Спосіб визначення перекису водню у нейтрофільних гранулоцитах

Реферат: Спосіб визначення перекису водню у нейтрофільних гранулоцитах включає виділення клітини нейтрофільних гранулоцитів з крові, додавання у зразок з клітинами нейтрофільних гранулоцитів молібдату амонію та визначення кількості перекису водню по інтенсивності забарвлення зразка. UA 74942 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ПЕРЕКИСУ ВОДНЮ У НЕЙТРОФІЛЬНИХ ГРАНУЛОЦИТАХ UA 74942 U UA 74942 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до способів аналізу крові, і може бути використана у лабораторній діагностиці. Відомий спосіб визначення перекису водню в лейкоцитах крові [див. RU2022241, МПК G01N1/28, дата публікації: 30.10.1994], за яким мазки крові висушують шляхом витримування у 1 3 вакуумі (5.10- -1.10- ) протягом 1 год., потім проводять інкубацію мазка впродовж 1 год. 15 хв. при 37 °C в середовищі, що містить 10 мг 3,3-діамінобензидину тетрагідрохлориду на 10 мл 0,2 Μ трис-буфера при рН 7,5-7,7, промивають дистильованою водою і фіксують спирт-формаліном (9:1) впродовж 10 хв., після промивання підфарбовують ядра 5 % водним розчином метилового зеленого 1 хв., потім під мікроскопом визначають наявність підфарбованих ядер. Недоліком такого способу є його низька специфічність, складність та багатостадійність, що значно знижує об'єктивність показника та потребує багато часу для виконання методики. Відомий спосіб визначення перекису водню в клітинній суспензії [див. Infect. Immun.-2001. V.69 (12). - P.7793-7799], за яким до клітинної суспензії додають флюорисцюючу речовину (dichlofluorescein hydrogen diacetate), після інкубації додають пропідіум йодид, лізують еритроцити та по інтенсивності флюоресценції, що вимірюється на проточному цитофлюориметрі, судять про кількість перекису водню. Недоліком такого способу є його низька специфічність, тому що флюорисцююча речовина реагує не тільки з нейтрофільними гранулоцитами, але й іншими клітинами, крім того методи лізування еритроцитів негативно впливають на функціонування нейтрофільних гранулоцитів, що спотворює показники дослідження. Крім того цей метод потребує наявності дорогого обладнання (проточний цитофлюориметр), що обмежує сферу застосування способу. В основу корисної моделі поставлена задача створення способу визначення перекису водню у нейтрофільних гранулоцитах, в якому за рахунок зменшення стадій обробки зразка, застосування нових дій та нових речовин забезпечується спрощення реалізації способу та підвищення достовірності оцінки. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення перекису водню у нейтрофільних гранулоцитах включає виділення з крові клітин нейтрофільних гранулоцитів. Новим у способі є те, що додають у зразок з клітинами нейтрофільних гранулоцитів молібдат амонію та визначають кількість перекису водню по інтенсивності забарвлення зразка Внаслідок застосування у аналізі нових дій та нових речовин підвищується достовірність оцінки за рахунок забезпечення стійкого забарвлення, зменшення впливу на забарвлення другорядних факторів. Зменшення стадій обробки зразка спрощує реалізацію способу та прискорює проведення дослідження. В окремих варіантах реалізації способу інтенсивність забарвлення зразка вимірюють за допомогою імуноферментного аналізатора та по калібрувальній кривій вираховують кількість перекису водню. Застосування таких особливостей додатково спрощує реалізацію способу та прискорює проведення дослідження. Спосіб ілюструється прикладами його застосування. При здійсненні способу у прикладах застосовувалась центрифуга ОПН-3,02 ДАСТАН, молібдат амонію - (NH4)6 Мо7 О24•4Н2О, виробництва Черкаського заводу хімреактивів (ГОСТ3765) та імуноферментний аналізатор ilEMS Labsystem (Фінляндія). При проведенні дослідження у прикладах з периферійної крові виділяли клітини нейтрофільних гранулоцитів центрофугуванням на подвійному градієнті щільності (1,076 та 6 1,120), потім у отриманий зразок з клітинами нейтрофільних гранулоцитів в концентрації 110 додавали 4 % розчин молібдату амонію, та через 10 хв. вимірювали інтенсивність забарвлення на імуноферментному аналізаторі та визначали кількість перекису водню по калібрувальній кривій. Приклад 1. Пацієнт Д., 29 p. Було проведено дослідження та визначено вміст перекису водню у нейтрофільних гранулоцитах. Рівень перекису водню складав 65 мкг/мл (тобто нормальний). Висновок - людина здорова. Приклад 2. Хвора Г, 54 р. Було проведено дослідження та визначено вміст перекису водню у нейтрофільних гранулоцитах. Рівень перекису водню складав 0,01 мкг/мл. Тобто рівень перекису водню низький. Діагноз - гострий інфаркт міокарду. Приклад 3. Хворий Б… 45 ρ Було проведено дослідження та визначено вміст перекису водню у нейтрофільних гранулоцитах. Рівень перекису водню складав 300 мкг/мл. Тобто рівень перекису водню високий. Діагноз - гострий ендокардит. 60 1 UA 74942 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 1. Спосіб визначення перекису водню у нейтрофільних гранулоцитах, за яким з крові виділяють клітини нейтрофільних гранулоцитів, який відрізняється тим, що додають у зразок з клітинами нейтрофільних гранулоцитів молібдат амонію та визначають кількість перекису водню по інтенсивності забарвлення зразка. 2. Спосіб визначення перекису водню у нейтрофільних гранулоцитах за п. 1, який відрізняється тим, що інтенсивність забарвлення зразка вимірюють за допомогою імуноферментного аналізатора та по калібрувальній кривій вираховують кількість перекису водню. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2