Спосіб отримання бактерійного дифтерійного антигену

Реферат: Спосіб отримання бактерійного дифтерійного антигену включає дію на вихідний продукт як біомасу штаму C.diphtheriae, дезінтеграцію мікробних клітин ультразвуковими хвилями, розділяння дезінтеграту, видалення незруйнованих клітин та їх фрагментів шляхом центрифуговання та теплову обробку препарату. Як вихідний продукт використовують біомасу промислової культури токсикогенного штаму C.diphtheriae, яку витримують в гіпертонічному 20 % сольовому розчині хлориду натрію, дезінтегрують ультразвуковими хвилями, центрифугують при частоті не менш 3000 g, розділяють дезінтеграт, відокремлюють розчинні поверхневі антигени, що містяться в супернатанті, фільтрують, концентрують випарюванням та інактивують. UA 86891 U (12) UA 86891 U UA 86891 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медичної мікробіології та вакцинопрофілактики і може бути використана для конструювання комплексної дифтерійної вакцини з підвищеною імуногенністю. Останній епідемічний підйом дифтерії, який охопив територію країн СНД у 90-ті роки минулого сторіччя, примушує вчених продовжувати пошуки шляхів підвищення ефективності профілактики дифтерії. Підйом захворюваності в 1991-2001 pp. проходив на тлі значних показників щепленості та високої частки вакцинованих серед захворівших, а саме: дітей 74,7 %, підлітків - 86,6 %, дорослих - 43,6 %. Навіть повноцінно щеплені особи хворіли на клінічно виражені та токсичні форми дифтерії. Більшість захворівших із груп ризику (60 %) були щепленими [1]. За період розвитку епідемії зареєстровано 690 летальних випадків від дифтерійної інфекції, серед яких щепленими були 196 дорослих (28,4 %) і 97 дітей (14,0 %) [2]. В 1996 р. цей показник серед померлих від дифтерії дорослих досягнув 35,5 %, причому 12,7 % з них були щеплені проти дифтерії тричі. Українські дослідники дійшли висновку про відсутність впливу на рівень захворюваності на дифтерію у епідемічний період 90-х років первинного щеплювального комплексу, що непрямим чином свідчить про його недостатню ефективність [1]. Результати серологічного моніторингу за станом колективного антитоксичного імунітету підтверджують дані епідеміологічного аналізу [1]. Навіть після вакцинації та першої ревакцинації близько 20 % дітей, у яких сформувався імунітет до правця, не мали імунітету до дифтерії на захисному рівні, що може свідчити про недостатність імуногенності дифтерійного компонента у АКДП-вакцині [1]. Серед причин захворюваності на дифтерію щеплених дітей автори називають можливе використання препаратів з недостатнім антигенним навантаженням, недостатню імуногенність препаратів, що використовують, порушення схем імунізації, порушення імунного статусу дітей та певний відсоток істинно рефрактерних дітей [1-4]. Отже доцільним стає подальший пошук інших шляхів покращення специфічної імунопрофілактики дифтерії, в тому числі за рахунок розробки нових, удосконалених безпечних вакцинних препаратів з підвищеною імуногенністю. Сучасні специфічні профілактичні вакцинні препарати проти дифтерії, представлені дифтерійним анатоксином у складі різних багатокомпонентних вакцин, спрямовані на стимулювання специфічного антитоксичного імунітету [5]. Однією з сучасних тенденцій розвитку науки з проблем удосконалення вакцинних препаратів проти патогенних бактерій є заміна хімічних методів одержання антигенів з протективними та ад'ювантними властивостями на фізичні, при застосуванні яких легше досягти стандартних умов дезінтеграції мікробних клітин, відпадає необхідність в проведенні коштозатратних операцій по очищенню виділених антигенів від хімічних реагентів, а також відкриваються перспективи налагодження випуску нативних, хімічно не змінених, а значить більш специфічних, вакцинних препаратів. При цьому пропонується застосування ультразвукової дезінтеграції, молекулярних сит, бактеріологічних та імунологічних методів. Активно вивчаються методи ультразвукової інактивації мікробів за допомогою озвучення під тиском при різних температурних режимах. Розроблені й комбіновані способи дезінтеграції бактерій, які поєднують фізичні та хімічні методи [6, 7]. Відомий хімічний