Спосіб виявлення helicobacter pylori у біопаті жовчного міхура

Спосіб виявлення Helicobacter pylori (H. pylori) у біоптаті жовчного міхура, який включає 3 11681 4 діагностики широкого спектру інфекційних агенрі. Контрастування ядер клітин та загальної струтів, включаючи гелікобактерної інфекції [4]. Однак ктури проводиться гематоксиліном Маєра на пров своїй більшості вони не є абсолютними, оскільтязі 1 хвилини з послідуючим розвитком окрасу ки можуть свідчити про також неактивну інфекза допомогою водопровідної води. Після дегідраційну інвазію, бактеріоносійство чи про перенесетації та заключения зрізу під покровне шкло прону інфекцію в минулому. Фактично, дані методи водиться світлова мікроскопія, якою виявляються оцінюють, чи зустрічалась імунна система людизвиті форми бактрій, позитивних на ДАБ (корични з гелікобактерною інфекцією досі і не дають невого кольору). Недоліком даного методу являоцінки ступеню та локалізації патологічного проється те, що цей метод використовує антитіла до цесу. всього антигенного спектру (мембранних та цитоМетод уреазного теста, або дихальний тест у зальних бактеріальних антигенів, серед останніх різних його модифікаціях, залишається найпопуіснує велика вирогідність перехресної реакції на лярнішим методом з часів відкриття бактерії Н. загальні/спільні антигени). Крім того гіперосмоляpylori австралійським вченим Маршаллом рні умови жовчного середовища, умови фіксу(Marshall) [1]. Йому також і належить первинне вання та дегідратація тканини призводить до авторство класичної модифікації тесту на гелікоприховування антигена, що ускладнює діагностибактерну інфекцію за допомогою уреазної реакції. ку. Даний метод являє собою найдешевший, досить В основу корисної моделі поставлене занадійний та легкий у виконанні для скринінгу вевдання розробити такий спосіб виявлення Н. ликої кількості людей. Він є одним з основних pylori, у якому нове застосування дій дозволило б методів рекомендованих погоджувальним рапорпідвищити специфічність імунологічної реакції, том Maastricht 2-2000 для дігностики Н. pylori при дозволить відкрити (демаскувати) антиген для патології шлунку та дванадцятипалої кишки. Мевільного доступу бути зайденим за допомогою тод обмежений тим, що не може знаходити інші антитіл та підібрати оптимальні умови проведенвиди гелікобактерної інфекції, що не має уреазної ня іммуногістохімічної реакції для виявлення Н. активності, а також обмежений у використанні з pylori на зрізах жовчного міхура. матерілом жовчі чи біоптатами жовчних міхурів, Поставлені завдання, згідно корисної моделі, що було показано в нашому власному дослідосягаються тим, що для виявлення Н. pylori в дженні. Усі пацієнти в незалежності від присутнобіоптатах жовчного міхура застосовуються: сті Н. pylori у біліарній системі демострували різ(а) анти-Н. pylori антитіла, попередньо очину ступінь позитивності тесту (від + до +++), що щені за допомогою абсорбції з повним спектром скоріше за все пов'язано з обмеженням метода антигенів бактерій Campylobacterjejuni, за pH середовища біологічного біоптата. Escherichia coli, Helicobacter hepaticus та До класичних молекулярних методів відноHelicobacter bills; ситься ДНК-діагностика методом полімеразної (6) демаскування антигену за допомогою хіланцюгової реакції, що безумовно являє одну з міко-фізичного впливу на зрізи тканини. Таким найбільш специфічних, але при цьому потребує чином, поліклональні анти-Н. pylori антитіла значних фінансових затрат, знань та досвіду в цій (DAKO) абсорбуються з тотальним бактеріальобласті. ним екстрактом вищеозначених бактерій у відноЗапропонований нами метод імуногістохімічшенні 100мкг бактеріального білка на 10мкг імуного виявлення бактерій Н. pylori в біоптатах жоноглобулінів таким чином, щоб загальне вчного міхура основується на тому, що бактерія співвідношення по об'єму становило не більше Н. pylori може бути діагностована в зрізах біотатів 1:10 (антитіла до бактеріального екстракта відпожовчного міхура після проведенної холецистеквідно). Тотальний бактеріальний екстракт може томії за допомогою специфічних антитіл. бути придбаний готовим до примінення в Найближчим аналогом