Спосіб інгібіції біоплівкоутворення ентерококів

Реферат: Спосіб інгібіції біоплівкоутворення ентерококів включає застосування амінокислотного препарату. Використовують ε-амінокапронову кислоту у кінцевих концентраціях від 25 мг/мл до 150 мг/мл. UA 122363 U (12) UA 122363 U UA 122363 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікробіології, біології, експериментальної і практичної медицини та може використовуватись для попередження інфекційних ускладнень (нозокоміальних інфекцій), спричинених ентерококами, здатними до формування мікробних біоплівок, у тому числі - на поверхні пристроїв медичного призначення (катетери, дренажі, ендоскопи та ін.). На сьогодні достеменно встановлено, що майже 80 % всіх інфекційних захворювань обумовлено мікроорганізмами, що існують у формі біоплівок. Мікроорганізми у складі біоплівок набувають ознаки підвищеної стійкості до антибіотиків, дезінфектантів та інших агресивних факторів середовища, ускладнюють перебіг захворювання та відіграють важливу роль у хронізації інфекційного процесу. Серйозну загрозу для практичної медицини становить біоплівкоутворення шпитальними штамами бактерій. Ентерококи, насамперед Enterococcus faecium та Enterococcus faecalis, є третьою найбільш розповсюдженою причиною госпітальних інфекцій, більшість з яких пов'язана з використанням постійного медичного обладнання. Важливим кроком у патогенезі цих інфекцій є колонізація біогенних та абіогенних поверхонь ентерококами і формування біоплівок. Особливого значення це набуває у відділеннях інтенсивної терапії, хірургічних стаціонарах різного профілю, оскільки утворення біоплівок причина виникнення важких катетер- і вентилятор-асоційованих внутрішньолікарняних інфекцій, сепсисів, пневмоній і ендокардитів. Неефективна антибіотикотерапія інфекцій, що супроводжуються утворенням біоплівок, призводить також до значних економічних витрат. У зв'язку з цим виникає необхідність розробки способів боротьби з біоплівкоутворенням ентерококів на біогенних та абіогенних (катетери, дренажі, ендоскопи та ін.) поверхнях. Для вирішення даної задачі стає в нагоді пошук фармацевтичних засобів, здатних пригнічувати процеси біоплівкоутворення ентерококів. Дослідженнями останніх років встановлено, що ключову роль у формуванні біоплівок ентерококами відіграють протеази, які гідролізують желатин, казеїн, інші біоактивні пептиди. Відома здатність -амінокапронової кислоти (АКК), яка є аналогом амінокислоти лізин, пригнічувати протеоліз, а також конкурентно взаємодіяти з амінокислотою лізином, що входить до основного біохімічного складу клітинної стінки грампозитивних бактерій. Найбільш близьким аналогом є спосіб, який включає для попередження формування біоплівок та їх руйнування використання поліамінокислот (поліаспарагінової та поліглутамінової). Спосіб ґрунтується на здатності заряджених ланцюгів поліамінокислот попереджувати нейтрофільно-індуковане посилення біоплівкоутворення мікроорганізмів [Patent US9314479 В2 (2016. 04) Methods and compositions for the disruption of biofilms / Jerry A. Nick, Quinn M. Parks; Applicant National Jewish Health [US]. - filed № US 14/704,091; 05.05.2015; publ. Apr. 19.04.2016]. Авторами способу запропоновано для попередження формування та деструкції вже сформованих біоплівок обробку біотичних та абіотичних поверхонь фармацевтичними композиціями, до складу яких входять поліамінокислоти (поліаспарагінова та поліглутамінова). Ознакою, спільною з ознаками корисної моделі, що заявляється, є використання амінокислот для боротьби з біоплівкоутворенням. Недоліком є складність стандартизації виготовлення композицій з поліамінокислотами через нестабільність довжини ланцюга поліамінокислотних сполук (використовуються сполуки з довжиною ланцюга від 50 до 300 амінокислотних залишків), яка обумовлює постійну зміну електричного потенціалу цих макромолекул. До того ж поліамінокислоти впливають на біоплівкоутворення опосередковано, через зменшення нейтрофільної складової у формуванні біоплівок. Вплив зазначених сполук на формування бактеріального матриксу біоплівки вивчено недостатньо. Вказані особливості не дають можливості уніфікувати запропонований спосіб. Таким чином, розробка нових підходів та способів боротьби з біоплівкоутворенням мікроорганізмів є вельми актуальною задачею мікробіології та медицини. