Спосіб експрес-визначення патогенних бактерій

Реферат: Спосіб експрес-визначення патогенних бактерій передбачає постановку реакції антигенантитіло включає попередню підготовку поверхонь детекції для підвищення їх чутливості та рівня визначення. Визначення патогенних бактерій здійснюють за допомогою аналітичного приладу - імунобіосенсора, на основі використання іонселективних польових транзисторів (ІСПТ) на базі оксиду церію. Аналіз проводять шляхом зв'язування іммобілізованих специфічних антитіл з бактеріальними клітинами, сигнал реєструють за допомогою електронного пристрою, що забезпечує його підсилення та обробку на основі комп'ютерної програми. UA 106617 U (12) UA 106617 U UA 106617 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної медицини, бактеріології та біотехнології та може бути використана для визначення рівня бактеріального забруднення навколишнього середовища. Відомий аналог [Драгуть С.С., 2006 - автореф. канд. дисерт., Харків -25 с.], метод точкової 6 9 імуноферментної детекції для виявлення антигену в кількості від 10 до 10 мікробних клітин у 1 3 см матеріалу. Процедура проводиться у чашках Петрі. На матову сторону фільтрів наносять по 9 8 7 6 3 мкл матеріалу, вміщуючого культури бактерій у кількості 10 , 10 , 10 , 10 мікробних клітин у 1 3 см і підсушують протягом 15 хвилин при 90 °C. Обробляють 3 % розчином бичачого сироваткового альбуміну; витримують 30 хвилин при 37 °C. Відмивають фільтри 6-разово забуференим фізіологічним розчином (рН 7,2) із додаванням 0,05 % Tween-20 (Полісорбат 20). Надалі дослідні фільтри обробляють протисальмонельозною сироваткою крові кролів в розведенні 1:10 (контрольні фільтри - нормальною сироваткою крові кролів в розведенні 1:10) впродовж 60 хвилин при 37 °C. Після 6-разового відмивання протягом 15 хвилин фільтри інкубують 30 хвилин при 37 °C з антивидовим кролячим кон'югатом, розведеним 1:100. Після відмивання фільтри витримують до видимого забарвлення у субстратній суміші. Далі відмивають, висушують та візуально проводять облік реакції. При наявності сальмонел на фільтрі в місцях нанесення матеріалу спостерігають забарвлення синього або коричневого кольору. Недоліками аналога є те, що він потребує коштовних реактивів, послуг висококваліфікованого персоналу, а також не менше 2 годин для здійснення аналізу в умовах і добре обладнаної лабораторії і не здатний виявляти антиген в кількості від 10 мікробних клітин 3 у 1 см . Задачею корисної моделі є розробка нового типу імунобіосенсорної тест-системи на основі використання іонселективних польових транзисторів (ІСПТ) на базі оксиду церію для визначення бактерій, який дозволяє безпосередньо реєструвати факт взаємодії антигенантитіло в режимі реального часу. Поставлена задача досягається тим, що спосіб експрес-визначення патогенних бактерій передбачає постановку реакції антиген-антитіло, яка включає попередню підготовку поверхонь детекції для підвищення їх чутливості та рівня визначення, згідно заявленої корисної моделі, визначення патогенних бактерій здійснюють за допомогою аналітичного приладу імунобіосенсора, на основі використання іонселективних польових транзисторів (ІСПТ) на базі оксиду церію, аналіз проводять шляхом зв'язування іммобілізованих специфічних антитіл з бактеріальними клітинами, сигнал реєструють за допомогою електронного пристрою, що забезпечує його підсилення та обробку на основі комп'ютерної програми. Приклад здійснення способу. Підготовка імунного біосенсора на основі ІСПТ. На першому етапі підготовки біосенсора проводять очистку поверхні ІСПТ від залишку імерсійної рідини. Для цього використовують таку суміш: біхромат калію і сірчаної кислоти (10 с), води, ацетону, етанолу і 10 