спосіб одержання дифтерійних антигенів шляхом виділення розчинних мембранних білків клітинних стінок коринебактерій [8], що містять низку білків та ферментів, які підвищують антибактеріальний імунітет. Ціллю вказаної роботи є визначення імунологічних характеристик розчинних мембранних білків. Спосіб здійснюють таким чином. Клітинні стінки коринбактерій одержують шляхом дезінтеграції мікробної маси ультразвуковими хвилями і наступного диференціального центрифугування. Для виділення мембранних білків використовують метод екстракції неіонним детергентом NH-40 /Англія/ Екстракцію провадять на холоді впродовж 14 годин. Надосадову рідину видаляють центрифугованням з частотою 10 000 g впродовж 20 хвилин. Білки осаджують з надосадової рідини 70 % трихлороцтовою кислотою з наступним центрифугуванням. Білки декілька разів відмивають у фізіологічному розчині, характеризують за молекулярною масою і визначають ті з них, які забезпечують найбільш ефективний антибактеріальний імунітет. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі для отримання бактерійного дифтерійного антигену шляхом виділення розчинних мембранних білків мікробну біомасу дезінтегрують ультразвуковими хвилями, центрифугують і виділяють мембранні білки з надосадової рідини. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є використання для виділення мембранних білків хімічних реагентів, що можуть неконтрольовано змінювати параметри білків, необхідність використання високовартісного обладнання, а також складність і багатоетапність способу. 1 UA 86891 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відомий спосіб одержання імуногенного препарату з YERSINIA PESTIS EV, який може бути використаний в мікробіології та імунології при виробництві хімічної вакцини [7]. Згідно з відомим способом мікробні клітини збудника хвороби доводять до потрібної концентрації шляхом екстрагування розчином цитавлону, двічі центрифугують: перший раз для звільнення мікробної маси від незруйнованих мікробних клітин, другий раз - для одержання осаду, який потім промивають і центрифугують. Далі одержаний осад ресуспендують у розчині дезоксихолату натрію, дезінтегрують ультразвуковими хвилями на льодовій бані, знову ресуспендують, центрифугують і ліофільно висушують. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі мікробні клітини збудника хвороби дезінтегрують ультразвуковими хвилями, центрифугують, відокремлюють розчинні поверхневі антигени і піддають їх тепловій обробці для подальшого використання. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є використання при здійсненні способу хімічних реагентів, що можуть неконтрольовано змінювати параметри білків, крім того, для здійснення способу необхідні коштозатратні операції для очищення виділених антигенів від хімічних реагентів. Найближчим аналогом є спосіб одержання препарату для підвищення неспецифічної резистентності організму [9] При здійсненні способу нетоксигенні Corinebacterium diphtheriae вирощують впродовж 16-18 годин на щільному живильному середовищі (рибний гідролізат з додаванням сироватки великої рогатої худоби) при температурі 37 °C. Потім культуру змивають рідким живильним середовищем на основі гідролізату казеїну і після 5 годин культивування вносять в робочі посудини з тим же рідким живильним середовищем і проводять впродовж 1618 годин вирощування біомаси при постійному перемішуванні при температурі 37 °C. Мікробні клітини осаджують центрифугуванням не менш ніж при 5000 g впродовж не менш як 20 хвилин і тричі промивають фізіологічним розчином при центрифугуванні в режимі не менш 5000 g впродовж не менш як 20 хвилин. Вологий осадок зважують, суспендують у забуференому фізіологічному розчині (рН 7,2) до концентрації клітин 5 %. Потім цілі клітини дезінтегрують на ультразвуковій установці впродовж 20 хвилин при частоті 20 кГц, амплітуді 14 мкм і охолодженні (льодом або водою) до 25-30 °C. Одержану після ультразвукової обробки гомогенну суспензію дезінтеграту центрифугують не менш ніж при 5000 g впродовж не менш як 20 хвилин з метою видалення незруйнованих клітин та їх фрагментів від клітинних стінок. Осад видаляють, надосадову рідину