Штам актиноміцетів streptomyces globisporus smy622 – продуцент протипухлинного антибіотика ландоміцину е

Винахід відноситься до галузі біології, а саме до генетики та селекції і може бути використаний у біотехнологічній промисловості для отримання протипухлинного антибіотика ландоміцину Е. Відомий штам Streptomyces globisporus 1912 - продуцент ландоміцину Е (Поліщук Л.В., Ганусевич I.I., Мацелюх Б.П. Протипухлинна дія антибіотиків, що продукуються Streptomyces globisporus 1912, вивчена на моделі карциноми Герена у щурів // Мікробіологічний журнал. - 1996. -Т.58, №2. -С.55-58). Цей штам утворює два типи колоній - білі, спорулюючі (морфотип 1912-1) та сірі, олігоспорові (морфотип 1912-2) (Дубицька Л., Заворотна С., Осташ Б., Громико О., Басілія Л., Федоренко В. Характеристика ознак стійкості до антибіотиків у продуцентів протипухлинних антибіотиків Streptomyces globisporus 1912, Streptomyces peucetius ATCC29050, Streptomyces peucetius var. caesius ATCC27952 // Вісник Львів, ун-ту, сер. біол. 2000. Вип.25. С.50-60). Недоліком цього штаму є низький рівень синтезу ландоміцину Е. Відомі штами S. globisporus, похідні 1912, у яких або частково, або повністю пригнічений синтез ландоміцину Е, наприклад, LND801 і LND901, відповідно (B. Ostash, L. Basiliya, O. Gromyko, et al. // Streptomyces globisporus 1912 mutants with altered landomycin E biosynthesis. 2001. Is.27. P.106-112). Всі штами за морфологією подібні до штаму 1912. Найближчим за технічною сутністю до штаму Smy622 є штам Streptomyces globisporus 3-1. Цей штам отриманий у результаті обробки N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідином спор штаму 1912 (А.Б. Мацелюх. Генетична трансформація штамів Streptomyces globisporus 1912: рестрикційна перепона і сумісність плазмід // Мікробіол. Журн. 2001. Т.63. №1. С.15-22). Для штаму 3-1 характерний підвищений рівень біосинтезу ландоміцину Е, але він не достатній для отримання великих кількостей кінцевого продукту. Він утворює слабкий повітряний міцелій і малу кількість спор. В основу винаходу поставлено завдання створення штаму S. globisporus з високим рівнем біосинтезу ландоміцину Е. Поставлене завдання досягається створенням штаму Streptomyces globisporus Smy622 - продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е. Штам Smy622 отриманий з штаму 1912-2 в результаті обробки спор ультрафіолетовим опроміненням з наступним висівом на середовище із 2,5мкг/мл стрептоміцину. Опромінення спор здійснювали протягом 30с на відстані 10см від джерела випромінювання (лампа MEDICOR BLM-12, потужність 44Вт). Виживання штаму Smy622 на середовищах, які містять менше 1000мкг/мл стрептоміцину становить 100%. Штам Smy622 стабільно зберігає ознаку стійкості до стрептоміцину і підвищений рівень синтезу ландоміцину Е за умов вирощування на повноцінних середовищах без додавання стрептоміцину. Штам Smy622 зберігається в Дипозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України і характеризується наступними ознаками. Культурально-морфологічні ознаки. Утворює добре розвинутий первинний (субстратний) міцелій. На вівсяному середовищі утворює слабкий вторинний (повітряний) міцелій (діаметр гіф 0,47мкм). Спори круглі (діаметр 0,15мкм), гладенькі, утворюють ланцюжки на спороносних гіфах повітряного міцелію. На інших середовищах спор не утворює. На вівсяному середовищі 14-денна культура посіяна шляхом розсіву спор утворює блискучі, складчасті колонії світлокоричневого кольору з хвилястим бежевим краєм. Субстратний міцелій колоній вростає в агар. В центрі колоній утворюється білий борошнистий повітряний міцелій. Підложка синього кольору. Діаметр колоній 10-12мм. На соєвому середовищі штам також утворює колонії з блискучим складчастим субстратним міцелієм та хвилястим краєм. Субстратний міцелій темно-бежевий, підложка темно-синього кольору. Діаметр колоній 1214мм. На кукурудзяному середовищі №7 (КС-7) колонії блискучі, складчасті, з нерівним краєм. Центр колонії попелясто-коричневий, краї брудно-рожево-бежевого кольору. Субстратний міцелій колоній вростає в агар. Підложка темно-синя, майже чорна. Діаметр колоній 12-14мм. На мінеральному агарі Гаузе з крохмалем колонії блискучі, складчасті, з хвилястим краєм. Центральна частина колоній темно-бежева, а краї світліші. Підложка коричневого кольору. Діаметр колоній 6-8мм. На мінімальному середовищі Хопвуда з глюкозою колонії блискучі, складчасті, рожево-бежевого кольору, підложка коричневого кольору. Діаметр колоній 6-8мм. Фізіологічні ознаки. У разі посіву на різні поживні середовища культура здатна утилізувати крохмаль, глюкозу, галактозу, арабінозу, лактозу, сахарозу, гліцерин, L-аспарагін. Температурний оптимум 30°С, дихання аеробне. Для підтримки і довготривалого зберігання використовується середовище такого складу, г/л: кукурудзяне борошно 20 NaCl 5 пептон 4 агар 22 вода водопровідна до 1л рН 7,5 Винахід ілюструється наступним прикладом. Приклад. Культурою штаму Streptomyces globisporus Smy622 засівають посівне середовище наступного складу, г/л: кукурудзяне борошно 20 NaCl 5 пептон 4 вода водопровідна до 1л рН 7,5 Вирощування здійснюють при температурі 30±2°С на круговій качалці (240об/хв) протягом 48год. Вирощений міцелій у кількості 5% від об'єму середовища засівають у ферментаційне середовище того ж складу. Ферментація проходить протягом 120год при температурі 30±2°С на круговій качалці (240об/хв.). В кінці процесу здійснюють очистку ландоміцину Е від домішок і визначають його вміст спектроскопічним методом. Екстракцію здійснюють без відокремлення міцелію від культуральної рідини етилацетатом у співвідношенні 1:1. Процедуру повторюють тричі. Екстракт висушують у вакуумі, антибіотик розчиняють в етиловому спирті. Очистку антибіотика від мінорних метаболітів проводять методом високоефективної рідинної хроматографії на апараті Waters PAD796 (“Waters”, Великобританія), використовуючи колонки із зворотною фазою RP-C18 Symmetry (250х4,6мм; “Waters”, Великобританія). Як мобільну фазу використовують суміш: ацетонітрил - 0,1% трифтороцтова кислота. Ландоміцини елюють у лінійному градієнті ацетонітрил-вода (10%-100%), на протязі 30хв із швидкістю потоку 1мл/хв. В цих умовах визначають час виходу (Rt) ландоміцинів. Детекцію та спектральну характеристику сполук проводять з використанням фотодіодного детектора PAD796 та програми Millenium ("Waters", Великобританія), отримуючи при цьому двомірні (“час” - “одиниці абсорбції”) хроматограми. Ландоміцини детектують при довжині хвилі 451нм. Вміст ландоміцину Е становить 560мкг/мл, що у 200 разів перевищує рівень біосинтезу ландоміцину Е штамом S.globisporus 1912-2. Це підтверджує досягнення передбачуваного те хнічного результату.