EP-A 0 700 985 та US 4,877,416]. У випадку поліетерів такі продукти проявляють також властивості масел-носіїв. Типовими прикладами є тридеканолабо ізотридеканолбутоксилати, а також поліізобутенолбутоксилати та -пропоксилати, а також відповідні продукти взаємодії з аміаком. Присадками, що містять групи естерів карбонових кислот (g), є переважно естери моно-, диабо три карбонових кислот та довголанцюгових алканолів або поліолів, зокрема такі, мінімальна в'язкість яких становить 2мм 2/с при 100°C, описані, наприклад, в [DE-A 38 38 918]. Як моно-, ди- або три карбонові кислоти можуть бути використані аліфатичні або ароматичні кислоти, як естери спиртів або поліолів придатними є передусім довголанцюгові представники, що містять, наприклад, від 6 до 24 атомів вуглецю. Типовими представниками естерів є адипати, фталати, ізофталати, терефталати та тримелітати ізооктанолу, ізононанолу, ізодеканолу та ізотридеканолу. Такі продукти мають властивості масел-носіїв. Присадки, що містять похідні від ангідриду бурштинової кислоти групи у комбінації з гідроксита/або аміно- та/або амідо- та/або імідогрупами (h), переважно представляють собою відповідні похідні ангідриду поліізобутенілбурштинової кислоти, одержані взаємодією звичайних або високоактивних поліізобутенів, Mn яких становить від 300 до 5000, та малеїнового ангідриду термічним спо 24 собом або через хлорований поліізобутен. Особливий інтерес представляють при цьому похідні аліфатичних поліамінів, такі як етилендіамін, діетилентриамін, триетилентетрамін або тетраетиленпентамін. Такі присадки до бензину описані зокрема в [US 4,849,572]. Присадки, що містять групи (і), одержані реакцією Манніха заміщених фенолів з альдегідами та моно- або поліамінами, представляють собою переважно продукти взаємодії поліізобутензаміщених фенолів з формальдегідом та моно- або поліамінами, такими як етилендіамін, діетилентриамін, триетилентетрамін, тетраетиленпентамін або диметиламінпропіламін. Поліізобутензаміщені феноли можуть бути одержані зі звичайних або високоактивних поліізобутенів, Mn яких становить від 300 до 5000. Такі "поліізобутенові основи Манніха" описані зокрема в [EP-AO 831 141]. Для точного визначення окремих присадок бензину в даній заявці посилаються на згадані вище документи рівня техніки. При цьому зазначені присадки використовують кількостях, як на думку фахі вців є придатними для відповідних цілей застосування. Крім того рецептури згідно з винаходом можуть бути комбіновані також з іншими звичайними компонентами та добавками. В даному випадку слід назвати, наприклад, масла-носії без вираженої детергентної дії. Придатними мінеральними маслами-носіями є фракції, що утворюються при переробці нафти, такі як Brightstock, або базова нафта із в'язкістю, наприклад, з класу SN 500-2000; а також ароматичні вуглеводні, парафінові вуглеводні та алкоксиспирти. Також придатним згідно з винаходом є відомий як "hydrocrack oil" продукт гідрокрекінгу нафти, а саме така фракція, що утворюється при рафінуванні нафти (фракція після вакуумної перегонки з інтервалом кипіння від приблизно 360 до 500°C, яку одержують із природної нафти шляхом каталітичного гідрування під високим тиском та ізомеризації, а також видалення парафінів). Придатними є також суміші зазначених ви ще мінеральних масел-носіїв. Прикладами придатних для застосування згідно з винаходом синтетичних масел-носіїв є такі вибрані масла: поліолефіни (поліальфаолефіни або внутрішні поліолефіни), (полі)естери, (полі)алкоксиляти, поліетери, аліфатичні поліетераміни, алкілфенол-ініційовані поліетери, алкілфенол-ініційовані поліетераміни та естери карбонових кислот та довголанцюгових спиртів. Прикладами придатних поліолефінів є продукти полімеризації олефінів, Mn яких становить від 400 до 1800, передусім на основі полібутену або поліізобутену (гідровані або негідровані). Прикладами придатних поліетерів або поліетерамінів є переважно