центрифугують не менш ніж при 14000 g впродовж не менш як 20 хвилин. Осад, котрий є препаратом клітинних стінок, ресуспендують у фізіологічному розчині і знову центрифугують не менш ніж при 14000 g впродовж не менш як 20 хвилин. Відмивання клітинних стінок від домішок цитоплазми і живильного середовища повторюють тричі. Відмиті клітинні стінки ресуспендують в дистильованій воді (маточний розчин). Після визначення вмісту в маточному розчині N-ацетилглюкозаміну по Елсону-Моргану його розводять до концентрації щеплювальних доз, розливають по ампулах або флаконах, після чого його піддають тепловій стерилізації при температурі 100 °C і ліофільному висушуванню. Сухий препарат - порошок білуватого кольору, після розчинення у фізіологічному розчині утворює суспензію, яка розділяється при стоянні на прозору рідину і рихлий осад, що розбивається при струшуванні. Як і в запропонованій корисній моделі, у способі-аналозі бактерійний дифтерійний антиген отримують шляхом використання антигенного препарату з штаму C.diphtheriae, дезінтеграції клітин ультразвуковими хвилями, розділення дезінтеграту шляхом центрифугування, видалення незруйнованих клітин та їх фрагментів та теплової обробки кінцевого продукту. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є використання для одержання антигену клітинних стінок мікробів, дезінтеграцію потужними ультразвуковими хвилями, що призводить (навіть при охолодженні) (25-30 °C.) до перегрівання матеріалу і, як наслідок, до неконтрольованої зміни параметрів препарату. Крім того, у відомому способі використовують теплову стерилізацію при 100 °C та леофілізацію висушуванням, що призводить до пошкодження тонкої поверхневої структури поверхневих антигенів, знижуючи їх специфічність. В основу корисної моделі поставлена задача створення способу отримання бактерійного дифтерійного антигену з ад'ювантними властивостями щодо дифтерійного анатоксину. Технічний результат, який може бути одержаний при використанні запропонованого способу, полягає в збільшенні кількості розчинних поверхневих антигенів і за рахунок цього посиленні впливу на формування гуморального антитоксичного імунітету не лише прямим застосуванням дифтерійного анатоксину, але й підсиленні його дії шляхом уведення до його складу безпечного, нетоксичного ад'юванту, виготовленого з бактеріальних субклітинних 2 UA 86891 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 антигенних комплексів епідемічних штамів збудника дифтерії, який забезпечує більш повний контакт вакцини з різними елементами імунної системи макроорганізму. Крім того технічний результат полягає в посиленні нативних специфічних властивостей дифтерійного анатоксину. Поставлена задача вирішується тим, що в способі отримання дифтерійного антигену шляхом використання як вихідного продукту біомаси штамму C.diphtheriae, дезінтеграції мікробних клітин ультразвуковими хвилями, розділення дезінтеграту шляхом центрифуговання, видалення незруйнованих клітин та їх фрагментів та теплової обробки кінцевого продукту, як вихідний продукт використовують біомасу промислової культури токсигенного штаму C.diphtheriae, яку піддають гіперосмотичному шоку при витримуванні клітин у 20 % сольовому розчині натрію хлориду, дезінтегрують ультразвуковими хвилями впродовж 1-3 періодів по 4-7 годин кожний, центрифугують при частоті не менш як 3000 g впродовж 30 хвилин, розділяють дезінтеграт, відокремлюють розчинні поверхневі антигени, що містяться в супернатанті, фільтрують, доводять до потрібної концентрації та інактивують при (56-5 °C) с впродовж 1 години. Суть запропонованої корисної моделі полягає також в тому, що виділені з супернатанту розчинні поверхневі антигени концентрують шляхом випарювання до ½ об'єму. Суть запропонованої корисної моделі полягає також в тому, що для підвищення чистоти продукту перед інактивацією виконують його гель-хромотографування. Суть запропонованої корисної моделі полягає також в тому, що для збільшення концентрації розчинних поверхневих антигенів у кінцевому продукті, об'єднують 3-5 порції виділеного супернатанту. Суть запропонованої корисної моделі полягає в тому, що дезінтеграцію мікробних клітин виконують