Штам pseudomonas batumici imb b-7532 – продуцент антибіотика батуміну

Реферат: Штам Pseudomonas batumici, депонований в колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під № IMB В-7532, - продуцент антибіотика батуміну. UA 107822 U (54) ШТАМ PSEUDOMONAS BATUMICI IMB B-7532 - ПРОДУЦЕНТ АНТИБІОТИКА БАТУМІНУ UA 107822 U UA 107822 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології, а саме до отримання нових антибіотиків шляхом мікробіологічного синтезу бактеріями роду Pseudomonas. До теперішнього часу серед бактерій роду Pseudomonas описано понад 50 продуцентів антибіотичних речовин своєрідних за структурою і спектром біологічної дії, ефективних щодо антибіотикорезистентних збудників захворювань. В 1976 р. Сікіура [1] виділив з культуральної рідини штаму P. sorbistinii комплекс антибіотиків-аміноглікозидів широкого спектра дії. Ці антибіотики були названі сорбістинами. На S. aureus сорбістин діяв в концентрації 12,5 мкг/мл. Мупіроцин (псевдомонова кислота) - антибіотик, виділений з штаму Р. fluorescens NCIB 11586, є високоактивним проти збудників стафілококових інфекцій, стійких до різних антибіотиків [2]. Лікарська форма, створена на основі мупіроцину, має назву Бактробан та використовується для місцевого застосування в клініці. Поряд з цим, з псевдомонад продовжують виділяти антибіотики, що належать до нових класів і характеризуються унікальним спектром дії. До таких антибіотиків належить батумін [3]. Штам-продуцент антибіотика батуміну за даними філогенетичного аналізу нуклеотидної послідовності гена 16S рРНК (задепонований у Genbank-JF306642) належить до γпротеобактерій, формуючих окрему гілку в групі представників роду Pseudomonas (Г+Ц вміст ДНК був 64,0 мол. %) і є представником нового виду Pseudomonas batumici [4] Продуцент синтезує антибіотик з високою і селективною активністю щодо стафілококів [5]. Найбільш близьким до корисної моделі, який заявляється, є штам (прототип) Р. batumici 17, одержаний комбінованим мутагенезом (нітрозогуанідин та УФ-випромінення) і являє собою гетерогенну з антибіотичною активністю культуру. Мутантний штам-продуцент P. batumici 17 синтезує від 70 до 100 мг батуміну на 1 л культуральної рідини. Однак такий вихід антибіотика при одержанні його в промислових умовах недостатній. До недоліків відомого штаму слід віднести: недостатню біосинтетичну активність, гетерогенність популяції. Задачею даної корисної моделі є одержання високопродуктивного штаму-продуценту батуміну. Отриманий мутант P. batumici, задепонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України 21.10.2015 під реєстраційним номером Pseudomonas batumici 1MB В7532, має наступні культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні характеристики. Культурально-морфологічні ознаки Досліджуваний штам на м'ясопептонному агарі (МПА) утворює круглі, прозорі колонії; клітини - грамнегативна паличка (2,21,0 мкм), рухома за допомогою декількох (частіше двох) полярних джгутиків. Фізіолого-біохімічні властивості Строгий аероб, використовує глюкозу лише по окислювальному шляху. Оксидазопозитивний по Ковачу, оптимальна для росту температура 25-28 °C; при 42 °C не росте; при 37 °C практично не росте. Анаеробно розщеплює аргінін, має активну левансахарозу, желатин не гідролізує, на середовищі Кінг пігмент не утворює. Джерела вуглецю. Штам P. batumici 1MB В-7532 як єдине джерело вуглецю використовує органічні сполуки різної хімічної будови, у тому числі вуглеводи: d-глюкозу, l-арабінозу, d-манозу, d-галактозу, dфруктозу, органічні кислоти, серед них метаболіти циклу Кребса (янтарну, малонову, кетоглютарову, аконітову, яблучну), поліспирти і гліколі (маніт, інозит, гліцерин), амінокислоти (аланін, ізолейцин, валін, орнітин, цитрулін, пролін, гістидин), азотисті сполуки (сарказин). На відміну від дикого штаму P. batumici B-303 мутантний штам P. batumici 1MB В-7532 в процесі тривалого зберігання в ліофілізованому стані, а також під шаром вазелінової оливи втратив здатність засвоювати фумарат, нікотинову кислоту, бензоат Na, капрат як єдині джерела вуглецю. Штам P. batumici 1MB В-7532 зберігали як під шаром вазелінової оливи, так і у ліофілізованому стані. Обидва способи довготривалого зберігання (протягом 60 місяців) забезпечували високий рівень антибіотичної активності штаму-продуцента Р. batumici 1MB В7532, при цьому спосіб зберігання в ліофілізованому стані забезпечував більш високий рівень виживання клітин в популяції. Метод ліофілізації культури є сучасним, надійним і може бути рекомендований для гарантованого зберігання штаму-продуцента при виробництві батуміну. До того ж, ліофілізація продуцента дозволить створити банк активних культур - культур з високою біосинтетичною активністю, які можуть протягом довгого часу забезпечувати виробництво гарантованим посівним матеріалом. З вихідної культури роблять посів на скошений МПА. Культуру вирощують при температурі 28 С протягом 24 годин. Середовище в колбах засівають суспензією клітин (початкова 7 концентрація 110 КУО/мл). Живильне середовище було отримано поетапною оптимізацією і 1 UA 107822 U 5 10 15 мало наступний склад (г/л дистильованої води): глюкоза -15; сечовина - 1,3; K2НРО4-0,5; NaCl0,5; MgSO4-0,25; суміш мікроелементів (мг/л): FeSO4-200, ZnSO4-10, MnCl2-3, СоСl2-20, NiCl2-2, Na2MoO4-3, яке забезпечувало не тільки збільшення біосинтезу батуміну, але й мінімальну кількість баластних речовин. Процес ферментації проводили глибинним методом на ферментерах "Biostat M": об'єм живильного середовища - 1,5 л; ступінь аерації - 1,0; доза інокулюму - 1 %; температура - 25 С; час культивування - 55 годин. Частоту обертів мішалки ферментера змінювали від 250 до 700 об/хв., залежно від споживання кисню культурою. З культуральної рідини батумін виділяється методами препаративної хроматографії. Двоступенева колонкова хроматографія (стаціонарна фаза - силікагель, елюент - система ацетон:бензол (1:1) забезпечувала 85-90 % очистку препарату. Останній характеризувався типовими для батуміну фізико-хімічними показниками (λmах в УФ-спектрі - 225 нм, оптичним 25 кутом обертання [α]d = -13,5°; хімічним зсувом протонів при ЯМР-аналізі - 0,8-1,4; 1,8-2,6; 3,23,4; 4,0-4,2; 4,7-4,9; 5,5-6,4; 7,2-7,4 м.д) та спектром біологічної дії. Статистично оброблені результати представлені в таблиці. Порівняльні результати при перевірці біосинтетичної активності відомого та одержаного штамів-продуцентів батуміну Оцінка результатів Число проведених ферментацій Середнє арифметичне Середнє квадратичне відхилення Похибка середнього арифметичного Довірчий інтервал для середнього арифметичного 20 25 30 35 Мутантний штам P. batumici 17 8 87,0-100 мг/мл ±1,2 ±5,5 Мутантний штам P. batumici IMB В-7532 10 170,0-190 мг/мл ±1,5 ±5,1 79,2