сполуки, що містять поліокси-С2-С4-алкіленові групи, одержані взаємодією С2-С60-алканолів, C6-C30-алкандіолів, моно- або діС2-С30-алкіламінів, С1-С30-алкілциклогексанолів або С1-С30-алкілфенолів та від 1 до 30молей етиленоксиду та/або пропілен оксиду на гідроксильну груп у або аміногрупу, а у випадку поліетерамінів подальшим відновлювальним амінуванням аміа 25 85011 ком, моноамінами або поліамінами. Такі продукти описані зокрема в [EP-A 0 310 875, EP-A 0 356 725, EP-A 0 700 985 та US 4,877,416]. Так, наприклад, як поліетераміни можуть бути використані полі-С 2Сб-алкіленоксидаміни або їх функціональні похідні. Типовими прикладами є тридеканол- або ізотридеканолбутоксилати, ізононілфенолбутоксилати, а також поліізобутенолбутоксилати та пропоксилати, а також відповідні продукти взаємодії з аміаком. Прикладами естерів карбонових кислот та довголанцюгових алканолів є зокрема естери моно-, ди- або три карбонових кислот та довголанцюгових алканолів або поліолів, описані зокрема в [DEA 38 38 918]. Як моно-, ди- або три карбонові кислоти можуть бути використані аліфатичні або ароматичні кислоти, як естери спритів або поліолів придатними є передусім довголанцюгові представники, що містять, наприклад, від 6 до 24 атомів вуглецю. Типовими представниками естерів є адипати, фталати, ізофталати, терефталати та тримеліти ізооктанолу, ізононанолу, ізодеканолу та ізотридеканолу, такі як, наприклад, ди-(н- або ізотридецил)фталат. Інші придатні системи масел-носіїв описані, наприклад, в [DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DEA 43 09 074, EP-A 0 452 328 та EP-A 0 548 617], на які існують чіткі посилання. Прикладами особливо придатних синтетичних масел-носіїв є ініційовані спиртом поліптери, що містять приблизно від 5 до 35, наприклад, приблизно від 5 до 30, C3-C6-алкіленоксидних одиниць, таких як, наприклад, пропіленоксидні, нбутиленоксидні та ізобутиленоксидні одиниці, або їх сумішей. Прикладами придатних спиртівініціаторів, які в жодному разі не обмежують осяг охорони даного винаходу, є довголанцюгові спирти або заміщені довголанцюговим алкілом феноли, причому довголанцюговий алкільний залишок зокрема представляє собою нерозгалужений або розгалужений С6-С18-алкільний залишок. Переважними прикладами є тридеканол та нонілфенол. Іншими придатними синтетичними масламиносіями є алкоксильовані алкілфеноли, описані в [DE-A 10 102 913.6]. При цьому зазначені масла-носії використовують у кількостях, які фахівці вважають придатних для певних цілей застосування. Іншими звичайнимиприсадками є інгібітори корозії, наприклад, на основі схильних до півкоутворення амонієвих солей органічних карбонових кислот або гетероциклічних ароматичних сполук у випадку захисту від корозії кольорових металів; антиоксиданти або стабілізатори, наприклад, на основі амінів, таких як п-фенілендіамін, дициклогексиламін або їх похідні, або фенолів, таких як 2,4ди-трет-бутилфенол або 3,5-ди-трет-бутил-4гідроксифенілпропіонова кислота; а також звичайні деемульгатори; антистатики; металоцени, такі як ферроцен; трикарбоніл метилциклопентадієнілмарганецю; агенти, що покращують змащувальну здатність (лубриканти), такі як певні жирні кислоти, естери алкенілбурштинової кислоти, біс(гідроксиалкіл)жирні аміни, гідроксиацетатаміди 26 або касторова олія; а також барвники (маркери). В разі потреби, додають також аміни для зниження значення рН пального. Зазначені детергентні присадки, що містять полярні групи (а)-(і) зазвичай додають у пальне у кількості від 10 до 5000ваг.м.ч., зокрема від 50 до 1000ваг.м.ч.. Інші згадані компоненти та присадки, в разі потреби, додають у звичайних для окремого випадку кількостях. Як пальне та паливні матеріали згідно з винаходом придатними є всі відомі фахівцям види пального та паливних матеріалів, наприклад, бензин, описані, наприклад, в [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5 видання, 1990, том А16, стор.719 ін.]