Спосіб виявлення helicobacter pylori у біоптатах

Спосіб виявлення Hehcobacter pylori у біоптаті, який включає розміщення біоптату в буферному розчині з індикаторним середовищем і сечовиною, експозицію біоптату в ньому протягом ЗО хвилин, однієї, трьох та 24 годин, який відрізняється тим, що застосовується індикаторне середовище у вигляді ліофілізату, розміщеного на дні лунок планшета, який перед дослідженням розводять у 10 разів, експонують планшет при кімнатній температурі, оцінюють колір індикаторного середовища протягом його експозиції, і зміна кольору середовища свідчить про наявність Helicobacter pylori в біоптаті. Запропанований спосіб належить до медицини, а саме до способів діагностики і може бути використаний для виявлення у біоптатах мікроорганізмів Helicobacter pylori (Нр), яким властива уреазна активність. Мікроорганізми Нр вперше були виявлені у 1983 році в біоптатах слизової оболонки шлунка у хворих на хронічний гастрит. Дослідженнями встановлено, що у хворих на виразкову хворобу дванадцятипалої кишки Нр виявляється у 76-100%, а хворих з гіпоацидним гастритом у 92% випадків [1,2]. Нр обтяжує перебіг цих захворювань, знижує ефективність їх лікування, викликає часте рецидування. Тому розробка швидких та надійних способів виявлення Нр є важливим завданням. Відомі ряд прямі та непрямі способи виявлення Нр. До числа прямих способів відносять бактеріоскопію з використання фарбування біосубстратів. Виявлення S-подібної палочки засвідчує про інфікованість Нр [3]. Цей спосіб недостатньо точний, ІНОДІ дає похибні результати. Методом золотого стандарту залишається бактеріологічний посів біоматериалів, гістологічне дослідження бюптатів, імуногістохімічне забарвлення зрізів біоптатїв, полімеразно-ланцюгова реакція, імуноблоттінг [4]. Але ці ви ще переліковані методи потребують спеціальних навиків, дорого обпадання, відносно великих матеріальних витрат. До непрямих способів виявлення Нр відносять уреазний тест, в його різноманітних варіантах, який використовує здібність Нр виділяти фермент уреазу, яка розщепляє мочовину на аміак та вуг лекислий газ. В умовах біоптатного уреазного теста, аміак, змінює умови середовища в лужну сторону, а індикатор, який знаходиться у середовищі, змінює її колір. Зміна кольору середовища дає змогу судити про наявність у досліджувальному матеріалі Нр .Відомий спосіб виявлення Нр [5] з використанням мочовини, фенолового червоного, натрієвих солей фосфорної кислоти, води, консервант. Спосіб здійснюється таким чином. У лунку планшета вносять індикаторне середовище, індикаторне середовище такого складу, мочовина 10,0г, феноловий червоний 0,5% р-н - 50,0мл, однозаміщена натрієва сіль фосфорної кислоти 0,218г, двохзаміщена натрієва сіль фосфорної кислоти - 0,51, азід натрію або мертіолят - ЮОмг, дистильована вода - 450мл. В середовище розведене в 20 разів дістілірованою водою занурюють бюптат і залишають при 37°С до 24 годин. Оцінюють результат через ЗО хвилин, одну, три та 24 години. Зміна кольору свідчить про те, що тест позитивний. Цей способ, як найбільш близький за технічною суттю та ефекту, який досягається, прийнятий нами за прототип. Недоліком способу є використання у планшеті дози водного тест-розчину, що суттєво не скорочує термін застосування біоптатного уреазного теста. В основу корисної моделі поставлене завдання розробити такий спосіб виявлення Нр, у якому нове застосування дій дозволило б підвищити термін зберігання тесту, зробити його економним, та СО О) 7996 більш чітко визначити зміну кольору індикаторного середовища. Поставлене завдання, згідно предмету корисної моделі, досягається тим, що для виявлення Нр в біоптатах застосовується планшет в якому заздалегідь розміщено люфіпізоване індикаторне середовище, яке розчинюють дистильованою водою в 10 разів безпосередньо перед дослідженням. Далі, при кімнатній температурі, у лунки з водним розчином занурюють досліджувані біоптати. Результат оцінюють на протязі 24 годин. Зміна кольору середовища від жовтогарячого до рожевого свідчить про наявність у біоптаті Нр. Застосування ліофілізованного