Спосіб визначення активності елемента ефекторного ланцюга імунітету організму тварин та птиці

Спосіб визначення активності елемента ефекторного ланцюга імунітету організму тварин та птиці, що включає приготування маточного розчину буфера, гемолітичної сироватки, робочих розчинів, інкубацію, центрифугування, облік та оцінку результатів, який відрізняється тим, що використовують забуферений фізіологічний розчин як інкубаційне середовище та використовують режим інкубації, адаптований для аналізу активності титру комплементу сироватки. (19) (21) u200902633 (22) 23.03.2009 (24) 12.10.2009 (46) 12.10.2009, Бюл.№ 19, 2009 р. (72) КОВАЛЕНКО ЛАРИСА ВОЛОДИМИРІВНА, РОМАНЬКО МАРИНА ЄВГЕНІВНА, СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, БОЙКО ВІКТОРІЯ СЕРГІЇВНА, МАТЮША ЛЮДМИЛА ВІКТОРІВНА, КРОТОВСЬКА ЮЛІЯ МИКОЛАЇВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕ 3 44470 ні. Проводять стандартизацію суспензії еритроцитів: методом стандартизації є фотометрування. Якщо 3% суспензія еритроцитів барана приготована правильно, то шкала оптичної щільності показує 0,4. Розводять гемолітичну сироватку: гемолітичну сироватку беруть в розведенні, яке в 3 рази перевищує її початкову концентрацію. Готують гемолітичну систему: суміш рівних об'ємів розведеної гемолітичної сироватки і 3% суспензії еритроцитів барана. Для виконання пропонованого способу досліджувану нативну сироватку тварин розводять в 10 разів забуференим фізіологічним розчином (рН 7,4) і розливають в 10 пробірок у зростаючому об'ємі від 0,05мл до 0,5мл. Додатково ставлять контроль гемолітичної системи (по 1,5мл забуференого фізіологічного розчину (рН 7,4) і гемолітичної системи) та контроль 100% гемолізу (по 1,5мл сенсибілізованих еритроцитів і дистильованої води). Потім об'єм рідини в кожній пробірці доводять забуференим фізіологічним розчином до 1,5мл і додають по 1,5мл гемолітичної системи. (Табл.1) Далі суміш витримують 40хв. при температурі, яка визначається нормальною температурою тіла різного виду тварин (велика рогата худоба: 37,540,5; коні: 37,5-38,0; свині: 38,0-40,5; собаки: 37,539,0°С). Потім охолоджують 10-15хв. при температурі 4-6°С, центрифугують 10-15хв. при 1500об/хв. Проводять фотометрування при довжині хвилі 540нм (нонометрів) (зелений світлофільтр) проти дистильованої води. Для розрахунку 50% гемолітичної активності системи комплементу беруть те розведення сироватки, яке відповідає оптичній щільності, яка найбільш близька до половини величини оптичної щільності контролю гемолізу (100% гемоліз). Далі 4 розрахунок проводять за формулою: Ступінь гемолізу (%) = а/в 100% Де: а - екстінція досліду; у - екстінція контролю гемолізу Розрахувавши ступінь гемолізу у відсотках, за допомогою таблиці 2 визначають кількість 50% гемолітичних одиниць комплементу (СН50), що містяться в даному об'ємі досліджуваної сироватки. Приклад Для дослідження брали 2 групи тварин (свині): 1 група - контроль (свині, які були відносно здорові) і 2 група - свині з імунодефіцитним станом. Визначення проводили за способом, описаним в даній роботі. Результати дослідження представлені в таблиці 3. Приведені в даній роботі матеріали, засновані на аналізі середніх показників дослідної групи тварин свідчать про зниження неспецифічної резистентності організму тварин, а саме елементу ефекторної ланки імунітету - комплементу за 50% гемолізом. Проведені дослідження дозволяють зробити висновок, що спосіб визначення неспецифічної резистентності (ефекторної ланки імунітету) організму тварин є більш простішим у виконанні, має високу чутливість та відтворюваність. Запропонований метод визначає можливість проведення комплекс - імунокорегуючих засобів, які направлені на попередження формування та поглиблення запальних процесів, а також при дослідженні імунного гомеостазу сільськогосподарських тварин. Спосіб визначення активності елементу ефекторного ланцюга імунітету організму тварин та птиці Таблиця 1 Схема постановки реакції Інгредієнти Дослідна Буферний Вола Гемолітична 1 0,05 1,45 2 0,1 1,4 3 0 1 4 0,2 1,3 Номер 5 6 0,25 0,3 1,25 1,2 7 0,35 1,15 8 0,4 1,1 9 0,4 1,05 10 0,5 1,0 11 1 1,5 1,5 1 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1, 1,5 12 КГ 1,5 Таблиця 2 Спосіб визначення активності елементу ефекторного ланцюга імунітету організму тварин та птиці Відсоток гемолізу Кількість СН50 10 12 14 16 18 20 25 30 0,644 0,671 0,696 0,718 0,738 0,758 0,803 0,844 Відсоток гемолізу 35 40 45 50 55 60 65 70 Кількість СН50 0,884 0,922 0,961 1,000 1,041 1,084 1,132 1,185 Відсоток гемолізу 75 80 82 84 86 88 90 Кількість CH50 1,246 1,320 1,354 1,393 1,438 1,490 1,552 5 44470 6 Таблиця 3 Спосіб визначення активності елементу ефекторного ланцюга імунітету організму тварин та птиці № пп 1 2 3 4 5 М±m Комп’ютерна верстка А. Крулевський Група 1 (контроль), СН50 50 57 62 58 64 58,2±2,8 Підписне Група 2 (дослід) СН5037 34 40 39 42 38,4±1,6* Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601