запропонованого наAmerican Tissue Cell Culture (ATCC), або виготовми імуногістохімічного методу є метод, що виколений самостійно шляхом нарощування бактеріристується для діагностики Н. pylori в шлунку [7]. льної маси бактерій Escherichia coli (штамм Цей метод включає використання комерційних MC6RP1), Helicobacter hepaticus (штамм CCUG анти-Н. pylori антитіл (DAKO A/S, Glostrup, 33637), Helicobacter bills (штамм CCUG 38995), Denmark), виготовлення парафінових зрізів Campylobacter jejuni (штамм АТСС 33560) з пос(5мкм) та гібридизацію потенційних бактеріальлідуючим 3-5 кратним заморожуваннямних антигенів на зрізі за допомогою вищезгадаразморожуванням (від -20°С до +4°С) у фосфатних антитіл в титрі 1:500-1:1000 на протязі 16 ному буфері. Процес абсорбції проходить при годин при 4°С. постійному помішуванні або похитуванні при темДалі первинні антитіла знаходились за допопературі +4°С. Антиген з абсорбованими неспемогою анти-кролячими антитілами, міченими біоцифічними антитілами відділяється шляхом тином (Zymed Laboratories, Inc, San Francisco, центрифугування при 80000-100000 х g на протяCA) в титрі 1:500 (2 години при кімнатній темпезі 30 хвилин при +4°С. ратурі) й останні знаходились за допомогою Демаскування антигенів бактерій в зрізах жострептавідину, міченого пероксидазою хріна вчного міхура досягається шляхом мікрохвильо(Zymed) в титрі 1:500 (0.5 години при кімнатній вої обробки зрізів у 10mM цитратном буфері (2.1 температурі) і реакція проявлялась з сумішу грами лимонної кислоти на 400мл дистильованої 0,005% діамінобензидина (ДАБ), 0.03% пероксид води, рН=6,0 доведена за допомогою титрування водню в водному розчині під візуальним контро1М розчином їдкого натру - NaOH). В зв'язку з лем на протязі 5 хвилин при кімнатній температутим, що даний метод досить агресивний і демас 5 11681 6 кує всі, в тому числі неспецифічні, антигени, після гібридизацію потенційних бактеріальних антигетакої процедури рекомендується блокування ненів на зрізі за допомогою вищезгаданих преабсоспецифічного зв'язування первинних антитіл порбованих антитіл в титрі 1:25-1:50 на протязі 16 передніми інкубаціями з одним із перелікованих годин при 4°С. Далі первинні антитіла знаходятьрозчинів: ся за допомогою анти-кролячих антитіл, міченими 10% бичий сироваточний альбумін (БСА) в біотином (Zymed Laboratories, Inc. San Francisco, фосфатному буфері; CA) в титрі 1:500 (2 години при кімнатній темпе5% розчин молока, 10% БСА в фосфатному ратурі) й останні знаходились за допомогою буфері; стрептавідину, міченого перксидазою хріна 1-2% розчин козлячої сироватки (або 100(Zymed) в титрі 1:500 (0,5 години при кімнатній 200мкг/мл неспецифічних імуноглобулінів козлятемпературі) і реакція проявлялась 0,005% ДАБ, чої сироватки. 0,03% пероксид водню в водному розчині під віЗастосування даних доповнюючих методик зуальним контролем на протязі 5 хвилин при кімдозволяє підвищити специфічність та значно піднатній температурі. Після дегідратації висхідними вищити чутливість діагностики Н. pylori, що роспиртами та заключения зрізу під покровне скло бить можливим виявлення бактерій у зрізах жовпроводиться світлова мікроскопія, якою виявлячних міхурів. ються звиті форми бактерій, позитивних на ДАБ При співставленні ознак найближчий аналогу (коричневого кольору). та способу, що заявляється виявлені загальні Спосіб виявлення Н. pylori, що заявляється, ознаки; використано в умовах лабораторії патоморфоло- виготовлення гістологічних парафінових зрігії та діагностичного відділу Інститута гастроензів тканини згідно стандартній гістологічні метотерології АМН України при дослідженні 72 хворих диці; на ЖКХ. Біоптати слизової облонки жовчного мі- блокування ендогенної перокидази 0,5% рохура, що взято після холецитсектомії досліджузчином перкосиду водню; вали заявленим способом. У 51 хворого виявлені - гібридизація антитіл до Н. pylori з потенційДАБ-позитивні бактерії, що свідчить про наявним антигеном на зрізі тканини; ність Н. pylori. У решти 11 хворих бактерії знай- виявлення первинних анитіл за допомогою дені не. У 53 випадках Н. pylori було виявлено за вторинних анти-кроличих імуноглобулінів мічених допомогою ДНК