мМ Na-фосфатного буферу (РВ), рН 7,3, що містить 100 мМ NaCl. Далі на поверхню трансдюцера наносять водний розчин цистаміну (10 мг/мл) і там витримують його протягом 30 хв при кімнатній температурі (~ 23 °C), після чого цю процедуру здійснюють повторно. Далі поверхню двічі активують протягом 20 хв за допомогою водного розчину глутаральдегіду (ГА). На активовану поверхню наносять розчин білка А від Staphylococcus aureus (20 µг/мл), або сироватку крові людини в розведенні 1:2 і витримували їх там протягом 30 хв в умовах вологого середовища. Після ретельного промивання поверхні за допомогою РВ на неї поміщають розчин гліцину (10 мг/мл в РВ) при кімнатній температурі для блокування незв'язаних груп ТА. Через 30 хв поверхню ІСПТ промивають за допомогою РВ. Після іммобілізації білка А на робочу поверхню і неспецифічної сироватки на референтну, наносять специфічні антитіла. Для прикладу роботи пристрою використовували розчин поліклональних антитіл до Salmonella, з розведенням 1:2 у 0,85 % розчині NaCl. Розчин антитіл витримують на робочій поверхні протягом 30 хв і далі її промивають РВ. Підготовлений таким чином чип зберігають у висушеному стані при 4 °C. Другий етап - аналіз результатів здійснюють "сендвіч-методом", для чого протягом 20 хв проводять зв'язування іммобілізованих специфічних антитіл з клітинами S. typhimurium, розчиненими у 0,85 % розчині NaCl. Потім їх обробляють протягом 10 хв розчином специфічних антитіл, мічених пероксидазою хріну (ПХ). Активність ПХ реєструють, використовуючи спеціальний робочий буфер, що включає 5 мМ тріс-НСІ (рН 7,5), 100 мМ NaCl, 15 мМ аскорбінової кислоти і 5 або 10 мМ Н 2О2. Реакція субстрату викликає локальну зміну рН середовища, в результаті утворення дегідроаскорбінової кислоти, що є більш лужною сполукою, порівняно з аскорбіновою кислотою. Сигнали (dV/dt) ІСПТ реєструють за допомогою електронного пристрою, що забезпечував його підсилення та обробку на основі комп'ютерної 1 UA 106617 U 5 10 15 20 програми. Після кожного аналізу чип обробляють протягом 5 хв розчином 0,1 М НСl та тріс-НСІ буфером. Загальний час проведення аналізу при попередній підготовці поверхні трансдюцера становить близько 30 хв. Результати тестування різних концентрацій S. typhimurium представлені на кривій зміни потенціалу ІСПТ імунного біосенсора при різних концентраціях S. typhimurium (граф.). Спосіб дозволяє виявляти чутливість близько 2-3 клітин/мл. Електрохімічна реєстрація сигналу з використанням СеОх пористої поверхні ІСПТ відповідають вимогам щодо створення дешевих імунних біосенсорів для визначення бактеріального забруднення об'єктів навколишнього середовища. Технічне рішення способу експрес-визначення патогенних бактерій дозволяє використовувати його для скринінгу бактеріальних інфекцій у навколишньому середовищі, продуктах харчування, а також використовувати для високочутливої швидкої і точної діагностики бактеріальних інфекцій в польових та лабораторних умовах. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб експрес-визначення патогенних бактерій передбачає постановку реакції антигенантитіло, яка включає попередню підготовку поверхонь детекції для підвищення їх чутливості та рівня визначення, який відрізняється тим, що визначення патогенних бактерій здійснюють за допомогою аналітичного приладу - імунобіосенсора, на основі використання іонселективних польових транзисторів (ІСПТ) на базі оксиду церію, аналіз проводять шляхом зв'язування іммобілізованих специфічних антитіл з бактеріальними клітинами, сигнал реєструють за допомогою електронного пристрою, що забезпечує його підсилення та обробку на основі комп'ютерної програми. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2