Спосіб оцінювання локального імунітету статевих органів у тварин

Реферат: Спосіб оцінювання локального імунітету статевих органів у тварин включає проведення цитохімічного дослідження нейтрофільних гранулоцитів. Діагностичний матеріал отримують шляхом відбору з слизової піхви за допомогою щітки для цитології, змоченої 15 М фосфатним буфером (NaH2PO4·2H2O+KH2PO4; pH 7,2), і потім на предметному склі до клітинної суміші додають 0,05 мл 0,15 % розчину нітросинього тетразолію, після чого готують мікропрепарат, який впродовж 30 хв інкубують у вологій камері термостата (t 37 °C). UA 109040 U (12) UA 109040 U UA 109040 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, а саме до клінічної лабораторної діагностики та клінічної імунології, і може використовуватись для визначення локального імунітету органів розмноження тварин. За останнє десятиліття значного поширення серед продуктивних та дрібних домашніх тварин набули захворювання органів розмноження (ендометрит, піометра, онкологічні хвороби), які займають левову частку в етіоструктурі незаразної патології. Незважаючи на значні сучасні досягнення з вивчення етіології, патогенезу та діагностики репродуктивних захворювань тварин, актуальність цієї проблеми вказує на необхідність вдосконалення методів діагностики, особливо на ранній (субклінічній) стадії розвитку, та розробки нових ефективних схем терапії. До механізмів локального імунітету належать клітинні та гуморальні фактори захисту. Сучасні дослідження клітинних факторів імунного захисту спрямовані на вивчення функціональних властивостей імунокомпетентних клітин [1]. У лабораторній практиці ветеринарної медицини використовується відомий спосіб діагностики вагінальної цистоскопії, який дозволяє визначити стан статевої системи на основі визначення морфологічних змін клітин слизової оболонки піхви [2]. До недоліків вказаних способів слід віднести недостатню інформативність для дослідника про стан захисних механізмів органів розмноження, адже при цьому визначається тільки цитологічний склад епітеліальних клітин без детальної диференціації імунних клітин та дослідження функціональних показників локального імунного захисту. Найбільш близьким аналогом є спосіб [3], який базується на діагностиці запального процесу в статевих органах з використанням гістологічного методу. Порівняно з аналогом, що розглянуто, цей спосіб достатньо ефективно дозволяє дослідити морфологію тканин та популяційний склад імунокомпетентних клітин. Проте, недоліком цього способу є складність його виконання (біопсія, можливі ускладнення), багатоетапна технологія виконання, наявність дорогого лабораторного обладнання та реактивів. Нами встановлено, що нейтрофільні гранулоцити є первинними месенджерами запалення, які перші мігрують в зону патологічного процесу і реалізують свою фагоцитарну функцію. Відомо, що інтенсивність запальної реакції багато в цьому залежить від каскаду імунологічних реакцій в яких задіяні клітинні механізми захисту. Тому функціональна здатність фагоцитів є інтегральною індикаторною величиною, яка в повній мірі віддзеркалює прояв протимікробного потенціалу імунокомпетентних клітин і є всебічним об'єктом дослідження сучасної клінічної імунології (фагоцитарна активність, визначення NETs-пасток, цитохімія тощо). В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб, що дозволяє визначити стан клітинних факторів імунного захисту органів розмноження різних видів тварин. Поставлена задача вирішується за допомогою дослідження клітинних факторів імунного захисту слизових оболонок органів розмноження (піхви, опосередковано слизової шийки матки та слизової оболонки матки) тварин шляхом проведення цитологічної діагностики мікропрепарату із застосуванням цитохімічної реакції з нітросинім тетразолієм (НСТ-тест). Суть заявленого способу полягає в індикації метаболічної реактивності фагоцитів (нейтрофілів) та їх здатності редукувати (відновлювати) фарбник тетразолієвого ряду нітросиній тетразолій, який після метаболічної реакції мікроскопічно візуалізується в цитоплазмі реактивних мікрофагів у вигляді гранул диформазану. Новим в способі, що заявляється є визначення реактивних (НСТ+) фагоцитів як основного індикатора при оцінюванні клітинних механізмів локального імунітету органів розмноження тварин. Причинно-наслідковий зв'язок між проведеним цитохімічними дослідженням і отриманими діагностичними критеріями полягає у наступному: 1. Цитологічний склад та протимікробний потенціал фагоцитів варіює у різні періоди статевого циклу і віддзеркалює стан локального імунітету зовнішніх та внутрішніх геніталіїв (матки). 