діагностики в тому самому матебіотином, які в свою чергу виявляються стрептаріалі. видином міченим пероксидазою хріна, за актинісТаким чином, спосіб, що заявлено, засноватю процесингу субстрата якої (ДАБ+ пероксид ний на модифікації реакції імуногістохімії, що підводню) судять про позитивну чи негативну реаквищує специфічність та чутливість діагностики Н. цію; pylori, робить можливим його використання на - світлова мікроскопія з виявленням позитивзрізах жовчного міхура у хворих на ЖКХ, що моних (коричневого кольору) бактерій. Відмінними же бути використано для подальшого формуванознаками є: ня тактики лікування таких пацієнтів. - попередня абсорбція антитіл до повного Джерела інформації: спектру антитіл до Н. pylori неспецифічними ан1. Marshall, B.J. and J.R.Warren. Unidentified тигенами інших бактерій; curved bacilli in the stomach of patients with gastritis - демаскування антигенів бактерій на зрізі за and peptic ulceration.//Lancet.-1984.-Vol.l(8390), допомогою мікрохвильової обробки в 10mM роз1311-1315. чині цитратного буферу блокування неспецифіч2. Ю.А.Гайдар, И.И.Гриценко, Л.Н.Мосийчук и ного зв'язування анти-Нр антитіл за допомогою др.- Патогенные воздействия и симбиотические доповнюючої інкубації з блокуючим розчином. взаимоотношения Helicobacter pylori с макроорСпосіб може бути використано в охороні здоганизмом при язвенной болезни двенадцатиперровья, він промислове виконуваний. стной кишки // "Гастроентерологія". Міжвідомчий Спосіб виявлення Н. pylori у біоптатах жовчзбірник, М.Дніпропетровськ, 2000, с.41-44. них міхурів здійснюють таким чином. Попередньо підготовлюють антитіла шляхом абсорбції остан3. Ю.А.Гайдар, Е.В.Степанова, Д.В.Еркович.ніх з нативними антигенами споріднених бактеГастринпродуцирующяя система желудка при рій, описаних вище або інших, у відношенні 1:10. язвенной болезни двенадцатиперстной кишки Антиген-антитіла комплекси відділяють за допоассоциированная с Helicobacter pylori, до и после ваготомии // "Гастроентерологія". Міжвідомчий могою центрифугування при 80000-100000 gHa збірник, М.Дніпропетровськ, 2004, с.71-77. протязі 30 хвилин при +4°С. Далі виготовляють 4. H.pylori-associated gastrointestinal diseases парафінові блоки та зрізи тканини товщиною // Second edition. Published by Yandbooks in health 5мкм згідно стандартній гістологічній процедурі. care. Co.Newtown, Pennsylvania.-USA,- 2002.Після депарафінізації та поступової регідратації P.179. зрізи піддаються демаскуванню 10mM цитратним 5. Апостолов E.G., Гайдар Ю.А., Усенко B.C., буфером в мікрохвильовій печі (доведення до Корниловская И.И., Нилссон И. Роль бактерий 90°С з поступовим охолодженням при кімнаній Helicobacter pylori в развитии патологического температурі) на протязі 30 хвилин. Блокування процесса в желчном пузыре у украинских пациезрізів проходить на протязі 60 хвилин за допомонтов с хроническим холецистолитиазом: иммуногою одного із вище перерахованих розчинів (нагистохимический анализ // "Гастроентерологія". приклад 10% БСА), далі з 0.5% пероксидом водню на протязі 30 хвилин. Далі проводять 7 11681 8 Міжвідомчий збірник, М.Дніпропетровськ, 2003, YuA, Wadstrom T, Ljungh A. Helicobacter pylori and с.76-80. other Helicobacter species in gallbladder and liver of 5. Апостолов Е.О., Гайдар Ю.А., Абу Ал-Сауд patients with chronic cholecystitis detected by В., Корниловская И.Н., Нилссон И., Вадстром Т. immunological and molecular methods. Scan J Участие микроорганзмов рода Helicobacter в разGastroenetrology, 2005, 40:96-102. витии воспаительного процесса в желчном пузы7. К.S.Graham, D.Y.Graham.Y.- Contemporary ре при хроническом холецистолитиазе: морфоdiagnosis and management of H.pylori-associated лоические и молекулярные аспекты // gastrointestinal diseases. 2002. p. 179 "Гастроентерологія". Міжвідомчий збірник, 8. Fox, J.G., D.B.Schauer, and T.Wadstrom. М.Дніпропетровськ, 2003, с, 69-75. Enterohepatic Helicobacter species. // Curr Opin 6. Apostolov EO, Abu Al-Soud W, Nilsson I., GastroenteroL-200L-Vol.17,. №Suppl. 1.-P.S28Komilovs'ka IN, Usenko VS, Lyzogubov VV, Gaydar S31. Комп’ютерна верстка Н. Лисенко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601