ультразвуковим приладом УСУ-0707 (ТУ 3468-001-42369179-03). Суть запропонованої корисної моделі полягає в тому, що виділені фракції мембранних білків фільтрують через фільтри "Владіпор" типу НФАС (ТУ 6-55-221-879-88). Запропонована корисна модель відрізняється від прототипу тим, що як вихідний продукт використовують біомасу промислової культури токсигенного штаму C.diphtheriae, яку піддають гіперосмотичному шоку при витримуванні клітин у 20 % сольовому розчині натрію хлориду, дезінтегрують ультразвуковими хвилями впродовж 1-3 періодів по 4-7 годин кожний, центрифугують при частоті не менш як 3000 g впродовж 30 хвилин, розділяють дезінтеграт, відокремлюють розчинні поверхневі антигени, що містяться в супернатанті, фільтрують, доводять до потрібної концентрації та інактивують при (56-5 °C) впродовж 1 години. Запропонована корисна модель відрізняється також тим, що виділені з супернатанту розчинні поверхневі антигени концентрують шляхом випарювання до ½ об'єму. Запропонована корисна модель відрізняється також тим, що для підвищення чистоти продукту перед інактивацією виконують його гель-хромотографування. Запропонована корисна модель відрізняється також тим, що для збільшення концентрації розчинних поверхневих антигенів у кінцевому продукті об'єднують 3-5 порції виділеного супернатанту. Запропонована корисна модель відрізняється також тим, що дезінтеграцію розчинних поверхневих антигенів виконують ультразвуковим приладом УСУ-0707 (ТУ 3468-001-4236917903). Запропонована корисна модель відрізняється також тим, що виділені розчинні поверхневі антигени фільтрують через фільтри "Владіпор" типу МФАС (ТУ 6-55-221-879-88). Між суттєвими ознаками запропонованої корисної моделі і технічним результатом, який може бути досягнутий при її здійсненні, існує такий причинно-наслідковий зв'язок. Застосування гіперосмотичного шоку при отриманні бактерійного дифтерійного антигену з промислової культури токсигенного штаму C.diphtheriae створює умови для збільшення біодосягненості цитоплазм мікробних клітин, що в сукупністю з дезінтеграцією ультразвуковими хвилями середньої частоти при невисокій потужності, яку повторюють 1-3 рази впродовж 4-7 годин кожного разу, розділення порцій дезінтеграту з послідовним відокремленням супернатанту та інактивацією в інактиваторі при температурі (52-56 °C) впродовж 1 години створює умови для м'якого неруйнівного режиму одержання антигенного препарату нативних поверхневих антигенів з ад'ювантними властивостями щодо анатоксину дифтерії. Для одержання препарату більш високої чистоти, що дає можливість знизити реактогенність, його гель-хроматографують та фільтрують через фільтри "Владіпор". При цьому ступінчаста ультразвукова дезінтеграція мікробної суспензії збудника дифтерії в сукупності з концентрацією до 1/2 об'єму дозволяє суттєво підвищити концентрацію поверхневих антигенних антигенів в препараті другоготретього циклів ультразвукового опромінення. 3 UA 86891 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Запропонований спосіб здійснюється таким чином. Біомасу промислової культури токсигенного штаму C.diphtheriae, tox+, вар. gravis, massachussets (C.diphtheriae) витримують у гіпертонічному 20 % сольовому розчині хлориду натрію впродовж 12 годин, дезінтегрують ультразвуковими хвилями за допомогою ультразвукового приладу 0707 (ТУ 3468-001-4236917903) з частотою 130 кгц, потужністю 9 Вт/см впродовж 1-3 періодів по 4-7 годин кожний, центрифугують при 3000 g впродовж 30 хвилин, відокремлюють розчинні поверхневі антигени, що містяться в супернатанті, об'єднують 3-5 порцій супернатанту, фільтрують через фільтри "Владіпор" [11], концентрують шляхом випарювання до ½ об'єму та інактивують при температурі (52-56 °C) впродовж 1 години. В процесі здійснення способу контролюють вихідну концентрацію мікробної суспензії, яку експериментальним шляхом встановили рівною 3 одиницям за шкалою McFarland, оскільки: а) менша концентрація мікробних клітин після опромінення ультразвуком дає менший вихід білка (табл. 1). б) підвищення концентрації мікробних клітин понад 3 одиниці за шкалою McFarland після опромінення ультразвуком не призводить до суттєвого