Спосіб генотипування helicobacter pylori

Реферат: Винахід стосується медицини, зокрема мікробіології, генетики бактерій, і може бути використаний для лабораторної діагностики і епідеміологічного аналізу. Спосіб генотипування Helicobacter pylori полягає у введенні фільтрату бульйонної чистої культури Helicobacter pylori у пробірки з перещеплюваною одношаровою лінією культури клітин HeLa. На лінії культури НeLa вивчають вакуолізуючу цитотоксичну активність Helicobacter pylori і на основі позитивного або негативного вакулізуючого тесту роблять висновок про наявність в геномі бактерії генів cagA, vacA, генотип cagA vacА бактерії (cagA+vacA+ або cagA-vac A+), а також cagA статус (cagA+ або cagA-), наявність в геномі бактерії острівця патогенності cag РАІ, алелі гена vacA(vacAs1 або інші), експресію гена vacA. UA 110363 C2 (12) UA 110363 C2 UA 110363 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід стосується медицини, зокрема мікробіології, генетики бактерій, і може бути використаний для лабораторної діагностики і епідеміологічного аналізу. За відомими способом вивчення вакуолізуючої цитотоксичної активності Helicobacter pylori проводять на перещеплюваній одношаровій лінії культури HeLa, що дає можливість встановити tox фенотип і тип культури Helicobacter pylori [1]. Недоліком відомого способу є недостатній рівень інформативності, зумовлений тим, що за відомим способом визначають лише tox фенотип і тип культури, і не встановлюють наявність у Helicobacter pylori генів cagA, vacA, генотип cagA vacA культури (cagA+vacA+ або cagA-vacA-), а також статус cagA (cagA+ або cagA-), алелі vacA(vacAs1 або інші), наявність у геномі бактерії острова патогенності cag РАІ, не визначають експресію гена vacA. Для генотипової ідентифікації та генотипування Helicobacter pylori необхідно застосовувати методи молекулярного зондування, полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), рестрикційного, ампфлікаційного аналізу та їх комбінацію, що є надто громіздким і потребує затрати значних коштів, що зумовлює недоступність їх для практичних мікробіологічних лабораторій. В основу винаходу поставлено задачу вдосконалити відомий спосіб диференціації tox фенотипів Helicobacter pylori за вакуолізуючим тестом шляхом додаткового застосування генетичного аналізу, що дає можливість встановити наявність у Helicobacter pylori генів cagA, vacA, генотип cagA vacA культури (cagA+vacA+ або cagA-vacA+), а також статус cagA (cagA+ або cagA-), алелі vacA(vacAs1 або інші), наявність в геномі бактерії острова патогенності cag РАІ, визначити експресію гена vacA. При вирішенні поставленого завдання брали до уваги те, що VacA екзотоксин (продукт експресованого гена vacA), має здатність формувати в цитоплазмі клітин HeLa вакуолі, які, зливаючись між собою, приводять клітини до набухання і руйнування. Конкретно спосіб генотипувания Helicobacter pylori за запропонованим нами способом здійснюють шляхом введення фільтрата бульйонної чистої культури Helicobacter pylori у пробірку з перещеплюваною одношаровою лінією культури клітин HeLa з наступною інкубацією у термостаті при 37 °С упродовж 18-24 годин. В подальшому за допомогою світлового мікроскопа спостерігають за наявністю вакуолізації цитоплазми клітин HeLa - не менше 50 % клітин HeLa при позитивному результаті. На основі позитивного вакуолізуючого теста роблять висновок, що досліджувана культура бактерії є токсигенною, тобто має фенотип tox+ і належить до 1 типу. При негативному тесті відсутність вакуолізації або вакуолізація менше ніж 50 % клітин - культура є нетоксигенною, має фенотип tox- і належить до 2-го типу. Подальший генетичний аналіз отриманих результатів проводять з урахуванням генетичних структур, які беруть участь у процесі продукції вакуолізуючого екзотоксину, і за відсутністю яких токсиноутворення неможливе. Таким способом за результатами генетичного аналізу вакуолізуючого теста встановлюють наявність генів cagA, vacA, генотип cagA vacA культури (cagA+vacA+ або cagA-vacA+), а також статус cagA (cagA+ або cagA-), алелі vacA(vacAs1 або інші), присутність у геномі бактерії острова патогенності cag PAI, визначають експресію гена vacA, отже, проводять генотипування і одночасно виявляють генетичні детермінанти Нelicobacter pylori без застосування спеціальних генетичних методів дослідження. Приклад 1. Хвора М., 47 років, обстежена з приводу виразкової хвороби шлунка, з біоптатів шлунка якої виділено Нelicobacter pylori і за запропонованим нами способом проведено фенотипування і гепотипування культури. За позитивним вакуолізуючим тестом встановили, що виділена від хворої Helicobacter pylori має фенотип tox+ і належить до 1 типу. За генетичним аналізом визначили, що культура містить гени cagA, vacA і має генотип cagA+vacA+, cagA статус її позитивний cagA+, в геномі бактерії міститься cag PAI, а її експресований ген vacA має алелі vacAsl. Приклад 2. Пацієнт М., 14 років. Досліджували зубний наліт, з якого виділили Helicobacter pylori. За даними фено-, генотипування дослідженого фільтрата культури встановили, що фенотип культури tox- і вона належить до другого типу. Helicobacter pylori з фенотипом toxможе мати генотип cagA-vacA+ з алелями vacA гена vacA s1 або генотип cagA+vacA+ з іншими, ніж vacAs1 алелями гена vacA. За позитивним тестом "колібрі фенотипу" встановили, що Нelicobacter pylori виділена від пацієнта М. має генотип cagA+, vacA+ з іншими, ніж vacAs1, алелями гена vacA. Таким способом за результатами генотипування є можливість встановити різні генотипи Helicobacter pylori у tox+ і tox- бактерій, що дозволяє визначити джерела інфікування. Отже, запропонований нами спосіб фено-, генотипування Helicobacter pylori можна використовувати в широкій лабораторній практиці, при наукових дослідженнях і проведенні епідеміологічного аналізу. 1 UA 110363 C2 Джерела інформації: 1. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга 2. Под редакцией А.С. Лабинской, Н.Н. Костюковой, С.М. Ивановой. - Москва, изд. БИНОМ - 2010. - С. 584-621. 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 Спосіб генотипування Helicobacter pylori, який включає встановлення наявності в геномі бактерії генів cagA, vacA, генотипу cagA vacA Helicobacter pylori (cagA+vacA+ або cagA-vacA+), а також cagA статусу (cagA+ або cagA-), наявності в геномі культури острівця патогенності cag PAI, алелів гена vacA (vacAs1 або інші), експресії гена vacA, який відрізняється тим, що на перещеплюваній лінії культури НeLa вивчають вакуолізуючу цитотоксичну активність Helicobacter pylori і при позитивному вакулізуючому тесті роблять висновок, що Helicobacter pylori містить гени cagA, vacA і має генотип cagA+vacA+, cagA статус її позитивний cagA+, в геномі бактерії міститься cag PAI, а її експресований ген vacA має алелі vacAs1; а при негативному вакулізуючому тесті роблять висновок, що Helicobacter pylori має генотип cagAvacA+ з алелями vacA гена vacA s1 або генотип cagA+vacA+ з іншими, ніж vacAs1 алелями гена vacA. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2