Спосіб оцінки антимікробної активності системи нейтрофільних гранулоцитів крові

Спосіб оцінки антимікробної активності системи нейтрофільних гранулоцитів крові, який включає цитохімічне, мікроскопічне та морфометричне Винахід відноситься до медицини і може бути використаний для оцінки антимікробної активності системи нейтрофільних гранулоцитів крові ВІДОМІ способи оцінки антимікробної активності нейтрофільних гранулоцитів крові, вимагають постановки ряда методів визначення та проведення реакції за відновленням нітросинього тетразолія (НСТ-тест) нейтрофільними гранулоцитами, визначення показника спонтанного (Сп НСТ) і стимульованого Candida aibicans (Ст НСТ) НСТ-тесту та показника резерву (ПР) антимікробної активності нейтрофільних гранулоцитів крові [1, 2] Недоліком цих способів є трудомісткість, суб'єктивність оцінки і тривалий час для виконання дослідження Найближчим аналогом є спосіб оцінки активності антимікробного ферменту первинних гранул нейтрофільних гранулоцитів крові мієлопероксидази, який включає мікроскопічне дослідження мазку клітин крові пацієнта, складається із приготування мазку крові та проведення ЦИТОХІМІЧНОІ реакції за методом Грехема-Кноля в присутності мієлопероксидази бензидин окислюється перекисом водню в оксибензидин, який виявляється в цитоплазмі Оцінку результатів реакції проводять візуально по інтенсивності забарвлення напівкількісним методом за принципом Астальді (- негативна реакція, + слабкопозитивна, ++ позитивна, +++ різкопозитивна) [3] Недоліком аналогу є низька точність оцінки результатів реакції, яка обумовлена суб'єктивністю НЕИТРОФІЛЬНИХ видається під відповідальність власника патенту ГРАНУЛОЦИТІВ дослідження мазка із клітин пацієнта, який відрізняється тим, що для приготування мазка використовують клітини периферичної крові і при морфометричному дослідженні нейтрофільних гранулоцитів вимірюють середні значення інтенсивності забарвлення цитоплазми клітин і при зменшенні її більш ніж у 1,5 рази, в порівнянні з нормою, констатують зниження антимікробної активності системи нейтрофільних гранулоцитів крові візуальної оцінки Задачею винаходу є розробка такого способу оцінки антимікробної активності системи нейтрофільних гранулорцитів крові, який за рахунок вимірювань середніх значень інтенсивності забарвлення цитоплазми клітин забезпечував би більшу точність оцінки результату реакції Поставлена задача вирішується тим, що в способі оцінки антимікробної активності системи нейтрофільних гранулоцитів крові, який включає цитохімічне, мікроскопічне та морфометричне дослідження мазку із клітин пацієнта, згідно з винаходом для приготування мазку використовують клітини периферичної крові, проводять цитохімічну реакцію по виявленню активності антимікробного ферменту - мієлопероксидази і у випадку коли при морфометричному дослідженні нейтрофільних гранулоцитів крові отримують зменшення у 1,5 рази, в порівнянні з нормою, середніх значень інтенсивності забарвлення цитоплазми клітин діагностують зниження антимікробної активності нейтрофільних гранулоцитів крові Приготування мазку із клітин периферичної крові, проведення ЦИТОХІМІЧНОІ реакції по виявленню мієлопероксидази нейтрофільних гранулоцитів крові за методом Грехема-Кноля та оцінки результатів реакції зменшення у 1,5 рази значень інтенсивності забарвлення цитоплазми, дозволяє підвищити точність оцінки результатів реакції, так як використовують об'єктивний КІЛЬКІСНИЙ аналіз та математичну обробку результатів дослідження О ^ о ю 54040 Вказані в формулі винаходу межі зміни значень інтенсивності забарвлення цитоплазми клітин в результаті морфометричного дослідження визначені на 10 хірургічних хворих та 10 донорів (таблиці 1,2) Таблиця 1 Значення інтенсивності забарвлення цитоплазми нейтрофільних