підвищення рівня білка (табл. 1). Тривалість опромінення ультразвуковими хвилями визначена як часова експозиція впродовж 1-3 періодів по 4-7 годин кожний, оскільки: б) оптимальним є опромінення впродовж 7 годин, оскільки 1-6 годинне опромінення викликає достовірно нижчий ефект у порівнянні з 7-годинною експозицією; подовження часу опромінення не призводить до статистично значущого збільшення кількості виділених білкових комплексів і на характер отриманого технічного результату не впливає (табл. 2). в) ступінчаста ультразвукова дезінтеграція мікробної суспензії збудника дифтерії дозволяє суттєво підвищити концентрацію білка у антигенному препараті другого-третього циклу УЗопромінення. В антигенних препаратах наступних циклів концентрація білка істотно знижується (табл. 3). Таким чином, ознаками, що впливають на досягнення технічного результату, а саме: отримання антигенного препарату нативних поверхневих антигенів з мікробних клітин токсигенного штаму C.diphtheriae з ад'ювантними властивостями щодо дифтерійного 2 анатоксину із застосуванням ультразвукових коливань середніх частот (130 кГц; 9 Вт/см ) є експозиція обробки - впродовж 4-7 годин, яку повторюють 1-3 рази для підвищення концентрації розчинних поверхневих антигенів в препараті. Дані ад'ювантної дії одержаного антигенного препарату наведені в прикладах. Приклади здійснення корисної моделі Приклад 1 Визначення антигенних властивостей досліджуваних препаратів субклітинних комплексів проводилося з випробовуванням наступних варіантів: (1) тварини одержували підшкірно очищений концентрований (несорбований) дифтерійний анатоксин (контроль); (2) тварин імунізували досліджуваними препаратами порівняння: вбитою формаліном цільноклітинною дифтерійною вакциною, мікробним дезінтегратом, препаратами клітинних стінок збудника дифтерії та супернатантом, що містив розчинні поверхневі антигени. В таблиці 4 представлені середні показники щотижневого рівня титрів антитоксичного дифтерійного імунітету впродовж місяця після імунізації (табл. 4). Щеплення монопрепаратом очищеного концентрованого дифтерійного анатоксину в дозі 20 Lf (контроль) не призвело до формування антитоксичного гуморального імунітету в тварин. Вбита формаліном цільноклітинна дифтерійна вакцина, як найбільш повноцінний в антигенному відношенні препарат, вже через тиждень після щеплення стимулювала антитоксичний імунітет до середнього рівня 1,5 МО/мл, який впродовж місяця поступово знизився до рівня 0,5 МО/мл. Введення нерозведеного мікробного дезінтеграту істотно стимулювало утворення антитоксинів - на третьому тижні титр антитіл збільшився від початкового 0,03 до 16,0 МО/мл, але в подальшому різко впав. Застосування препаратів клітинних стінок та розведеного (1:2000) супернатанту дезінтегрованих мікробних клітин дифтерії призводило до епізодичної (одно-дворазової) появи мінімального титру антитоксичних антитіл 0,03 МО/мл. Приклад 2 Визначення ад'ювантних властивостей досліджуваних препаратів субклітнних комплексів проводилося з використанням принципової схеми парентеральної імунізації піддослідних кролів комбінованими препаратами, до складу котрих були уведені очищений концентрований (несорбований) дифтерійний анатоксин та відповідний антигенний препарат мікробних клітин (ад'ювант). 4 UA 86891 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Випробовування ад'ювантної дії вказаних антигенних препаратів мікробних клітин C.diphtheriae в комбінації з очищеним концентрованим дифтерійним анатоксином (АД) показало результати, представлені в таблиці 5 (табл. 5). Найбільші титри протидифтерійних антитоксинів показала комбінація дезінтеграту мікробних клітин C.diphtheriae (ДЗ), розведеного 1:1000, з дифтерійним анатоксином: до третьогочетвертого тижня результати РПГА досягли високого рівня - 16,0 МО/мл. Препарат клітинних стінок серії 2 разом із дифтерійним анатоксином викликав формування значно менш напруженого, але захисного титру антитіл - від 0,5 до 1,0 МО/мл на 2-3-му тижні, який надалі знизився до 0,25 МО/мл. Швидке збільшення рівня антитіл виявила комбінація розведеного 1:2 супернатанту (СН) із дифтерійним анатоксином: через тиждень після