Спосіб визначення вмісту мієлопероксидази в нейтрофільних гранулоцитах

Реферат: Спосіб визначення вмісту мієлопероксидази в нейтрофільних гранулоцитах включає інструментальні дослідження периферійної крові, фотометричну детекцію характеристик зразка та оцінку діагностичних критеріїв. Виділяють із досліджуваного зразка крові чисту популяцію нейтрофільних гранулоцитів, додають у зразок з цими клітинами розчин солянокислого бензидину з перекисом водню, інкубують протягом 600 с. Вимірюють інтенсивність забарвлення на імуноферментному аналізаторі та визначають вміст мієлопероксидази в нейтрофільних гранулоцитах по калібрувальній кривій. UA 102131 U (12) UA 102131 U UA 102131 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до способів аналізу крові, і може бути використана у лабораторній діагностиці. Визначення активності мієлопероксидази нейтрофільних гранулоцитів дає можливість прогнозувати розвиток захворювань, уточнити діагноз і своєчасно вжити заходи, спрямовані на регулювання активності цього ферменту, а також провести моніторинг мієлопероксидази під час клінічних випробувань фармакологічних препаратів. Відомий спосіб визначення мієлопероксидази (МПО) в лейкоцитах крові (Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В.В. Меньшикова. – Москва. "Медицина". - 1987 г.), за яким мазки крові висушують, фіксують в парах формаліну та інкубують з бензидиновим реактивом протягом 15 хв., після промивання підфарбовують ядра 5 % водним розчином сафраніну 1 хв., потім під мікроскопом підраховують відсоток клітин з утвореними темно-синіми гранулами формазану. Недоліком такого способу є його низька специфічність, викликана складністю, багатостадійністю способу та суб'єктивністю обліку результатів за рахунок підрахування на мікроскопі, що значно знижує об'єктивність показника та потребує багато часу для виконання методики. Відомий спосіб визначення мієлопероксидази в плазмі крови людини (Горудко И.В., Черкалина О.С., Соколов А.В., Пулина М.О., Захарова Е.Т., Васильєв В.Б., Черенкевич С.Н., Панасенко О.М. – 2009. - Новые подходы к определению концентрации и пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови человека. Биоорганическая химия. - Т. 35. - № 5. - С. 629-639) спектрофотометричним методом, за яким до плазми людини як субстрат додається о-діанізидин та після інкубації вимірюється оптична щільність на імуноферментному аналізаторі. Недоліком такого способу є те, що визначення мієлопероксидази в плазмі людини, поперше, не достатньо відображає функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів, подруге, в плазмі багато інших факторів, зокрема, гемоглобін та церулоплазмін, що також мають пероксидазну активність, по-третє, в крові людини є механізми, що регулюють активність мієлопероксидази. Відомий спосіб визначення мієлопероксидази в плазмі крові (BY13675, МПК G01N33/48, дата публікації 2010.10.30), що включає внесення о-діанізидину як субстрату у розбавлену буферним розчином плазму крові, спектрофотометрічне визначення швидкості його окислення після додавання пероксиду водню і визначення активності мієлопероксидази, при цьому як буферний розчин використовують фосфат-цитратный буфер з рН 4,5, пероксид водню додають до концентрації 100-200 мкМ, спектрофотометрічне визначення швидкості окислення субстрату здійснюють у відсутність і у присутності інгібітору мієлопероксидази - гідразиду 4амінобензойної кислоти, активність мієлопероксидази визначають по різниці швидкостей окислення о-діанізидину за відсутності і у присутності гідразиду 4-амінобензойної кислоти. Як і у попередньому аналозі недоліком такого способу є те, що визначення мієлопероксидази в плазмі людини недостатньо відображає функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів, внаслідок того, що в плазмі багато інших факторів, зокрема, гемоглобін та церулоплазмін, що також мають пероксидазну активність, крім того, в крові людини є механізми, що регулюють активність мієлопероксидази. Зазначені проблеми обумовлюють некоректну оцінку результатів дослідження активності мієлопероксидази у пацієнта. Крім цього, таку методику характеризує висока трудомісткість способу дослідження, викликана складністю та багатостадійністю дій способу, що також потребує багато часу для виконання методики. В основу корисної моделі поставлена задача створення способу визначення вмісту мієлопероксидази в