гранулоцитів крові № Спостере-ження 1 Донор 1кл 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 Донор 1кл 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 3 Донор 1кл 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 4 Донор 1кл 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 5 Донор 1кл 2 3 4 5 Інтенсивність забарвлення 51,08 50,87 45,24 42,94 50,40 42,00 48,54 47,30 47,56 43,78 47,30 42,75 44,87 41,03 43,56 48,16 53,65 46,98 45,97 50,72 45,00 48,65 50,67 38,56 46,96 38,93 47,89 50,74 52,12 44,89 49,12 53,00 46,89 46,04 39,97 46,23 52,96 44,40 50,55 51,00 45,23 44,43 39,78 48,79 43,09 46,17 38,78 52,02 48,21 Інтенсив№ Спостере- ність заження барвлення 6 Донор 1кл 50,79 2 53,00 3 53,27 4 50,11 5 51,54 6 53,77 7 51,89 8 44,40 9 47,23 10 50,04 11 52,50 7 Донор 1кл 48,49 2 45,89 3 50,87 4 44,98 5 53,32 6 45,68 7 48,23 8 49,90 9 51,12 10 45,80 11 49,56 8 Донор 1кл 52,12 2 45,98 3 46,84 4 51,01 5 49,94 6 46,06 7 53,52 8 48,24 9 50,13 10 51,39 11 49,38 9 Донор 1кл 50,86 2 44,79 3 49,07 4 48,98 5 52,74 6 50,24 7 52,58 8 51,64 9 50,90 10 50,76 11 50,26 10 Донор 1кл 54,62 2 45,88 3 38,18 4 48,83 5 45,65 6 7 8 9 10 11 45,89 39,56 44,32 53,23 38,03 44,23 6 7 8 9 10 11 52,00 37,25 38,87 45,89 42,12 45,78 Таблиця 2 Значення інтенсивності забарвлення цитоплазми нейтрофільних гранулоцитів крові хворих № Спостереження 1 Б-ной 1кл 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 Б-ной 1кл 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 3 Б-ной 1кл 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 4 Б-ной 1кл 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5 Б-ной 1кл 1 2 ІнтенсивІнтенсивність ність № Спостерезабарвзабарвження лення лення 64,86 6 Б-ной 1 65,38 72,89 2 79,36 72,45 3 70,00 73,69 4 65,47 74,87 5 70,16 75,34 6 59,05 68,26 7 62,70 77,56 8 74,14 79,90 9 61,10 82,57 10 61,33 74,44 11 70,16 63,86 7 Б-ной 1 66,27 74,06 2 77,17 75,99 3 71,52 74,24 4 59,99 79,66 5 79,57 75,46 6 64,62 73,16 7 68,10 67,63 8 71,35 59,54 9 62,49 69,83 10 68,14 77,45 11 81,04 68,14 8 Б-ной 1кл 1 74,47 79,64 2 69,21 80,02 3 68,99 71,54 4 66,21 70,31 5 65,98 66,06 6 72,45 72,79 7 67,79 77,56 8 71,07 66,12 9 60,67 64,09 10 69,73 63,05 11 80,99 61,47 9 Б-ной 1 72,51 59,64 2 71,11 85,26 3 64,52 80,56 4 65,62 61,68 5 71,19 59,17 6 66,82 62,23 7 67,03 71,65 8 64,64 77,41 9 72,21 82,15 10 54,71 94,08 11 67,22 67,52 10 Б-ной 1 66,01 78,01 2 64,49 64,04 3 67,63 54040 Продовження таблиці 2 № Спостереження 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ІнтенсивІнтенсивність ність № Спостерезабарвзабарвження лення лення 63,35 4 62,88 71,34 5 68,40 70,15 6 72,92 66,64 7 69,63 81,26 8 77,42 81,69 9 78,22 67,89 10 60,63 80,87 11 59,48 78,89 Спосіб виконують таким чином Беруть кров із пальця і наносять на предметне скло, готують мазки, фіксують 10 хвилин у 96% етиловому спирті, фарбують 15 хвилин за методом Романовськогота проводять морфометричний аналіз при якому вимірюють середні значення ІНТИНСИВНОСТІ забарвлення цитоплазми клітин у 11 випадково обраних клітин в різних полях зору при збільшені мікроскопу 400 Подальшу стандартизацію зображення проводять за допомогою аналізатору мікроскопічного зображення для об'єктивного аналізу Діагностика захворювання базується на порівнянні зміни середніх значень інтенсивності забарвлення цитоплазми клітини, що характеризують показники пацієнта, які відповідають наявності зниження антимікробної активності нейтрофільних гранулоцитів крові Коли при цитохімічному дослідженні отримують слідуючі зміни середніх значень інтенсивності забарвлення цитоплазми клітини, зменшення інтенсивності забарвлення цитоплазми більш ніж у 1,5 рази, в порівнянні з нормою, діагностують зниження антимікробної активності нейтрофільних гранулоцитів крові