Спосіб визначення антитіл проти поверхневих полісахаридів патогенних стафілококів s. aureus

Реферат: Спосіб визначення антитіл проти поверхневих полісахаридів патогенних стафілококів S. aureus включає виділення антигену, нанесення його на носій, дослідження сироваток в імунологічній реакції. Використовується еритроцитарний діагностикум на основі поверхневого полісахариду, який очищений від нуклеїнових кислот та протеїнів, з вмістом полісахаридів 99 %. UA 79024 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ АНТИТІЛ ПРОТИ ПОВЕРХНЕВИХ ПОЛІСАХАРИДІВ ПАТОГЕННИХ СТАФІЛОКОКІВ S. aureus UA 79024 U UA 79024 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до області медицини, переважно імунології інфекційних хвороб може використовуватись для етіологічної діагностики і в біотехнології для виробництва імунолбіопрепаратів з високим вмістом антитіл проти полісахаридної капсули патогенних стафілококів - збудників сепсису і тяжких інфекцій. У відомому способі [1] для визначення антитіл використовують діагностикуми на основі "О" і "Н" антигенів грамнегативних бактерій, виділених загальновідомими методами. Відомий спосіб [2]визначення антитіл за допомогою еритроцитарного діагностикуму, де наносять на носій (на підготовлені еритроцити) загальний антиген синегнійних бактерій. За відомим способом [3] використовується як антиген Re-гліколіпід глибоких мутантів грамнегативних бактерій в імунологічній реакції непрямої аглютинації, але в зв′язку з глибоким розташуванням Re і Re гліколіпідів в клітині і їх тісним зв′язком з іншими структурними елементами бактерій, в тому числі поверхневими полісахаридами, визначені до них антитіла не мають протективну дію при сепсисі та інших тяжких інфекціях, обумовлених грамнегативними бактеріями. Інформаційні джерела [4, 5] свідчать про те, що однією з причин невисокої імуногенної дії цих антитіл є їх значна неоднорідність. В основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб виявлення антитіл проти поверхневих полісахаридів патогенних стафілококів S. aureus з високою специфічністю та проективною дією і на основі цього підвищити ефективність та точність діагностики. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення антитіл проти поверхневих полісахаридів патогенних стафілококів S. aureus, що включає виділення антигену, нанесення його на носій, дослідження сироваток в імунологічній реакції. Новим є те, що використовується еритроцитарний діагностикум на основі поверхневого полісахариду, який очищений від нуклеїнових кислот та протеїнів з вмістом полісахаридів 99 %. Приклад 1 Для отримання препарату поверхневого антигену стафілококи вирощували на рідкому поживному середовищі 0,5 % ПБ, до якого додавали 0,3 % м'ясного екстракту, 1 % дріжджового екстракту, 1 % магніту, глюкози, сахарози і 7 % хлориду натрію. Культуру вирощували при 37 °C у вигляді шару товщиною 7 мм в плоских бактерійних матрацах 4 доби, центрифугували для осадження бактерій. Із супернатанту осаджували препарат 2,5 об'ємами етилового спирту, потім проводили діаліз осаду проти проточної та дистильованої води впродовж доби, препарат суспендували в 0,15 М фосфатному буфері та звільняли від нуклеїнових кислот ДНК-азою (Sigma) і проназою (Serva). Отриманий первинний препарат розчиняли за допомогою 5 М НСl та нейтралізували 5 N NaOH, очищували тричі переосадженням за допомогою етилового спирту. Препарат діалізували і висушували [4, 6]. Для виготовлення поверхневого полісахариду бактерій S. aureus культуру вирощували на рідкому поживному середовище - МПБ з інгібіторами синтезу протеїну А (пептон, маніт), а також стимуляторів утворення мікрокапсули (глюкози, цукрози, дріжджового екстракту). Культуру вирощували при 37 °C у вигляді шару товщиною 7 мм в плоских бактерійних матрацах 4 доби, центрифугували для осадження бактерій. Із супернатанту осаджували препарат 3 об'ємами етанолу. Діаліз проводили проти дистильованої води впродовж доби, нерозчинний препарат суспендували в фосфатному буфері та звільняли від нуклеїнових кислот і протеїнів. Отриманий первинний препарат розчиняли за допомогою 5 N НС1 та нейтралізували 5 N NaOH, очищували тричі переосадженням за допомогою етилового спирту. Препарат діалізували і висушували. Одержаний початковий препарат мав слабку імуногенність, в зв'язку з тим його було модифіковано за допомогою гідролізу і відщеплення кінцевих цукрів в розчині NaOH. На базі одержаних препаратів конструювали діагностикуми, за допомогою яких виявляли титри антитіл у чотирьох сироватках від реконваласцентів після широких гнійних ран, інфікованих стафілококами. Приклад 1. Титри антитіл у РНГА після вакцинації мишей різними препаратами антигенів (табл. 1). 50 1 UA 79024 U Таблиця 1 Антигени: Стандартний ліпополісахарид (ЛПС) Початковий полісахарид (ІП) Очищений полісахарид (ОП) 5 10 №№ Титри в РПГА з Середній сиро- діагностикумом геометричний ваток на базі ОП титр 1 1:80 2 1:80 1:56 3 1:40 4 1:40 1 1:120 1:140 2 1:120 1:112,7 3 1:80 4 1 2 3 4 1:640 1:320 1:640 1:320 1:452,55 Lg середнього геометричного титру Р Рівень значущості -1,748+0,022