. Придатним пальним згідно з винаходом є дизельне пальне, керосин та реактивне пальне. Зокрема придатним є бензин, що містить максимально 60, наприклад, максимально 42об.% ароматичних сполук та максимально 2000, наприклад, максимально 150ваг.м.ч. сірки. Вміст ароматичних сполук у бензин становить, наприклад, від 10 до 50, наприклад, від 30 до 42об.%, зокрема від 32 до 40об.%. Вміст сірки в бензині становить від 2 до 500, наприклад, від 5 до 150ваг.м.ч. або від 10 до 100ваг.м.ч.. Крім того придатний бензин може містити, наприклад, олефін у кількості до 50об.%, наприклад, від 6 до 21об.%, зокрема від 7 до 18об.%; бензол у кількості до 5об.%, наприклад, від 0,5 до 1,0об.%, зокрема від 0,6 до 0,9об.%, та/або кисень у кількості до 25ваг.%, наприклад, до 10ваг.% або від 1,0 до 2,7ваг.%, зокрема від 1,2 до 2,0ваг.%. Зокрема можна назвати такі бензини, які одночасно містять ароматичну сполуку у кількості щонайбільше 38об.%, олефін у кількості щонайбільше 21об.%, сірку у кількості щонайбільше 50ваг.м.ч., бензол у кількості щонайбільше 1,0об.% та кисень у кількості від 1,0 до 2,7ваг.%. Вміст спиртів та етерів у бензині можна варіювати у широкому діапазоні. Прикладом типового максимального вмісту для метанолу є 15об.%, для етанолу -65об.%, для ізопропанолу - 20об.%, для трет-бутанолу - 15об.%, для ізобутанолу -20об.% та для етеру, що містить 5 або більше атомів вуглецю в молекулі, - 30об.%. Літній тиск пари придатного згідно з винаходом бензину становить зазвичай максимум 70кПа, зокрема 60кПа (відповідно при 37°C). ROZ бензину становить, як правило, від 75 до 105. Звичайний діапазон значень для MOZ становить від 65 до 95. Зазначені специфікації визначають звичайними методами (стандарт DIN EN 228). Наведені нижче приклади більш детально пояснюють винахід. Приклади Приклад 1 Підготовчі роботи для клонування yaadHis 6/yaaE-His 6 За допомогою олігонуклеотидів НаІ570 та НаІ571 (HaI572/HaI573) проводять полімеразну цепну реакцію. Як темплати використовують геномні ДНК Bakteriums Bacillus subtilis. Одержаний фрагмент ПЦР містить кодуючу послідовність генів 27 85011 yaaD/уааЕ від Bacillus subtilis, а на кінцях Ncol або BgIII рестриктивні сегменти. Фрагмент ПЦР очищують та розрізають за допомогою рестриктивних ендонуклеаз Ncol та BgIII. Ці фрагменти ДНК використовують як вставки та клонують у лінеаризований за допомогою рестриктивних ендонуклеаз Ncol та BgIII вектор pQE60 фірми Qiagen. Одержані таким чином вектори pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5 можуть бути застосовані для експресії білків, що складаються з YAAD::HIS 6 або відповідно YAAE::HIS 6. НаІ570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga НаІ571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac НаІ572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg НаІ573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc Приклад 2 Клонування yaad-гідрофобіну DewA-HiSg За допомогою олігонуклеотидів HKaM 416 und KaM 417 проводять полімеразну цепну реакцію. Як темплати використовують геномні ДНК плісеневих грибків Aspergillus nidulans. Одержаний фрагмент ПЦР містить послідовність гену dewA, що кодує гідрофобін, та N-термінальний сегмент для розщеплення фактору Xa протеїназою. Фрагмент ПЦР очищують та розрізають за допомогою рестриктивних ендонуклеаз ВаmНІ. Ці фрагменти ДНК використовують як вставку та клонують у лінеарізований за допомогою рестриктивної ендонуклеази BgIII вектор pQE60YAAD#2. Одержаний таким чином вектор #508 може бути застосований для експресії злитих білків, що складаються з YAAD::Xa::dewA::HIS 6. Приклад 3 Клонування yaad-гідрофобіну RodA-His 6 Клонування плазміди #513 відбувається аналогічно клонуванню плазміди #508 з використанням олігонуклеотидів KaM 434 та Ka M 435. Приклад 4 Кпонування yaad- гідрофобіну BASFI-His 6 Клонування плазміди #507 відбувається аналогічно клонуванню плазміди #508 з використанням олігонуклеотидів