нейтрофільних гранулоцитах, в якому за рахунок застосування нових дій по обробці досліджуваного зразка, нових речовин та вилучення факторів, що також мають пероксидазну активність, забезпечується підвищення чутливості і селективності процесу аналізу та достовірності оцінки. Для вирішення поставленої задачі спосіб визначення вмісту мієлопероксидази нейтрофільних гранулоцитів включає інструментальні дослідження чистої популяції клітин, фотометричну детекцію характеристик зразка та оцінку діагностичних критеріїв. Новим у способі є те, що виділяють із досліджуваного зразка крові чисту популяцію нейтрофільних гранулоцитів, додають у зразок з цими клітинами розчин солянокислого бензидину з перекисом водню, інкубують протягом 600 с, вимірюють інтенсивність забарвлення на імуноферментному аналізаторі та визначають концентрацію мієлопероксидази в нейтрофільних гарнулоцитах по калібрувальній кривій. 1 UA 102131 U 5 10 15 20 25 30 35 Внаслідок застосування у аналізі нових дій та нових речовин підвищується достовірність оцінки за рахунок використання чистої популяції нейтрофільних гранулоцитів, забезпечення стійкого забарвлення, зменшення впливу на забарвлення другорядних факторів та використання стандартної калібрувальної кривої. В окремих варіантах реалізації способу виділення та відокремлювання із досліджуваного зразка крові клітини нейтрофільних гранулоцитів здійснюють центрифугуванням досліджуваного зразка крові на подвійному градієнті щільності 1.076 та 1.120, а інтенсивність забарвлення вимірюють на імуноферментному аналізаторі. Застосування таких ознак дозволяє більш точно відокремити від досліджуваного зразка крові нейтрофільні гранулоцити, більш точно визначити наявність та вміст мієлопероксидази в нейтрофільних гранулоцитах та створити калібрувальну криву щодо вмісту мієлопероксидази в цих клітинах. При здійсненні способу у прикладі застосовувалась центрифуга LMC-4200R (Biosan, Латвия), 0,1 % розчин бензидину дигідрохлориду, спирт, 3 % розчин перекису водню, 0,1Н НСl, мієлопероксидаза поліморфноядерних лейкоцитів (Calbiochem, Германія) для побудови калібрувальної кривої та імуноферментний аналізатор ilEMS Labsystem (Фінляндія). При проведенні дослідження у прикладах з периферійної крові виділяли клітини нейтрофільних гранулоцитів центрифугуванням на подвійному градієнті щільності (1.076 та 6 1.120), осаджували в полістиролових планшетах в концентрації 1×10 /л, надлишок зливали, потім у отриманий зразок з клітинами нейтрофільних гранулоцитів додавали 0,2 мл робочого розчину бензидину дигідрохлориду (5 мг бензидину розведені в 3 мл спирту та 2 мл дистильованої води, та 10 мкл 3 % перекису водню), через 10 хв. зупиняли реакцію 0,1Н НСl та вимірювали інтенсивність забарвлення на імуноферментному аналізаторі. Вміст мієлопероксидази визначали по калібрувальній кривій, побудованій зі стандартною мієлопероксидазою поліморфноядерних лейкоцитів (Calbiochem, Германія). Спосіб ілюструється прикладами його застосування. Приклад 1. Пацієнт М., 45 р. Було проведено дослідження та визначено вміст мієлопероксидази у нейтрофільних гранулоцитах. Вміст мієлопероксидази складав 52 нг/мл. Тобто показники нормальні. Висновок - людина здорова. Приклад 2. Хворий Б., 46 p. Було проведено дослідження та визначено вміст мієлопероксидази у нейтрофільних гранулоцитах. Вміст мієлопероксидази складав 29 нг/мл. Тобто вміст мієлопероксидази низький. Діагноз - гострий інфаркт міокарду. Приклад 3. Хворий Л. 25 р Було проведено дослідження та визначено вміст мієлопероксидази у нейтрофільних гранулоцитах. Вміст мієлопероксидази складав 150 нг/мл. Тобто вміст мієлопероксидази високий. Діагноз - гострий ендокардит. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 Спосіб визначення вмісту мієлопероксидази в нейтрофільних гранулоцитах, що включає інструментальні дослідження периферійної крові, фотометричну детекцію характеристик зразка та оцінку діагностичних критеріїв, який відрізняється тим, що виділяють із досліджуваного зразка крові чисту популяцію нейтрофільних гранулоцитів, додають у зразок з цими клітинами розчин солянокислого бензидину з перекисом водню, інкубують протягом 600 с, вимірюють інтенсивність забарвлення на імуноферментному аналізаторі та визначають вміст мієлопероксидази в нейтрофільних гранулоцитах по калібрувальній кривій. Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2