Спосіб кріоконсервування клітин наднирників новонароджених поросят

Реферат: Спосіб кріоконсервування клітин наднирників новонароджених поросят включає заморожування клітин зі швидкістю 1 °/хв. до -40 °С в кріозахисному середовищі, що містить 10 % ДМСО. Перед заморожуванням клітини культивують протягом 3-5 діб, а в кріозахисне середовище додатково вводять фетальну телячу сироватку концентрацією 25 %. UA 107969 U (54) СПОСІБ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ КЛІТИН НАДНИРНИКІВ НОВОНАРОДЖЕНИХ ПОРОСЯТ UA 107969 U UA 107969 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до кріобіології і кріомедицини і може бути використана для довгострокового зберігання первинної культури клітин наднирників новонароджених поросят (ПККННТТ) з метою подальшого її використання в експериментальній та клінічній медицині. Різноманіття клітинного складу наднирників і, як наслідок, широкий спектр речовин, які в них секретуються, обумовлює можливість використання клітин наднирників в якості трансплантата при лікуванні багатьох патологій: первинної та вторинної гормональної наднирникової недостатності, полегшенні больових відчуттів при травмах і на термінальних стадіях онкологічних захворювань. Крім цього, деякі популяції клітин наднирників здатні до спонтанного та індукованого диференціювання, а також трансдиференціювання в нейрональному напрямку, що дозволяє використовувати їх для лікування нейродегенеративних патологій в експериментальних умовах та клінічній медицині. Відомий спосіб, який включає заморожування клітин наднирників новонароджених поросят у кріозахисному середовищі, що містить 5 % ДМСО, зі швидкістю охолодження 0,5-1 7хв. до 70…-72 °C [1]. Недоліками цього способу є зниження гормоносекретуючої активності клітин після кріоконсервування, яка становила 85 % в порівнянні з нативними клітинами. Найбільш близьким до заявленого є спосіб кріоконсервування клітин наднирників новонароджених поросят, в якому клітини заморожують зі швидкістю 1°/хв… до -40 °C у кріозахисному середовищі, що містить 10 % ДМСО [2]. Недоліками цього способу є низька збереженість (50 %) та життєздатність (5 %) клітин після кріоконсервування. В основу корисної моделі поставлена задача розробити такий спосіб кріоконсервування клітин наднирників новонароджених поросят, який би дозволив підвищити їх збереженість та життєздатність. Поставлена задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування клітин наднирників, який включає заморожування клітин зі швидкістю 1°/хв… до -40 °C в кріозахисному середовищі, що містить 10 % ДМСО, згідно з корисною моделлю, перед заморожуванням клітини культивують протягом 3-5 діб, а в кріозахисне середовище додатково вводять фетальну телячу сироватку (ФТС) концентрацією 25 %. Попереднє культивування дозволяє адаптувати клітини до умов in vitro, при цьому відбувається відновлення клітин, пошкоджених під час отримання клітинної суспензії внаслідок дії ферментів або механічних факторів. Після кріоконсервування запропонованим способом зберігається 79 % клітин із життєздатністю 87 %, які є функціонально активними та придатними для подальшого культивування та використання в екпериментальних дослідженнях. Спосіб здійснюють таким чином. Клітини, отримані ферментативним методом, культивують протягом 3-5 діб при 37 °C в 2 умовах 5 % СО2 в середовищі DMEM/F12 в культуральних флаконах з площею поверхні 25 см , посадкова концентрація клітин -1-3 млн/мл, по 4 мл клітинної суспензії у кожному флаконі. Коли конфлюентність моношару досягає близько 70 %, клітини відкріплюють за допомогою суміші розчинів трипсину та Версена (у співвідношенні 1:1, при цьому кінцева концентрація трипсину складає 0,25 %). Після видалення трипсину шляхом відмивання клітини концентрують у 0,5 мл живильного середовища і додають рівний об'єм кріозахисного середовища з 20 % ДМСО та 50 % ФТС (кінцева концентрація цих речовин в середовищі становить 10 % та 25 %, відповідно). Заморожування клітин здійснюють на програмному заморожувачі зі швидкістю охолодження 1°/хв. від кімнатної температури до -40 °C, після чого занурюють у рідкий азот. Відтаювання заморожених зразків здійснюють на водяній бані при +40 °C до зникнення твердої фази. Після відмивання клітини рекультивують при 37 °C, 5 % СО2 в середовищі DMEM/F12 3 10 % ФТС. Приклад. Клітини культивували та відкріплювали за описаним методом, після чого заморожували в кріозахисних середовищах, які містили 10 % ДМСО з додаванням 25 % ФТС або без ФТС. Після відтаювання визначали кількість збережених клітин та їх життєздатність. Для контролю брали клітини без попереднього культивування та заморожували їх в кріозахисному середовищі, що містило 10 % ДМСО (за прототипом). Результати наведено в Таблиці, з якої видно, що попереднє культивування клітин протягом 3-5 діб перед заморожуванням дозволяє підвищити їх збереженість на 24,6 % та життєздатність на 12,4 % в порівнянні з заморожуванням клітин без попереднього культивування. Додавання ФТС у концентрації 25 % до кріозахисного середовища дозволяє додатково підвищити збереженість та життєздатність клітин на 6,1 % та 8,6 %, відповідно. 1 UA 107969 U 5 В усіх зразках клітин, які культивувалися перед заморожуванням, в процесі подальшого рекультивування спостерігалося формування моношару, утворення цитосфер та спонтанне диференціювання/трансдиференціювання клітин в нейрональному напрямку. При рекультивуванні клітин, які були заморожені одразу після отримання, моношар не утворювався, а формування цитосфер та диференціювання/трансдиференціювання клітин в нейрональному напрямку не спостерігалося. Таблиця Збереженість та життєздатність клітин в залежності від способу кріоконсервування та складу кріозахисного середовища Склад кріозахисного середовища 10 % ДМСО Культивування протягом 3-5 діб перед заморожуванням 10 % ДМСО+25 % ФТС Без культивування перед 10 % ДМСО заморожуванням (за прототипом) Спосіб кріоконсервування 10 15 Збереженість Життєздатність клітин, % клітин, % 73,3±27,4* 78,7±14,5* 79,4±28,0* 87,3±8,3*# 48,7±4,5 66,3±9,1 Примітки: *- відмінності статистично значимі в порівнянні з відповідними даними для клітин, заморожених у кріозахисному середовищі, що містить 10 % ДМСО, без попереднього культивування; # - відмінності статистично значимі в порівнянні з відповідними даними для культивованих клітин, заморожених у кріозахисному середовищі, що містить 10 % ДМСО без ФТС. Джерела інформації: 5 1. Патент 34848 А, Україна, МПК C12N 5/02. Опубл. 15.03.01. Спосіб кріоконсервування культури клітин адренокортикальної тканини. 2. Устиченко В. Д. Функциональные свойства надпочечных желез новорожденных поросят при действии различных режимов замораживания. Автореф. дис. канд. биол. наук. Харьков, 2008. - 20 с. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб кріоконсервування клітин наднирників новонароджених поросят, який включає заморожування клітин зі швидкістю 1 °/хв. до -40 °С в кріозахисному середовищі, що містить 10 % ДМСО, який відрізняється тим, що перед заморожуванням клітини культивують протягом 35 діб, а в кріозахисне середовище додатково вводять фетальну телячу сироватку концентрацією 25 %. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2