KaM 417 та Ka M 418. Як темплати ДНК використовують синтетично синтезовану послідовність ДНК -гідрофобін BASF1 (дивись додаток, SEQ ID NO. 11 та 12). Приклад 5 Клонування yaad-гідрофобіну BASF2-His 6 Клонування плазміди #506 відбувається аналогічно клонуванню плазміди #508 з використанням олігонуклеотидів KaM 417 та Ka M 418. Як темплати ДНК використовують синтетично синтезовану послідовність ДНК -гідрофобін BASF2 (дивись додаток, SEQ ID NO. 13 та 14). Приклад 6 28 Клонування yaad- гідрофобіну SC3-His 6 Клонування плазміду #526 відбувалось анологічно до плазміду #508 із використанням олігонуклеотидів KаМ 464 та Kа М 465. Як темплати ДНК використовують кДНК від Schyzophyllum commune (дивись додаток, SEQ ID NO. 9 та 10). Приклад 7 Ферментація рекомбінантних штамів E.coli yaad-гідрофобіну DewA-His 6 Здійснюють інокуляцію 3мл рідкого середовища LB (LB - клерована суміш цукру-сирцю Il кристалізації) з штамом E.coli, що експресує yaad-гідрофобін DewA-His 6, у трубочці Грейнера на 15мл. Інкубують протягом 8 годин при 37°С на струшувані зі швидкістю 200 обертів за хвилину. Кожні 2 колби Ерленмеєра об'ємом 1л із дефлекторами, що містять 250мл LB середовища (+100мкг/мл ампіциліну) відповідно заражають 1мл культури та інкубують протягом 9 годин при 37°C на струшуванні зі швидкістю 180 обертів за хвилину. 13,5л LB-середовища (+100мкг/мл ампіциліну) у 20л ферментаторі заражають 0,5л культури (оптична густина при 600нм 1:10, виміряна відносно H2O). При OD60нм приблизно 3,5 додають 140мл 100мМ розчину IPTG. Через 3 години ферментації ферментативний бульйон охолоджують до 10°C та центрифугують. Клітковий центрифугат використовують для подальшого очищення. Приклад 8 Очищення рекомбінантних гідрофобін-вмісних злитих білків 100 г кліткового центрифугату (100-500мг гідрофобіну) доводять до 200мл буферним натрійфосфа тним розчином (50мМ, рН7,5), та ресуспендують. Суспензію обробляють за допомогою приладу Ultraturrax Тур Т25 (Janke und Kunkel; IKALabortechnik) протягом 10 хвилин та потім інкубують протягом 1 години при кімнатній температурі із 500 одиницями бензонази (Merck, Darmstadt; № замовлення 1.01697.0001) для утворення нуклеїнових кислот. Перед розкриттям клітин суспензію фільтрують на скляній картуші (Р1). Для розкриття та розрізання залишкового геномного ДНК проводять два етапи гомогенізації при 1500бар (мікрофлюїдизатор М-110ЕН; Microfluidics Corp.). Гомогенізат центрифугують (Son/all RC-5B, ротор GSA, центрифузійні резервуари ємкістю 250мл, 60 хвилин, 4°С, 12000 обертів за хвилину, 23000г), залишок поміщають на лід та центрифугат повторно суспендують у 100мл натрій-фосфатного буферу при значенні рН7,5. Центрифугування та повторне суспендування повторюють тричі, причому натрійфосфа тний буферний розчин при третьому повторі містить 1% SDS. Після повторного суспендування суміш перемішують протягом однієї години та проводять заключне центрифугування (Sorvall RC5B, ротор GSA, центрифузійні резервуари ємністю 250мл, 60 хвилин, 4°С, 12.000 обертів за хвилину, 23.000г). Згідно з аналізом SDS-PAGE гідрофобін міститься у рідкій фазі після заключного центрифугування (Фіг.). Дослідження показують, що гідрофобін міститься у відповідних клітинах E. соlі, ймо 29 85011 вірно, у формі включень. 50мл рідкої фази, що містить гідрофобін, наносять на нікель-сефарозну високоефективну колонку об'ємом 50мл 17-526802 (Amersham), яку попередньо урівноважують пропусканням буфер у Tris-CI концентрацією 50мМ при значенні рН8,0. Потім колонку миють буферним розчином Tris-CI концентрацією 50мМ при значенні рН8,0, після чого проводять елюювання гідрофобіну за допомогою буферного розчину TrisCI при значенні рН8,0 та концентрації 50мМ, що містить 200ммоль імідазолу. Для видалення імідазолу здійснюють діаліз розчину проти буферного розчину Tris-CI при значенні рН8,0 та концентрації 50мМ. На Фіг. показане очищення одержаного гидрофобіну: Слід А: нанесення