імунізації рівень імунітету складав 0,5 МО/мл, на другому тижні він досяг значення 4,0 МО/мл, а надалі стабілізувався на рівні 2,0 МО/мл. Препарат СН, розведений 1:2000, в комбінації з тією ж дозою анатоксину показав мінімальні рівні імунітету - 0,03 МО/мл - на другому та четвертому тижні. Отже, якщо порівнювати дані таблиць 1 і 2, то очевидно, що введення будь-якого з досліджуваних бактерійних препаратів разом із дифтерійним анатоксином до складу вакцини в усіх випадках призводить до стимулювання, хоча і в різній мірі, гуморального антитоксичного імунітету. Найбільш стабільні рівні захисних титрів показала комбінація анатоксину з препаратом СН (1:2). Приклад 3 Введення досліджуваних антигенних препаратів-ад'ювантів у склад комбінованої протидифтерійної вакцини дозволяє суттєво зменшити дозу дифтерійного анатоксину. В таблиці 6 наведені результати РПГА, одержані при зменшенні дози очищеного концентрованого дифтерійного анатоксину у 10 разів та офіцинальної вакцини АД-м у 20 разів (табл. 6). Додавання антигенних препаратів ДЗ (цільного та розведеного 1:2,5) до 2 Lf очищеного концентрованого дифтерійного анатоксину в дозі 1,0 мл призвело до появи захисних титрів РПГА, починаючи з першого тижня після імунізації (від 0,5 до 2,0 МО/мл). Якщо вказаний препарат ДЗ у зменшеній дозі (0,5 мл) додавали до розведеної в 5 разів офіцинальної вакцини АД-м (1 Lf), рівень антитоксинів з другого тижня імунізації досяг 4,0 МО/мл, і надалі зберігав захисний рівень. У тварин, вакцинованих з додаванням до 1 Lf офіцинальної вакцини АД-м 0,5 мл препарату СН та 0,1 мл препарату СН-ф, результати імунізації комбінованим препаратом виявились найбільш переконливими: титри протидифтерійних антитіл досягли стабільних високих показників - 4,0-8,0 МО/мл. Приклад 4 Основними вимогами до якості вакцин є поєднання їх ефективності та нешкідливості [5, 10]. В таблиці 7 представлені результати вивчення специфічної безпечності досліджуваних антигенних препаратів шляхом постановки внутрішньошкірної проби кролям (табл. 7). Взагалі піддослідні тварини почувалися добре - були жвавими, активно споживали їжу. Впродовж перших 4-х днів спостереження найбільшу реактогенність продемонстрував препарат ДЗ. Порівняння реактогенності препаратів СН та СН-ф показало, що фільтрування препарату СН через фільтри "Владіпор" значно знизило ступінь проявів шкірних реакцій: лише в одному випадку його введення було зареєстровано транзиторне почервоніння в місці ін'єкції. Проте, незважаючи на закінчення чотириденного регламентованого строку спостереження за розвитком шкірних реакцій при вивченні специфічної безпечності, продовження цього терміну дало можливість виявити віддалені шкірні прояви реактогенності досліджуваних препаратів. Найбільшу кількість виражених стійких шкірних реакцій дав саме препарат ДЗ. Реакції на вбиту формалінізовану дифтерійну вакцину на препарат клітинних стінок у віддалені строки редукувалися. Шкірні реакції на 8-9-й день у вигляді гіперемії та інфільтрації з'явилися і на препарат СН-ф. Приклад 5 Розведення препарату СН 1:2 дозволило знизити його реактогенність, ад'ювантні властивості при цьому збереглися (табл. 8). Приклад 6 Застосування гель-хроматографії для очищення препарату СН-ф дало можливість виділити фракцію протеїнів з молекулярню масою понад 13 тис. дальтон, питома вага якої в середньому перевищувала 50 %, та низькомолекулярні фракції від 1 до 10 тис. дальтон, на які приходилося одиничні відсотки в загальному складі виділених фракцій. Імунізація монопрепаратами вказаних фракцій не призвела до появи антитоксинів у крові тварин. Випробовування їх ад'ювантної дії 5 UA 86891 U 5 10 15 20 25 30 35 40 щодо дифтерійного анатоксину показало, що основна з них - фракція протеїнів з молекулярною масою понад 13 тис. Да - здатна активно стимулювати антитоксичний імунітет при сумісному з дифтерійним анатоксином їх введені лабораторним тваринам (табл. 9). Приклад 7 Постановка реакції імунолейкоцитолізу нейтрофілів крові тварин при інкубації з досліджуваними антигенними препаратами in vitro, показало відсутність сенсибілізуючої дії очищеної антигенної фракції з молекулярою масою понад 13 тис. Да, (t