Штам pseudomonas batumici 17 – продуцент антистафілококового антибіотика батуміну

Штамм Pseudomonas batumici 17, задепонированный в коллекции Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного по № 7007, продуцент антистафилококкового антибиотика батумина. В.Ш. (13) 23609 (11) UA высокой избирательной активностью в отношении стафилококков (5). Наиболее близким к заявляемому изобретению является штамм (прототип) P.batumici 3187, выделенный в отделе антибиотиков Института микробиологии и вирусологии НАН Украины из ризосферы эвкалипта (Батумский ботанический сад) весной 1972 года. Представляет собой дикую культуру, гетерогенную по антибиотической активности, культура снижает активность в условиях лабораторного хранения, что свидетельствует о ее нестабильности. Известный штамм-продуцент P.batumici 3187, синтезирует от 10 до 20 мг батумина на 1 л культуральной жидкости (6). Однако такой выход антибиотика при получении его в производственных условиях недостаточен. Таким образом, к недостаткам известного штамма, следует отнести: 1) низкую продуктивность; 2) гетерогенность популяции с преобладанием активных и малоактивных клонов; 3) нестабильность. Задачей настоящего изобретения является получение нового высокопродуктивного штаммапродуцента батумина. Поставленная задача достигается тем, что в результате ступенчатого отбора, обрабатывая клетки разными дозами УФ-облучения, а затем (19) Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению новых антибиотиков путем микробиологического синтеза бактериями рода Pseudomonas. К настоящему времени среди бактерий рода Pseudomonas описано более 50 продуцентов антибиотических веществ разнообразного химического строения – от простых соединений, до оригинальных по структуре сложных молекул, представляющих собой новые классы органических соединений. Так, продуцент антибиотика бонгкрековой кислоты P.cocovenenans обладает значительной фунгицидной активностью (1). Продуцентом антибиотиков сепацинов А и В является штамм P.cepacia АТСС 39356 (2). P.fluorescens – продуцент флюопсинов (3), которые проявляют высокую активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Из продуцента P.fluorescens NCIB 10586 Фуллером с соавт. (4) получен антибиотик, названный псевдомоновой кислотой (включен в Британскую фармакопею под названием мупироцин). Активен, прежде всего в отношении стафилококков и стрептококков с множественной устойчивостью к антибиотикам. Продуцент антибиотика батумина при нумерической классификации был отнесен к самостоятельной группе микроорганизмов (P.species A), представляющих собой новый вид. Продуцент синтезирует антибиотик, обладающий C2 ____________________ 23609 N-метил-N'-нитро N- нитрозогуанидином получен штамм P.batumici 3187/17 с продуктивностью батумина свыше 87 мг/л. Полученный мутант P.batumici 17 имеет следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики. Культурально-морфологические признаки Грамотрицательные палочки, подвижные лофотрихи. Бактерии хорошо растут на обычных питательных средах: на мясо-пептонном агаре – колонии как гладкие, так шероховатые; на мясопептонном бульоне равномерная муть. При росте не образуют желто-зеленого флюоресцирующего пигмента, характерного для многих видов псевдомонас. Физиолого-биохимические свойства Строгий аэроб, использует глюкозу только по окислительному пути. Оксидазоположительный по Ковачу; оптимальная для роста температура 25–28оС; при 42оС – не растет; при 37оС – растет очень слабо. Анаэробно расщепляет аргинин; обладает активной левансахаразой; желатин не гидролизует; на среде Кинг пигмент не образует. Источники углерода. Штамм P.batumici 17 в качестве единственного источника углерода использует около 40 органических соединений разнообразного химического строения, в том числе углеводы и их производные: d-галактозу, l-арабинозу, d-маннозу, dфруктозу, сахарозу, трегалозу, глюкозу, янтарную, щавелево-уксусную, лимонную, яблочную, l-аспарагиновую кислоты, маннит, инозит, a-аланин, изолейцин, орнитин, цитруллин, пантотеновую кислоту и др. Мутантный штамм, в качестве единственного источника углерода способен потреблять цитрат и бензиламин, что является его отличительной особенностью от дикого штамма-продуцента. Пробирки с исходным посевным материалом сохраняют на полужидком мясо-пептонном агаре под слоем вазелинового масла (столбики, посеянные уколом) с пересевом через год. С исходной культуры делают посев на скошенный МПА. Культуру выращивают при температуре 28оС в течение 24 часов. Среду в колбах засевают суспензией клеток (по 2 мл) со скошенного МПА. Суспензию готовят на физиологическом растворе (оптическая плотность – 1,8, ФЭК). Объем колб – 750 мл, объем среды – 150 мл. При выращивании материала в колбах, в инокуляторах и ферментерах используют среду следующего состава, г/л: мочевина – 1, глюкоза – 30, KNO3 – 1,5; K2HPO – 0,5, MgSO – 0,3, NaCl – 0,5, водопроводная вода – 1 л. Исходное значение рН 7,2– 7,8. Режим стерилизации – температура 105оС, 20 мин. Выращивание посевного материала проводят на качалке (200 об/мин, температура 28оС, 24 часа). Через сутки, выросший инокулюм в количестве 1,5% (от объема среды; 1 г/л по сухому весу) передают в ферментер емкостью 250 л, заполненный 100 л указанной среды. Культивируют 96 час при температуре 25оС при перемешивании 500 об/мин и аэрации: 1 объем воздуха на 1 объем среды в минуту. Затем культуральную жидкость обрабатывают известными приемами с последующим выделением целевого продукта. Проверку штамма-продуцента антибиотика батумина проводили на опытной установке Киевского завода "Медпрепарат" в ферментерах емкостью 250 л. Статистически обработанные результаты представлены в таблице. Таким образом, при испытании мутантного штамма в полупроизводственных условиях выявились его преимущества: 1) высокая продуктивность – мутантный штамм синтезирует до 87 мг/л батумина, известный штамм 31,4 мг/л; 2) Штамм P.batumici 17 хранится на мясо-пептонном агаре под слоем вазелинового масла при температуре 4–6оС с пересевом 1 раз в год, не снижая продуктивности антибиотика; 3) стабильность. Предлагаемый мутантный штамм позволяет повысить концентрацию антибиотика в культуральной жидкости на 177%. Сравнительные результаты по проверке продуктивности известного и полученного мутантного штаммов – продуцентов батумина Оценка результатов Известный штамм, (полученный в результате многократных рассевов культуры дикого штамма-продуцента) Мутантный штамм– продуцент антибиотика 14 8 Число проведенных ферментаций Среднее арифметическое 31,4 мг/л 87 мг/л Среднее квадратическое отклонение ± 8,5 мг/л ± 1,2 мг/л Ошибка среднего арифметического ± 2,7 мг/л ± 5,5 мг/л 26 < 31,4 < 40,3 79,2 < 87 < 95,1 Доверительный интервал для среднего арифметического 2 23609 Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03 3