на нікель-сефарозну колонку (розведення 1:10) Слід В: протікання= стадія промивки елюату Сліди C-E: OD 280 максимумів елюйованих фракцій (WP1, WP2, WP3) Слід F показує нанесений маркер. Гідрофобін на Фіг. має молекулярну вагу приблизно 53kD. Маленькі смуги частково репрезентують продукти розщеплення гідрофобіну. Приклад 9 Дослідження застосування: характеризування гідрофобіну за зміною контактного кута при нанесенні краплі води на скло Субстрат: Скло (віконне скло, південно-німецьке скло, Манхайм): Використовують гідрофобін, очищений за прикладом 8. концентрація гідрофобіну у розчині: 100мкг/мл, розчин містить також 50мМ - Na-ацетатного буфер у та 0,1% поліоксиетилен (20)-сорбитан-монолауреату (Tween® 2O)), значення рН розчину: 4 - скляні пластини занурюють в цей розчин протягом ночі (при температурі 80°С), - після цього скляні пластини, покриті гідрофобіном, виймають із розчину та миють дистильованою водою, - потім здійснюють інкубацію пластин протягом 10 хвилин при 80°C у 1-% розчині SDS в дистильованій воді, - здійснюють подальше промивання пластин дистильованою водою. Зразки висушують на повітрі та вимірюють контактний кут пластин, покритих краплиною води (5мкл), при кімнатній температурі. Контактний кут вимірюють на пристрої Contact Angle System OCA 15+, програмне забезпечення SCA 20.2.0. (листопад 2002). Вимірювання здійснюють за рекомендаціями виробника. Контактний кут необробленого скла становив 30±5°; скло, оброблене гідрофобіном згідно з прикладом 8 (yaad-dewA-his 6), має контактний кут змочування 75±5°. ==> Збільшення контактного кута: 45° Приклад 10 Застосування концентрату гідрофобіну (vaadXa-dewA-His 6) як присадки до пального Принцип дослідження: 30 Сучасне пальне містить зазвичай ряд різних присадок (так звані набори присадок). Якщо пальне в ході одержання та збуту вступає у контакт з водою, ці присадки можуть проявляти емульгувальну дію та спричиняти утворення небажаної емульсії пального та води. Тому для запобігання цього ефекту у пальне зазвичай додають деемульгатори. Деемульгування досліджують з використанням концентрату гідрофобіну за прикладом 8 (SEQ ID NO. 19 або 20). Концентрат гідрофобіну розріджують етанолом та додають у наявне у продажу пальне Євросупер (відповідно до EN 228), яке вже містить 725мг/кг спеціального набору присадок А. Цей набір присадок в основному складається із поліізобутенаміну Kеrосоm PIBA, сумішей масел-носіїв, розчинника, інгібітора корозії та модифікатора тертя. Одержують зразки пального, що містять 0,01, 0,03, 0,05, 0,07, 0,14 та 0,28мг/кг гідрофобіну. Як зразок для порівняння (10-V1) використовують пальне, що містить лише присадку А без додавання гідрофобіну. В іншому порівняльному дослідженні (10-V2) використовують 1,45мг/кг наявного у продажу деемульгатора D на основі фенольних смол (ADX 606, фірми Lubrizol). Зразки пального досліджують відповідно згідно зі стандартом DIN 51415. При цьому інтенсивно змішують по 80мл пального та 20мл води. Потім спостерігають різний процес розшарування залежно від часу. Результати оцінюють, керуючись прийнятим як норма стандартом, причому 1 означає дуже ефективне розшарування, а більші числа вказують по постійне погіршення розшарування. Детальна інформація наведена у цитованій нормі стандарту DIN. У таблиці 1 наведені результати досліджень. Вказані показники розділення фаз через 1, 5, 30 та 60 хвилин. Як правило, оцінювання 1 або 1b необхідно здійснювати через 5 хвилин. Таблиця 1 № 10-V1 (порівняння) 10-V2 (порівняння) 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 1хв. 5хв. 30хв. 60хв. А А+1,45мг/кг D 4 1b 4 1 2 1 1b 1 А+0,01мг/кг H А+0,03мг/кг H А+0,05мг/кг H А+0,07мг/кг H А+0,14мг/кг H А+0,28мг/кг H 1b 1b 1b 1b 1b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Коментар: Без додавання деемульгатора спостерігається лише дуже повільне деемульгування. Оцінка 4 є неприйнятною, у даному випадку йдеться про стабільну емульсію. Гідрофобіни вже у дуже незначних кількостях проявляють дуже високу деемульгувальну активність. Навіть при додаванні 0,01м.