Спосіб визначення інтенсивності біоплівкоутворення у мікроорганізмів

Реферат: Спосіб визначення інтенсивності біоплівкоутворення у мікроорганізмів передбачає отримання зразків біоіплівки шляхом культивування мікроорганізмів за прийнятних для формування біоплівки умов у резервуарі з середовищем для культивування та носієм для формування біоплівки та подальше мікроскопічне дослідження зразків утвореної біоплівки. Як носій для формування біоплівки використовують покривні скельця, а мікроскопічне дослідження зразків біоплівки здійснюють за допомогою світлової мікроскопії та цифрової камери з отриманням ультрамікроскопічних зображень. При цьому як показник інтенсивності біоплівкоутворення використовують визначений при використанні програми TotalLab відсоток покриття носіїв біоплівкою. UA 89509 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ІНТЕНСИВНОСТІ БІОПЛІВКОУТВОРЕННЯ У МІКРООРГАНІЗМІВ UA 89509 U UA 89509 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі прикладної мікробіології та може бути використана при проведенні мікробіологічного дослідження різноманітних клінічних матеріалів та об'єктів зовнішнього середовища з метою визначення інтенсивності утворення біоплівки у різноманітних мікроорганізмів. Показано, що більшість досліджених бактерій, у т.ч. представники нормальної мікрофлори та збудники гнійно-запальних захворювань на поверхні шкірних покривів і в організмі людини здатні формувати біоплівку. Перехід мікроорганізмів із планктонної у біоплівкову форму призводить до суттєвого підвищення їх стійкості до впливу несприятливих факторів зовнішнього середовища, у т.ч. до дії антимікробних речовин. Застосування антимікробних засобів дозволяє інгібувати розмноження або зруйнувати вегетативні форми клітин, які активно реплікуються, проте не впливає на клітини-персистери, які виявляються у складі біоплівки. Це призводить до рецидиву захворювання і потребує проведення повторного курсу антибіотикотерапії. У зв'язку із цим дослідження характеристик біоплівкоутворення, а саме інтенсивності біоплівкоутворення може забезпечувати цінну інформацію стосовно стратегії лікування інфекційних захворювань. Є відомим спосіб дослідження інтенсивності біоплівкоутворення у мікроорганізмів, який здійснюють в проточній системі культивування (Stoodley P., Sauer К., Davies D.G., Costerton J.W. Biofilms as complex differentiated communities // Annu. Rev. Microbiol. - 2002. - 56. - P. 187-209). Інтенсивність накопичення біоплівки, згідно з цим способом, досліджується при використанні конфокального скануючого мікроскопа. До недоліків даного методу слід віднести недоступність періодичного відбору зразків біоплівки для проведення додаткових досліджень; неможливість одночасної оцінки впливу на біоплівку ряду параметрів; надмірну оптимізацію умов культивування, що ускладнює екстраполяцію отриманих закономірностей на процеси, які відбуваються у природних умовах, а також використання високовартісного обладнання, що потребує суттєвих фінансових затрат. Іншою групою способів є визначення кількості зв'язаного біоплівкою барвника. Такі способи передбачають інкубуванні бактерій в лунках полістиролових планшетів, забарвлення сформованої біоплівки генціан-віолетом і подальше відмивання барвника 96 %-ним етиловим спиртом. Визначення інтенсивності біоплівкоутворення проводять або за показниками заломлення світла в отриманому після відмивання розчині (Lее В., Haagensen J.A.J. Ciofu О., Andersen J.Bo., Hоiby N, Molin Sоren Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis // J. Clin. Microbiol. - 2005. - 43, № 10. - P. 52475255), або за інтенсивністю забарвлення біоплівки, сформованої на стінках лунок (Christensen G.D., Simpson W.A., Younger J.J., Baddour L.M., Barrett F.F., Melton D.M., Beachey E.H. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices // J. Clin. Microbiol. - 1985. - 22, № 6. - P. 996-1006.). Проте до недоліків вказаних методів слід віднести неможливість проведення мікроскопічного дослідження при високій кратності збільшення, візуальне спотворення об'єктів дослідження через кривизну поверхні, обмеженість тривалості спостереження за об'єктом, внаслідок незначного допустимого об'єму суспензії, загрозу контамінації зразків при їх поетапному дослідженні, непристосованість первинних даних для зберігання. Найбільш близьким до запропонованого та вибраним як прототип є спосіб, який передбачає дослідження інтенсивності біоплівкоутворення сульфатвідновлювальними бактеріями при культивуванні в колбах Ерленмейєра ємністю 200 мл у середовищі Постгейта із використанням 2 як носіїв для формування біоплівки зразків сталі з площею поверхні 2 см , підвішених на лісці (Асауленко Л.Г., Пуріш Л.М., Козлова І.П. Етапи формування біоплівки сульфатвідновлювальними бактеріями // Мікробіол. журн. - 2004. - 66, № 3. - С. 72-79). Недоліками вказаного способу є застосування оптично непрозорих носіїв, які не дозволяють використати прості методи візуалізації біоплівки, наприклад світлову мікроскопію. При цьому запропоновані носії дозволяють реалізувати вузьконаправлену задачу, наприклад дослідити корозійну активність певних видів бактерій, проте роблять вказаний метод недоцільним для проведення широкомасштабного скринінгу біоплівкоутворення у різноманітних мікроорганізмів. Задачею корисної моделі є забезпечення можливості візуальної оцінки параметрів біоплівки на будь-якому етапі її розвитку з можливістю дослідження широкого спектра мікроорганізмів. Додатковим технічним результатом, який досягається, є простота його здійснення без необхідності використання високовартісного