Спосіб кріоконсервування культур клітин з використанням цукрози

Реферат: Спосіб кріоконсервування культур клітин з використанням цукрози включає заморожування клітин у кріозахисному середовищі, що містить 0,3 М цукрози та ДМСО. Перед заморожуванням клітини культивують у культуральному середовищі, яке містить 0,2 М цукрози, а ДМСО в кріозахисному середовищі беруть в концентрації 1 %. UA 99178 U (54) СПОСІБ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ КУЛЬТУР КЛІТИН З ВИКОРИСТАННЯМ ЦУКРОЗИ UA 99178 U UA 99178 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі кріобіології і може бути використана для створення банків культур клітин для подальшого їх використання в фундаментальних дослідженнях та клінічній практиці. На сьогоднішній день культури клітин є об'єктом численних досліджень в області біології розвитку, клітинної біології, генної інженерії, експериментальної та клінічної медицини. Широке використання культур клітин в експериментальній та клінічній практиці обумовлює необхідність створення низькотемпературних банків, що, у свою чергу, вимагає вдосконалення існуючих та розробки нових способів кріоконсервування. Відомий спосіб кріоконсервування культур клітин шляхом повільного ступінчатого охолодження до -196 °C у кріозахисному середовищі, що містить 10 % ДМСО та ембріональну сироватку великої рогатої худоби [1]. Недоліком цього способу є використання високої концентрації ДМСО, що чинить токсичний вплив на клітини. Крім того, сироватка ксеногенного походження може приводити до імунних реакцій після інфузії [2] та потенційно може бути джерелом пріонних інфекцій [3]. Ці недоліки обумовлюють необхідність видалення небажаних компонентів із кріозахисного середовища шляхом його розведення та наступного центрифугування, що, у свою чергу, приводить до значної втрати кількості та якості клітин. Найбільш близьким аналогом є спосіб кріоконсервування культури гемопоетичних клітин фетальної печінки людини з використанням цукрози. Згідно з цим способом культуру клітин заморожують в кріозахисному середовищі, що містить цукрозу в концентрації 0,3 М та ДМСО в концентрації 5 %, зі швидкістю 1 °C/хвилину до -80 °C з послідуючим зануренням у рідкий азот [4]. Відігрівають на водяній бані при температурі +37 °C, після чого відмивають з використанням 20 об'ємів холодного буферу HBSS шляхом центрифугування при 200 g на протязі 10 хвилин. Недоліком цього способу є використання високої концентрації ДМСО, яка потребує відмивання клітин, що приводить до значної їх втрати (вихід життєздатних клітин складає лише 40-50 %). В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити відомий спосіб кріоконсервування культур клітин, таким чином, щоб забезпечити можливість виключити відмивання клітин, і за рахунок цього підвищити вихід життєздатних клітин. Поставлена задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування культур клітин з використанням цукрози, який включає заморожування клітин у кріозахисному середовищі, що містить 0,3 М цукрози та ДМСО, згідно з корисною моделлю, перед заморожуванням клітини культивують протягом 24 годин у культуральному середовищі, яке містить 0,2 М цукрози, а ДМСО в кріозахисному середовищі беруть в концентрації 1 %. Попереднє культивування клітин у культуральному середовищі, яке містить 0,2 М цукрози, дозволяє знизити концентрацію ДМСО в кріозахисному середовищі до 1 %, що дає можливість виключити відмивання клітин, і за рахунок цього підвищити вихід життєздатних клітин на 2025 %. Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Мезенхімальні стромальні клітини (МСК) виділяли з жирової тканини з письмової згоди проінформованих донорів відповідно до рекомендацій Хельсінкської декларації Всесвітньої медичної асоціації щодо проведення біомедичних досліджень та культивували протягом 4-6 пасажів у культуральному середовищі на основі α-МЕМ, що додатково містило 0,2 мМ Lглутаміну, антибіотики (50 мкг/мл стрептоміцину, 50 од/мл пеніциліну) та 15 % ембріональної 2 сироватки. Культивування здійснювали у флаконах із площею дна 25 cм (PAA, Austria) у СО2інкубаторі при 37 °C, 95 % вологості та 5 % СО2. Далі в культуральне середовище додавали цукрозу в концентрації 0,2 М, і клітини культивували протягом 24 годин. Після культивування в присутності цукрози клітини знімали із використанням розчину трипсин-версена (1:4) та центрифугували. До клітинного осаду вносили кріозахисне середовище, яке містило 0,3 цукрози та 1 % ДМСО. Після еквілібрації протягом 10 хвилин при +4 °C зразки заморожували зі швидкістю 1 °C/хвилину до -80 °C з використанням програмного заморожувана ЗП-10 (СКТБ ІПКіК НАН України) та зберігали при температурі рідкого азоту. Після цього клітини відігрівали на водяній бані при температурі + 37 °C та оцінювали вихід життєздатних клітин з використанням трипанового синього за формулою: Ж К ВЖ К  1 1  100 % , Ж0  К0 де: Ж0 - життєздатність клітин до кріоконсервування; 1 UA 99178 U 5 10 15 20 25 30 Ж1 - життєздатність клітин після кріоконсервування; К 0 - кількість клітин до кріоконсервування; К 1 - кількість клітин після кріоконсервування. Після кріоконсервування вихід життєздатних клітин складав 66±4,5 %. Приклад 2. Дермальні фібробласти виділяли методом експлантації мікрофрагментів дерми з письмової згоди проінформованих донорів відповідно до рекомендацій Хельсінкської декларації Всесвітньої медичної асоціації щодо проведення біомедичних досліджень. Спосіб кріоконсервування здійснювали відповідно до прикладу 1. Після кріоконсервування вихід життєздатних клітин складав 73±7 %. Приклад 3. Досліджували вплив попередньої обробки цукрозою на вихід життєздатних МСК. Спосіб здійснювався як у прикладі 1, за виключенням того, що в культуральне середовище перед заморожуванням додавали цукрозу в різних концентраціях, а кріозахисне середовище не містило ДМСО. Результати наведені в таблиці 1. Із таблиці 1 видно, що кріоконсервування клітин, що не пройшли етап попередньої обробки цукрозою, приводило до загибелі більше 90 % клітин. Разом з тим попередня обробка цукрозою приводила до підвищення виходу життєздатних клітин після кріоконсервування, при цьому максимальні значення виходу життєздатних клітин були отримані з використанням 0,2 М цукрози та складали 54±5 %. Таким чином, попередня обробка клітин, навіть без використання ДМСО у кріозахисному середовищі, дозволяє отримати результати на рівні аналога, в якому використовують 5 % ДМСО. Приклад 4. Досліджували вплив ДМСО в концентрації 2 % на вихід життєздатних МСК і дермальних фібробластів. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1. Результати наведені в таблиці 2. Із таблиці 2 видно, що при концентрації ДМСО в кріозахисному середовищі 2 % вихід життєздатних клітин такий же, як і при концентрації 1 %, тому подальше підвищення концентрації ДМСО є недоцільним. Таблиця 1 Вплив попередньої обробки цукрозою на вихід життєздатних МСК (%) (N=6) Концентрація цукрози для попередньої обробки клітин, М Вихід життєздатних клітин, % 0 5±2 0,05 0,1 0,2 0,3 22±4* 41±4* 54±5* 23±4*# Примітка: * - Розходження достовірні (р