ч. гідрофобіну протягом 1 хвилини одержують прийнятний ре 31 85011 зультат. Така ж дія, як при додаванні 0,07мг/кг гідрофобіну, спостерігається лише після додавання у пальне 1,45мг/кг наявного у продажу деемульгатора на основі фенольних смол. А при даванні гідрофобіну необхідна лише 1/20 кількості звичайного деемульгатора для досягнення такої ж дії. Порівняльний приклад 11 Застосування інших білків як присадки до пального Аналогічно прикладу 10 досліджують інші білки, у випадку яких не йдеться про гідрофобін, для використання у пальному. Дослідження здійснюють з використанням альбуміну сироватки теляти (BSA) та казеїну. Такі білки наявні у продажу. Крім того використовують yaad відповідно до SEQ ID NO 15 та 16, тобто незв'язаний з гідрофобіном партнер злиття. Відповідний білок у концентрації 0,07мг/кг додають у наявне у продажу пальне Євросупер (відповідно до EN 228), яке вже містить 1000мг/кг заданого вище набору присадок А. Як зразок для порівняння використовують пальне, що містить лише присадки А без додавання білка. Дослідження відповідно до стандарту DIN 51415 здійснюють, як описано вище. Результати досліджень наведені нижче в таблиці 2. Таблиця 2 1хв. 5хв. 30хв. 6хв. 11-V3 (порівнян-ня) 11-1 11-2 11-2 А А+0,07мг/кг BSA А+0,07мг/кг yaad А+0,07мг/кг казеїну 4 2 3 3 4 1 1 1b 2 1 1 1 1b 1 1 1 Коментар: Розділення емульсії без додавання деемульгатора відбувається так само повільно, як і у прикладі 10. Оцінка 4 є неприйнятною, у даному випадку йдеться про стабільну емульсію. Використовувані білки проявляють активність деемульгаторів, однак швидкість деемульгування є більш повільною порівняно з випадком використання гідрофобіну. Приклад 12 Застосування концентрату гідрофобіну (YaadXa-dewA-His 6) як агенту розбивання емульсії для сирої нафти Дослідження здійснюють з використанням концентрату гідрофобіну відповідно до прикладу 8 (SEQ ID NO. 19 та 20). При здійсненні дослідження до 50мл сирої нафти (зразок Wintershall AG, Emlichheim, зонд 301; залишковий вміст води після використання звичайних компонентів емульсії приблизно 3%) концентрат гідрофобіну у різних кількостях. Концентрація гідрофобіну в сирій нафті становить 1м.ч., 10м.ч. та 40м.ч.. Після гомогенізації суміші протягом 10 хвилин центрифугують при швидкості обертання 2000 обертів на хвилину. Результати наведені нижче в таблиці 3. 32 Таблиця 3 Додавання гідрофобіну Без додавання 1м.ч. 10м.ч. 40м.ч. Вільна водна фаза 0,4% 0,8% 2,4% 2,4% Фаза емульсії 2,4% 2,0% 0,4% 0,4% При додаванні від 10 до 40м.ч. концентрату гідрофобіну утворюється переважна частина вільної водної фази. Приклад 13 Застосування концентрату гідрофобіну (YaadXa-dewA-His 6) для фракціонування полімерів Дослідження здійснюють з використанням концентрату гідрофобіну відповідно до прикладу 8 (SEQ ID NO. 19 та 20). У 2 хімічних стакани поміщають по 150г полі акрилової кислоти у формі її натрієвої солі (Sokalan® CP 10 S; Mw 4000г/моль, відповідно до [DE 199 50 941 А1]), після чого додають по 75г ізопропанолу. Суміш перемішують протягом 5 хвилин, після цього додають по 146г суміші ізопропанол/вода (у співвідношенні 1/1) та перемішують протягом 5 хвилин. У хімічний стакан А додають 50м.ч. гідрофобіну (1,64м, 11,3мг/мл) та перемішують протягом 5 хвилин. Гідрофобін, який вже через 5 хвилин повністю розчиняється, утворює білий осад у прозорому розчині. У обидва хімічні стакани додають 19,75г 50%-ного розчину NaOH та перемішують протягом 15 хвилин. З додаванням гідрофобіну відразу ж утворюється молокоподібний розчин, без додавання гідрофобіну - сильно непрозорий розчин. Через 15 хвилин перемішування кожен вміст хімічних стаканів поміщають відповідно у 500мл ділильну лійку, трохи стр ушують та спостерігають, скільки триває процес розділення фаз. У випадку зразку з додаванням