Приклад 1 У хворого С брали кров із пальця, наносили клітинний матеріал на предметне скло, робили мазок та проводили цитохімічне дослідження на мієлопероксидазу за методом Грехема Кноля мазок фіксували 1 хвилину у 4% розчині формаліну на 96% етиловому спирті, заливали розчином бензидину, який складався із 0,2г бензидину, 60,0мл 96% етилового спирту, 40,0мл дистильованої води, 0,2мл 3% розчину перекису водню, промивали дистильованою водою, дофарбувували 15 хвилин за методом Романовського- та проводили вимір інтенсивності реакції нейтрофільних гранулоцитів на мієлопероксидазу при цьому середні значення інтенсивності забарвлення цитоплазми складали 71,9 ± 3,2умов од у 11 випадково обраних клітин в різних полях зору при збільшені мікроскопу 400, що дозволило за результатами проведеного ЦИТОХІМІЧНОГО дослідження нейтрофільних гранулоцитів крові встановити наявність у пацієнта зниження антимікробної активності нейтрофільних гранулоцитів крові Норму визначали при цитохімічному дослідженні, як середні значення інтенсивності забарвлення цито плазми нейтрофільних гранулоцитів крові у 10 здорових осіб При цьому середні значення складали у донорів 47,6 ± 2,4умов од У хірургічних хворих середні значення інтенсивності забарвлення цитоплазми нейтрофільних гранулоцитів крові складали 70,5 ± 3,5умов од у 11 випадково обраних клітин в різних полях зору при збільшені мікроскопу 400 Приклад 2 У хворого К брали кров із пальця, наносили клітинний матеріал на предметне скло, робили мазок та проводили цитохімічне дослідження на мієлопероксидазу за методом Грехема Кноля мазок фіксували 1 хвилину у 4% розчині формаліну на 96% етиловому спирті, заливали розчином бензидину, який складався із 0,2г бензидину, 60,0мл 96% етилового спирту, 40,0мл дистильованої води, 0,2мл 3% розчину перекису водню, промивали дистильованою водою, дофарбувували 15 хвилин за методом Романовського- та проводили вимір інтенсивності реакції нейтрофільних гранулоцитів на мієлопероксидазу при цьому середні значення інтенсивності забарвлення цитоплазми складали 50,9 ± 1,5умовод у 11 випадково обраних клітин в різних полях зору при збільшені мікроскопу 400, що дозволило за результатами проведеного ЦИТОХІМІЧНОГО дослідження нейтрофільних гранулоцитів крові встановити у пацієнта відсутність зниження антимікробної активності нейтрофільних гранулоцитів крові Запропонований спосіб оцінки застосовано у 10 хворих Результатами досліджень встановлено зниження антимікробної активності нейтрофільних гранулоцитів крові у 8 хворих, у 2 хворих встановлено нормальну антимікробну активність нейтрофільних гранулоцитів крові Подальші дослідження підтвердили отримані результати В той час коли аналогом встановлено зниження антимікробної активності нейтрофільних гранулоцитів крові у 5 хворих, у 5 хворих встановлено нормальну антимікробну активність нейтрофільних гранулоцитів Проведені подальші дослідження встановили нормальну антимікробну клітин активність тільки у 2 хворих Таким чином, порівняння з аналогом показує, що застосування запропонованого способу дозволяє підвищити точність встановлення зниження антимікробної активності нейтрофільних гранулоцитів крові ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ 1 Асадов И Д , Нумерова Л С , Мирзоева М Э Связь между фагоцитарной функцией и цитохимическими показателями нейтрофилов крови // Лаб дело -1990 -№11 -С 19-21 2 Славинский А А Люминесцентный цитохимический метод количественного определения активированных фагоцитов // Лаб дело - 1989 - №4 С 32-34 3 Лабораторные методы исследования в клинике Справочник /Меншиков В В , Делекторская Л Н , Золотницкая Р П и др Под ред В В Меншикова М Медицина, 1987 - С 127 - 129 - Найближчий аналог 54040 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24