2. Визначення цитохімічної реактивності нейтрофільних гранулоцитів в НСТ-тесті дозволяє інформативно та точно оцінити параметри клітинного захисту локального імунітету статевих органів в різні періоди відтворної здатності. 3. Спосіб дозволяє діагностувати субклінічний прояв запальної реакції в геніталіях, прогнозувати її подальший перебіг та ускладнення. Спосіб здійснюють наступним чином: 1. Діагностичний матеріал отримують шляхом відбору з слизової піхви за допомогою щітки . для цитології, змоченої 15 М фосфатним буфером (NaH2PO4 2H2O+KH2PO4; pH 7,2). 2. Отриманий матеріал наносять на край предметного скла, додають 0,05 мл 15 М фосфатного буфера (рН 7,2) з подальшим ретельним перемішуванням (30 с) суміші. 1 UA 109040 U 5 10 15 20 25 30 3. До клітинної суміші додають 0,05 мл 0,15 % розчину нітросинього тетразолію (виробництво фірми "Renal®», Великобританія; на фосфатному буфері (рН 7,2)). 4. Проводять інкубацію препарату в вологій камері термостата (t 37 °C). 5. Готують мікропрепарат (мазок). 6. Мікропрепарат висушують на повітрі (t ~18-20 °C, 10 хв). 7. Фіксують мікропрепарат 96° метиловим спиртом (30-40 с). 8. Фарбують (20-30 хв) мікропрепарат 0,1 % забуференим фосфатним розчином нейтрального червоного (рН 7,2). 9. Проводять мікроскопію мікропрепарату (світловий мікроскоп збільшення 200). 10. Оцінювання параметрів клітинного локального імунітету та інтерпретація отриманого результату. Клініко-експериментальні дослідження проводили на кішках різних порід у віці від 3 до 8 років. Для визначення стану клітинних факторів локального імунітету було використано спосіб цитологічної діагностики із використанням цитохімічної реакції НСТ-тесту. Постановка досліду проходила за такою схемою: діагностичний матеріал отримують шляхом відбору з слизової піхви за допомогою щітки для цитології, змоченої 15 М фосфатним буфером . (NaH2PO4 2H2O+KH2PO4; рН 7,2). До клітинної суміші додають 0,05 мл 0,15 % розчину нітросинього тетразолію (виробництво фірми "Renal®», Великобританія; на фосфатному буфері (рН 7,2)). Надалі мікропрепарати впродовж 30 хв інкубували у вологій камері термостату (t 37 °C). Після інкубації готували мазки, які фіксували метанолом та фарбували 0,1 % забуференим фосфатним розчином нейтрального червоного (рН 7,2). Оцінку та облік метаболічної реакції фагоцитів (визначення відсотка реактивних нейтрофілів) проводили мікроскопічним методом (збільшення * 200 разів). Реактивні (НСТпозитивні) нейтрофільні гранулоцити візуалізувались наявністю у цитоплазмі темно-коричневих включень у вигляді дрібної дифузної зернистості. Джерела інформації: 1. Turner М. L. Immunity and inflammation in uterus / M. L.Turner, G. D. Haley, I. M. Sheldon // Reprod. Dom Anim. - 2012. - Suppl. 4. - P. 402-409. 2. Руководство по репродукции и неонтологии собак и кошек / Симеон Дж., Игланл Г., Харви М. / под ред. Дж. Симеон.; пер. с англ. Е. И. Смелова, Ж. В. Вараксина, М. Д. Гвоздикова, И. Я. Корсакова. - М.: Софион, 2005. - 280 с. 3. Sheldon I. М. Innate immunity in human endometrium and ovary / I. M. Sheldon, J. J. Bromfield // Am. J. Reprod. Immunol. - 2011. - J/ol. 66 (Suppl. 1). - P. 63-71. 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 1. Спосіб оцінювання локального імунітету статевих органів у тварин, що включає проведення цитохімічного дослідження нейтрофільних гранулоцитів, який відрізняється тим, що діагностичний матеріал отримують шляхом відбору з слизової піхви за допомогою щітки для цитології, змоченої 15 М фосфатним буфером (NaH2PO4·2H2O+KH2PO4; pH 7,2), і потім на предметному склі до клітинної суміші додають 0,05 мл 0,15 % розчину нітросинього тетразолію, після чого готують мікропрепарат, який впродовж 30 хв інкубують у вологій камері термостата (t 37 °C). 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що після інкубації готують мазки, які висушують на повітрі (t ~18-20 °C, 10 хв) і фіксують метиловим спиртом (30-40 с), після чого фарбують 0,1 % забуференим фосфатним розчином нейтрального червоного (рН 7,2). Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2