Спосіб моделювання транзиторного дифтерійного бактеріоносійства

Реферат: Спосіб моделювання транзиторного дифтерійного бактеріоносійства включає зараження збудником дифтерії піддослідних тварин. Кролів інтраназально інфікують суспензією C. 9 diphtheriae концентрацією 14×10 KУО/мл. Впродовж двох тижнів проводять щоденний бактеріологічний моніторинг елімінації C. diphtheriae зі слизу носових ходів та за динамікою висіваності патогену визначають вплив досліджуваного препарату на резистентність слизових оболонок до збудника дифтерії. UA 112583 U (12) UA 112583 U UA 112583 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медичної мікробіології та вакцинопрофілактики і може бути використана для дослідження антиколонізаційної дії бактеріальних антигенів - складових вакцинних протидифтерійних препаратів. На сьогодні боротьба з дифтерією та дифтерійним бактеріоносійством ще не досягнула завершуючої стадії. Існуючий ряд питань епідеміологічного плану, хоча й знаходить теоретичне і практичне рішення, але все ще не дозволяє ліквідувати окремі спалахи та спорадичні випадки захворювання на дифтерію. Проблема розробки методів більш надійної діагностики та лікування дифтерійного бактеріоносійства все ще залишається актуальним питанням сучасної медичної науки. Препарати на основі поверхневих бактеріальних антигенів C.diphtheriae, котрі містять патоген-асоційовані молекулярні патерни, стимулюючі уроджений імунітет, повинні перешкоджати персистенції патогену на слизових оболонках респіраторного тракту. Для виявлення наявності такої дії необхідно проводити великій обсяг експериментальних досліджень щодо колонізаційної резистентності до збудника, дифтерії, однак цьому заважає той факт, що лабораторні тварини захищені від зараження дифтерією механізмами природженого імунітету, котрі забезпечують елімінацію збудника зі слизових оболонок дихальних шляхів. Серед факторів такої природньої неспецифічної резистентності можна назвати мукозальні захисні бар'єрні функції - такі як запалення, нормальна мікрофлора, нормальні антитіла, лізоцим, комплемент, система пропердину, β-лізини, інтерлейкіни, інтерферони, система уродженого імунітету тощо [1]. Тому зараз при проведенні наукових досліджень та у виробництві дифтерійного анатоксину використовується лише чутливість лабораторних тварин до дифтерійного токсину, що введений парентерально. Для нормальної мікрофлори верхніх дихальних шляхів кролів характерна майже повна відсутність мікроорганізмів із зовнішнього середовища, тому що більша їх частина затримується у носовій порожнині, де гине через деякій час. Зазвичай у носовій порожнині піддослідних тварин персистує 2-3, рідше 4-5 різних видів мікроорганізмів. Частіше за все йдеться про В. alcaligenes bronchisepticus (у 37-91,7 %), Staphylococcus aureus та Staphylococcus albus (у 25100 %), Micrococcus catarrhalis (до 80 %), пастерелли (до 70 %), співвідношення кокових форм до пастерел - 12,5:1. Виділялися також Е. coli, P. aeruginosa (у 12,5-100 %) тощо. Постійними мешканцями слизових оболонок носоглотки та зіву кролів в основному є кокові форми бактерій стрептококи, стафілококи, мікрококи [2, 3]. Відома методика внутрішньояєчкового зараження збудником дифтерії імунізованих морських свинок з наступним висівом тканини яєчка і підрахунком колоній C.diphtheriae, що виросли [4]. Для імунізації застосовували як анатоксин, виготовлений звичайним способом, так й експериментальну вакцину з мікробних тіл. Через 8-10 днів після заключної ін'єкції свинки заражалися дифтерійними культурами типів gravis та mitis. Для зараження застосовувалися від 1 до 4 смертельних доз. Через 48 годин яєчко екстирпувалося, тканина його подрібнювалася і засівалася. Проводили аналіз у показниках наочності результатів засівання та робили висновки щодо активності звільнення макроорганізмів морських свинок від збудника дифтерії. Однак в процесі проведення таких дослідів досить часто відбувалася загибель імунізованих тварин від дифтерійної інтоксикації. До того ж ця модель не відображає стану транзиторного бактеріоносійства. Задачею, на вирішення якої спрямована запропонована корисна модель, є створення експериментальної моделі транзиторного дифтерійного бактеріоносійства. Поставлена задача вирішується тим, що для моделювання транзиторного дифтерійного бактеріоносійства, кролів інтраназально інфікують суспензією C.diphtheriae концентрацією 9 14×10 КУО/мл, впродовж двох тижнів проводять щоденний бактеріологічний моніторинг елімінації C.diphtheriae зі слизу носових ходів та за динамікою висіваності патогену визначають вплив досліджуваного препарату на резистентність слизових оболонокдо збудника дифтерії. Технічний результат - створення експериментальної моделі для вивчення in vivo протидифтерійної антиколонізаційної дії профілактичних або терапевтичних препаратів. Для здійснення способу, піддослідних кролів вагою близько 3 кг розподіляли на дослідну та контрольну групи, дослідну імунізували підшкірно експериментальною комбінованою вакциною, яка складається з бактеріального антигенного препарату C.diphtheriae у поєднанні з 20 Lf/мл нативного очищеного дифтерійного анатоксину. Контрольні тварини одержували нативний очищений дифтерійний анатоксин у дозуванні 20 Lf/мл. Для визначення присутності коринебактерій у видовому складі мікробіоценозу напередодні зараження, у піддослідних кролів відбирали зразки слизу з носової порожнини та проводили бактеріологічне дослідження з посівом на рідке (бульон Лінгуда) та щільне (кров'яно-телуритовий агар) елективні поживні середовища. 