гідрофобіну через 10 хвилин спостерігається чітке розділення фаз, у випадку зразку без додавання гідрофобіну спочатку утворюється піноподібний "проміжний шар", тобто маленька прозора межа фаз. У випадку зразку без додавання гідрофобіну чітка межа розділу фаз утворюється лише через 40 хвилин. Тривалість розділення до утворення чіткої межі фаз: - з гідрофобіном: 12 хвилин, - без гідрофобіну: 40 хвилин Приклад 14, Порівняльний приклад 15 Застосування злитого гідрофобіну (Yaad-XadewA-His 6) та альбуміну сироватки теляти (BSA) як деемульгатора для емульсії типу масло-у-воді при 55°С Дослідження здійснюють з використанням концентрату гідрофобіну відповідно до прикладу 8 (SEQ ID NO. 19 та 20), а також наявного у продажу розчину альбуміну сироватки теляти (BSA). Деемульгувальні властивості досліджують таким чином: як масло використовують масло для гідравлічних систем. 33 85011 40мл дистильованої води поміщають у 100мл вимірювальний циліндр та додають відповідний білок у кількості 5м.ч. у перерахунку на воду або відповідно 2,5м.ч. у перерахунку на загальну систему. Потім додають 40мл масла для гідравлічної системи, після чого у системі підтримують температур у 55°С на водяній бані. Час підтримання рівномірної температури становить 20 хвилин. Потім масло та воду протягом 5 хвилин емульгують мішалкою при швидкості 1500 обертів на хвилину. Таким чином здійснюють емульгування масла у водній фазі. Після цього спостерігається розділення фаз. Кількість відділеної водної фази зазначають в мл. У першій серії досліджень водний розчин обох білків використовують у тому ж самому вигляді. Результати представлені на діаграмі 1. У другій серії досліджень розчин обох білків спочатку при кімнатній температурі за допомогою HCI доводять до значення рН1 та залишають на 24 години при значенні рН1. Потім за допомогою NaOH встановлюють значення рН7. Результати представлені на діаграмі 2. Коментар: Швидкість деемульгування масляно-водної емульсії лише незначним чином підвищується за допомогою BSA у порівнянні зі зразками без додавання деемульгатора. Однак при додаванні гідрофобінів спостерігається дуже помітне прискорення деемульгування. 34 Відповідність назв послідовностей послідовністям ДНК та поліпептидів в протоколі послідовностей. dewA послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 1 dewA послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 2 rodA послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 3 rodA послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 4 hypA послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 5 hурА послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 6 hурB послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 7 hypB послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 8 sc3 послідов ність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 9 sc3 послідов ність поліпептидів SEQ ID NO: 10 basf1 послідовність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 11 basf1 послідовність поліпептидів SEQ ID NO: 12 basf2 послідовність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 13 basf2 послідовність поліпептидів SEQ ID NO: 14 yaad послідовність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 15 yaad послідовність поліпептидів SEQ ID NO: 16 уаае послідовність ДНК та поліпептидів SEQ ID NO: 17 уаае послідовність поліпептидів SEQ ID NO: 18 yaad-Xa-dewA-his послідов ність ДНК та SEQ ID NO: 19 поліпептидів yaad-Xa-dewA-his послідов ність поліпеSEQ ID NO: 20 птидів yaad-Xa-rodA-his послідов ність ДНК та SEQ ID NO: 21 поліпептидів yaad-Xa-rodA-his послідов ність поліпепSEQ ID NO: 22 тидів yaad-Xa-basf1-his послідов ність ДНК та SEQ ID NO: 23 поліпептидів yaad-Xa-basf1-his послідов ність поліпеSEQ ID NO: 24 птидів 35 85011 36 37 85011 38 39 85011 40 41 85011 42 43 85011 44 45 85011 46 47 85011 48 49 85011 50 51 85011 52 53 85011 54 55 85011 56 57 85011 58 59 85011 60