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб інгібіції біоплівкоутворення ентерококів, який ґрунтується на використанні амінокислотного інгібітора протеолізу, що забезпечує пригнічення початкових етапів формування біоплівки. Поставлена задача вирішується шляхом застосування ɛ-амінокапронової кислоти, що є ефективним інгібітором протеолітичних ферментів, які зв'язуються з лізином. Експериментальним шляхом встановлено оптимальні концентрації, що забезпечують суттєве пригнічення біоплівкоутворення - 100 мг/мл та 150 мг/мл. Діапазон значень 25-150 мг/мл вибрано, виходячи з відсутності суттєвого ефекту при застосуванні концентрації, нижчої за 25 мг/мл. Застосування концентрацій вище 150 мг/мл недоцільно, оскільки при подальшому збільшенні концентрації АКК не індекс ігібіції біоплівкоутворення ентерококів не збільшувався. 1 UA 122363 U 5 10 15 20 25 Можливість реалізації корисної моделі ілюструється наступним прикладом. Приклад. Використані штами мікроорганізмів. Визначення здатності до біоплівкоутворення проводили на моделі штамів: Enterococcus faecalis АТСС 29212; Enterococcus faecalis 49 р; Enterococcus faecium 80. Використані поживні середовища. Отримання добових культур ентерококів, приготування вихідних робочих суспензій та культивування ентерококів з метою моделювання біоплівок проводили у рідкому середовищі: триптіказо-соєвому бульйоні (TSB) (виробництва HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Індія) з додаванням 1 % глюкози. Умови моделювання біоплівок. Добові культури досліджуваних штамів отримували шляхом їх вирощування у середовищі TSB з 1 % глюкози при температурі 37 °C. Після добової інкубації готували мікробну завісь щільністю 0,5 од. за Me Farland з використанням приладу Densi-LaMeter II (PLIVA-Lachema Diagnostika, Чехія). Моделювання біоплівок проведено у 4-секційних чашках Петрі з полістиролу. У сектори "дослід" вносили по 1,0 мл АКК у кінцевих концентраціях від 10 мг/мл до 150 мг/мл, додавали 0,75 мл середовища та 0,25 мл мікробної зависі ентерококів. У сектор "позитивний контроль" замість дослідної сполуки вносили 1,0 мл фізіологічного розчину. Після інкубації при температурі 37 °C протягом 48 год. трикратно відмивали біоплівки фосфатно-сольовим буферним розчином (рН 7,2-7,4) в об'ємі 2,0 мл, висушували чашки Петрі при кімнатній температурі. Фарбували біоплівки 1 % водним розчином кристал-віолету протягом 4 хв, барвник елюювали сумішшю етанол/ізопропанол (1:1). Вимірювання оптичної щільності (OD) елюатів ентерококів проводили на спектрофотометрі СФ56Л при довжині хвилі 590 нм. При культивуванні ентерококів в середовищі TSB з 1 % глюкози всі штами формували біоплівки, показники оптичної щільності елюатів коливались у межах від 1,6065 OD 590 до 1,8454 OD590, середній показник складав 1,68±0,09 ОD590 (табл.). Таблиця Вплив різних концентрацій АКК на біоплівкоутворення ентерококів Середовище культивування 1 TSB з 1,0 % глюкозою (контроль) TSB з 1,0 % глюкозою + 10 мг/мл АКК TSB з 1,0 % глюкозою + 25 мг/мл АКК TSB з 1,0 % глюкозою + 50 мг/мл АКК TSB з 1,0 % глюкозою + 75 мг/мл АКК TSB з 1,0 % глюкозою + 100 мг/мл АКК TSB з 1,0 % глюкозою + 150 мг/мл АКК 30 Показники біоплівкоутворення ентерококів Середнє значення оптичної Індекс інгібіції щільності елюатів з біоплівок біоплівкоутворення (OD590) (%) 2 3 1,68±0,09 1,49±0,07 11,6 0,98±0,30 41,4 0,78±0,09 53,3 0,83±0,46 59,0 0,53±0,18 73,5 0,34±0,04 83,2 Встановлена інгібуюча дія на процеси формування біоплівок ентерококів -амінокапронової кислоти у кінцевих концентраціях у поживному середовищі 25 мг/мл, 50 мг/мл, 75 мг/мл, 100 мг/мл та 150 мг/мл. Найбільш активно біоплівкоутворення ентерококів пригнічувалось під впливом розчина -амінокапронової кислоти у концентраціях 100 мг/мл та 150 мг/мл. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб інгібіції біоплівкоутворення ентерококів, що включає застосування амінокислотного препарату, який відрізняється тим, що використовують ε-амінокапронову кислоту у кінцевих концентраціях від 25 мг/мл до 150 мг/мл. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2