індикаторного середовища дозволяє підвищити термін зберігання уреазного біоптатного теста до двух років і більше. Для економічного використування і спрощення оцінки результату теста, індикаторне середовище розводять у 10 разів, а експонують біоптат в середовищі при кімнатних умовах. При співставленні ознак прототипу та способу, що заявляється виявлені загальні ознаки: - розміщення біоптату у індикаторному середовищі, який містить мочовину, індикатор - забарвник, буферний розчин та консервант, - експозицію біосубстрату в індикаторному середовищі здійснюється до 24 годин/ Відмінними ознаками є: - у планшеті - використовується ліофілізованє індикаторне середовище, що робить тест зручнішим та пролонгує термін використання теста, індікаторне середовище перед використанням розводять у 10 разів, - експозицію біоптату у середовищі виконують при кімнатних умовах. Сполучення відомих та відмінних ознак, що характеризують заявлений спосіб, не виявлено у відомій техніці, а сутність способу явно не витікає з відомого рівня техніки. Таким чином, заявлений спосіб відповідає критеріям патентоспроможності "новизна" І "винахідницький рівень". Спосіб може бути використано в охороні здоровья, він промислове виконуваний. Спосіб виявлення Нр у біоптатах здійснюють таким чином. Попередньо готують індикаторне середовище такого складу, мочовина 10,0г, феноловий червоний 0,5% р-н - 50,0мл, однозаміщена натрієва сіль фосфорної кислоти - 0,218г, двохзаміщена натрієва сіль фосфорної кислоти - 0,51, азід натрію або мертіолят - ЮОмг, дистильована вода - 450мл. Отримане середовище може зберігатись довгий час. На дно кожної лунки планшета наносять по Комп'ютерна верстка А. Рябко 20мкл індикаторного середовища, планшет розміщують в термостат при 45 градусах по Цельсію на 8 годин, для люфіпізування розчину. Перед дослідженням, в кожну лунку планшета вносять по 0,2 мл дистильованої води. Потім у лунку з середовищем занурюють досліджувані бюптати слизової оболонки шлунка. Результат оцінюють через ЗО хвилин, одну, три і 24 години. Перехід кольору середовища від жовтогарячого до рожевого свідчить про наявність у біоптаті Нр. Спосіб виявлення Нр, що заявляється, використано в умовах лабораторії патоморфології та діагностичного відділу Інститута гастроентерології АМН України при дослідженні 120 хворих на виразкову хворобу дванадцятипалої кишки. Біоптати слизової облонки шлунка та дванадцятипалої кишки, що взято під час фіброгастродуоденоскопії досліджували заявленим способом. У 100 хворих виявлена уреазна активність біоптатів, яка свідчить про наявність Нр. У 20 хворих уреазна активність не виявлена. У тих самих 100 хворих при мікроскопії були виявлені Нр у мазках-відбитках біоптатів зафарблених азур-еозином. Таким чином, спосіб, що заявлено, заснований на використанні ліофілізованого біоптатного уреазного теста, що пролонгує термін зберігання теста, робить його більш економним, зручним, та забезпечує надійність і високу точність діагностики Нр у біолтатах. Джерела інформації: 1. Ю.А. Гайдар, И.И. Гриценко, Л.Н. Мосийчук и др. - Патогенные воздействия и симбиотические взаимоотношения Helicobacter pylon с макроорганизмом при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // "Гастроентерологія". Міжвідомчий збірник, М.Дніпропетровськ, 2000, с.41-44. 2. Ю.А. Гайдар, Е.В. Степанова, Д.Б. Еркович. - Гастринпродуцирующяя система желудка при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки ассоциированная с Helicobacter pylori, до и после ваготомии // "Гастроентерологія". Міжвідомчий збірник, М.Дніпропетровськ, 2004, с.71-77. 3. Н.Pylori-associated gastrointestinal diseases // Second edition. Published by Yandbooks in health care. Co. Newtown, Pennsylvania. - USA. - 2002. P.179. 4. K.S. Graham, D.Y. Graham. Y. - Contemporary diagnosis and management of H. pylori-associated gastrointestinal diseases. 2002. p.179. 5. Гайдар Ю.А., Мосійчук Л.Н., Філіппова О.Ю. Спосіб виявлення Helicocobacter pylori у біосібстраті //Декл. Патент. України, UA 30681 А, 2000. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м Київ-42, 01601