Спосіб виділення днк мікобактерій з живильних середовищ для діагностики туберкульозу та мікобактеріозів в полімеразній ланцюговій реакції

Корисна модель відноситься до ветеринарної мікробіології, імунології та біотехнології, а саме до способу виділення ДНК бактерій роду Mycobacteria з живильних середовищ для діагностики туберкульозу та мікобактеріозів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Відомо декілька способів виділення геномної ДНК мікобактерій: хімічні, за допомогою ензимів та фізичні. Прикладами хімічного способу виділення є обробка бактеріальних клітин гуанідін-гідрохлорідом [Gongalez-yMerchand J.A., Estrada-Garcia I., Colston M.J., Сох R.A. A novel method for the isolation of mycobacterial DNA // FEMS Microbiol. Lett. - 1996, No.135, P. 71-77]. Даний спосіб є трудомістким, шкідливим для здоров'я, потребує значного терміну виконання та вимагає навичок роботи з реагентами. До ензиматичних способів належать способи обробки протеіназою К спільно з лізоцимом [Mizuguchi Y., Tokunaga T. Method for isolation of deoxyribonucleic acid from mycobacteria // Journal of Bacteriology. - 1970, No.104, P. 1020-1021] або ліпазою [Whipple D.L., LeFebvre R.B., Andrews Jr. R.E., Thiermann A.B. Isolation and analysis of restriction endonuclease digestive patterns of chromosomal DNA from Mycobacterium paratuberculosis and other Mycobacterium species // Journal of Clinical Microbiology. - 1987, No.25, P. 1511-1515]. Недоліками цих способів є те, що на їх виконання треба багато часу (до кількох діб), вони є складними, трудомісткими, вимагають навичок роботи з реактивами та значних грошових затрат. Прикладами фізичних методів можуть бути гомогенізація клітинної маси за допомогою скляних [Jacobs W.R., Kalpana G.V., Cirillo J.D., Pascopella L., Snapper S.B., Udani R.A., Jones W., Barletta R.G., Bloom B.R. Genetic systems for mycobacteria // Methods Enzymol. - 1991, No.204, P. - 537-555] або цирконієвих [Barrera L.F., Skamene E., Radzioch D. Assessment of mycobacterial infection and multiplication in macrophages by polymerase chain reaction // Journal of Immunological Methods. - 1993, No. 157, P. - 91-99] кульок. Ці методи прості, швидкі, але вимагають значних матеріальних затрат. До фізичних способів також можна віднести й раптову декомпресію клітин азотом [Yandell P.M., McCarthy C. Isolation of deoxyribonucleic acid from Mycobacterium avium by rapid nitrogen decompression // Infect. Immun - 1980, No. 27, P. - 368-375]. Це рішення щодо температурного впливу на клітини може бути прототипом. Недоліком цього способу є його небезпечність, тому що треба мати справу з рідким азотом, трудомісткість та відносно велика вартість. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб виділення ДНК мікобактерій, що містить одночасну інактивацію та руйнування клітинної оболонки мікобактерій, шляхом їх обробки температурою 99100°С протягом 20 хвилин, щоб забезпечити спосіб виділення ДНК мікобактерій з живильних середовищ для діагностики туберкульозу та мікобактеріозів в полімеразній ланцюговій реакції. Спосіб виконується таким чином. Мікобактеріальна ДНК виділяється після одночасної інактивації та руйнування клітинної оболонки внаслідок впливу високою температурою 99-100°С протягом 20 хвилин. Приклад 1 З досліджуваного зразка брали одну петлю бактеріальної маси (якщо живильне середовище було твердим), ресуспендували в 200мкл бідистильованої води та обробляли у водяній бані при температурі 99-100°С протягом 20 хвилин. Цим етапом досягали 2 мети: по-перше інактивація мікобактерій, по-друге - руйнування клітинної оболонки. Після цього проводили осадження седіменту за допомогою центифугування на ультрашвидкій центрифузі протягом 5 хвилин при 12000об/хв. Супернатант містив ДНК, що придатна для використання у полімеразній ланцюговій реакції. Приклад 2 З досліджуваного зразка брали 200мкл рідкого живильного середовища, що містить мікобактерії, та обробляли у водяній бані при температурі 99-100°С протягом 20 хвилин. Цим етапом досягали 2 мети: по-перше інактивація мікобактерій, по-друге - руйнування клітинної оболонки. Після цього проводили осадження седіменту за допомогою центифугування на ультрашвидкій центрифузі протягом 5 хвилин при 12000 об/хв. Супернатант містив ДНК, що придатна для використання у полімеразній ланцюговій реакції. Запропонований спосіб є простим у виконанні, не потребує навичок поводження з реагентами, нешкідливий для здоров'я, зовсім не потребує матеріальних затрат на купівлю дорогостоячих реагентів. З допомогою цього способу вдається значно прискорити виділення ДНК до 30 хвилин.