1 UA 112583 U 5 10 15 20 25 30 35 40 При визначенні мінімальної інфікуючої дози збудника дифтерії треба мати на увазі, що її величина у великій мірі залежить від вірулентних властивостей збудника. Поміж цими двома характеристиками існує зворотна залежність: чим вища вірулентність, тим нижча інфікуюча доза, та навпаки. Як відомо, інфікуюча доза високовірулентних патогенів може коливатися від однієї до декількох мікробних клітин, середньовірулентних - близько 100 клітин, у 5 6 низьковірулентнх штамів вона може складати 10 -10 мікробних клітин. Оскільки тварини не хворіють на дифтерію, при спробах відтворити модель дифтерійного бактеріоносійства на 4 6 8 9 9 кролях були використані підвищені дози патогену: 10 , 10 , 10 , 10 та 14×10 КУО/мл виробничого штаму C.diphtheriae var. gravis, tox+, massachussets у фізіологічному розчині. Кожною дозою інфікували по дві тварини. Результати бактеріологічного дослідження слизової оболонки носу кролів, заражених C.diphtheriae, показали, що при дозуванні інфікуючої суспензії, 9 нижчі за 10 КУО/мл, виділення патогену впродовж двох тижнів у всіх тварин відсутнє, тобто, ці концентрації не здатні викликати стан транзиторного бактеріоносійства в інтактних кролів. У 9 тварин, котрим було інокульовано збудника дифтерії у дозуванні 10 КУО/мл, впродовж двох тижнів бактеріологічних обстежень культура C.diphtheriae висівалася на першому тижні після 9 зараження. Підвищення інфікуючої дози до 14×10 КУО/мл продовжило строки висівання патогену до другого тижня. Таким чином, для реалізації експериментальної моделі, що пропонується, інтраназальне інфікування піддослідних тварин слід проводити за допомогою квачів, змочених у суспензії C.diphtheriae у фізіологічному розчині (використовується промисловий штам C.diphtheriae var. 9 gravis, tox+, massachussets), котра містить не менш як 14×10 КУО/мл та виготовлена з добової культури патогену, вирощеної на 10 % сироватковому агарі. Щоденне бактеріологічне дослідження слизу носових ходів заражених тварин проводять впродовж двох тижнів. Після припинення персистенції C.diphtheriae у носовій порожнині піддослідних тварин, здійснюють статистичну оцінку висіваності патогену в дослідній та контрольній групі та визначають вплив досліджуваного препарату (дифтерійного або іншого препарату будь-якого походження, котрий випробовується як фактор, що має підвищувати колонізаційну резистентність до збудника дифтерії) на резистентність слизових оболонок кролів до збудника дифтерії. Таким чином, запропонований спосіб дає можливість в експерименті дослідити та оцінити ступінь колонізаційної резистентності слизових оболонок дихальних шляхів кролів до збудника дифтерії при введенні їм дифтерійного бактерійного антигенного препарату. Джерела інформації: 1. Абатуров, А.Е. Молекулярные механизмы неспецифической защиты респираторного тракта: распознавание патоген-ассоциированных молекулярных структур / А.Е. Абатуров // Журнал "Здоровье ребенка" 2(2) 2006. - Режим доступу: http://www.mif-ua.com/archive/article/978. 2. Бактериальные заболевания кроликов. Инфекционный ринит (заразный насморк). Часть 1, 2 [Електронний ресурс]// Режим доступу: http://fermer.ru/book/export/html/52311. 3. Интизаров, М.М. Микрофлора тела животных / М.М. Интизаров // Ветеринарная медицина. - Режим доступу: http://www.allvet.ru/articles/article58.php. 4. О роли антибактериального фактора в иммунитете против дифтерийной инфекции /А.А. Триполитова// Труды Томского НИИ вакцин и сывороток. - Томск, 1955. - Т. VI. - С. 343-349. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 Спосіб моделювання транзиторного дифтерійного бактеріоносійства, що включає зараження збудником дифтерії піддослідних тварин, який відрізняється тим, що кролів інтраназально 9 інфікують суспензією C. diphtheriae концентрацією 14×10 KУО/мл, впродовж двох тижнів проводять щоденний бактеріологічний моніторинг елімінації C. diphtheriae зі слизу носових ходів та за динамікою висіваності патогену визначають вплив досліджуваного препарату на резистентність слизових оболонок до збудника дифтерії. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2