обладнання. Поставлена задача вирішується за рахунок розробки способу визначення інтенсивності біоплівкоутворення у мікроорганізмів, який передбачає отримання зразків біоплівки шляхом культивування мікроорганізмів протягом 7 діб за прийнятних для формування біоплівки умов у резервуарі з середовищем для культивування з доданням носія, забарвлення зразків генціанвіолетом та дослідження зразків мікроплівки на носії за допомогою світлової мікроскопії та 1 UA 89509 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цифрової камери з отриманням ультрамікроскопічних зображень та визначення відсотку покриття зразків біоплівкою при використанні програми TotalLab. При цьому визначений таким чином відсоток є показником інтенсивності біоплівкоутворення. Перевагами запропонованого способу є однотипність відібраних в один і той самий момент зразків біоплівки, що дозволяє оцінити різні параметри певних етапів біоплівкоутворення за допомогою ряду додаткових методів, отримати різносторонні характеристики і забезпечити комплексність оцінки досліджуваного явища. До переваг даного способу слід віднести можливість отримання необмежено великої кількості зразків для статистичної обробки отриманих результатів, подовження тривалості спостереження та різнопланового дослідження явища біоплівкоутворення із будь-якими мікроорганізмами, середовищами і носіями для формування біоплівки, а також взаємну ізольованість ємкостей для культивування мікроорганізмів, що обумовлює доступність проведення необхідних маніпуляцій із окремим зразком без впливу на інші аналоги та запобігає їх контамінації сторонньою мікрофлорою. Перевагами запропонованого способу також є можливість візуальної оцінки стану біоплівки на будь-якому етапі її розвитку; збереження інформації щодо відповідного етапу біоплівкоутворення не лише у вигляді фотографічних зображень, але й власне біологічних зразків; невисокі фінансові затрати на придбання обладнання та розхідних матеріалів; простота, доступність та зручність у застосуванні. Як резервуари для культивування мікроорганізмів, як правило, використовують бюкси об'ємом 20 мл. У переважному втіленні корисної моделі як носії для одержання зразків біоплівки використовують покривні скельця розмірами 18×18 мм. На кресленні представлені одержані при використанні запропонованого способу криві, які характеризують накопичення біоплівки для досліджених штамів Pseudomonas aeruginosa УKM B-900 (АТСС 9027) (A), P. aeruginosa УKM B-l (АТСС 10145) (Б), P. aeruginosa УKM B-12 (CCM 1500) (В). S - площа утвореної біоплівки; Τ - тривалість спостереження. Корисна модель ілюструється конкретним прикладом її реалізації. Приклад. Використані штами мікроорганізмів. Визначення інтенсивності біоплівкоутворення проводили на моделі колекційних штамів Pseudomonas aeruginosa: УКМ В-1 (АТСС 10145), УКМ В-12 (ССМ 1500) і УКМ В-900 (АТСС 9027), отриманих із Української колекції мікроорганізмів (УКМ, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України). Дані мікроорганізми є фармакопейними і типовими, що дозволяє стандартизувати отримані результати. Використані поживні середовища. Отримання добових культур досліджуваних мікроорганізмів, приготування вихідних робочих суспензій та культивування з метою отримання зразків біоплівки проводили в рідкому середовищі LB (Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. Под ред. С.И. Алиханяна. - М.: Мир, 1976. - С. 394-395). Умови інкубування культур при дослідженні явища біоплівкоутворення. Добові культури досліджуваних штамів P. aeruginosa УКМ В-1, УКМ В-12 і УКМ В-900 отримували шляхом їх вирощування в середовищі LB при 37 °C протягом 18-24 год., після чого розводили середовищем LB у співвідношенні 1:100 (по об'єму). Інкубування мікроорганізмів проводили в стаціонарній системі на склі. Для цього в бюкси розміром 30×50 мм і об'ємом 20 мл вносили покрівельні скельця розмірами 1818 мм і 2 мл розведеної суспензії досліджуваних культур, які 6 містили 2×10 КУО/мл клітин. Вихідну кількість бюксів розраховували відповідно до кратності відбору скелець. Культивування здійснювали при 37 °C протягом 7-8 діб. Отримання і підготовка зразків, визначення інтенсивності біоплівкоутворення. На кожну добу інкубування із бюкса з суспензією досліджуваного штаму відбирали покривне скельце. Відібрані скельця 2-3 рази відмивали від планктонної форми клітин 0,9 %-ним розчином NaCl. Відмиті скельця фіксували протягом 10 хв. в 96 % розчині етанолу і забарвлювали і енціан-віолетом протягом 10 хв. Розмір сформованої біоплівки визначали шляхом світлової мікроскопії на мікроскопі Micromed XS-2610 мри загальному збільшенні 600 за допомогою ультрамікрофотографування зразків цифровою фотокамерою Nikon Coolpix Р5100. Отримані растрові зображення обробляли з використанням програми для роботи із растровою графікою TotalLab TL120. Визначення відсотку покриття зразків біоплівкою на кожному окремому етапі і протягом всього періоду спостереження розраховували за розмірами і площею поверхні 2 сформованих штамами P. aeruginosa біоплівкових структур, які виражали у мм . При визначенні інтенсивності біоплівкоутворення у досліджуваних мікроорганізмів було встановлено, що для P. aeruginosa УКМ В-900 накопичення максимальної кількості біоплівки, яка покривала практично 50 % поверхні скельця виявлялось на першу добу культивування 2 (креслення, A). Проте вже на наступну добу площа біоплівки різко знижувалась до 22,9 мм , після чого даний рівень підтримувався протягом подальшого періоду спостереження. Повторне 2 UA 89509 U 2 5 10 15 20 накопичення біоплівки до 52,6 мм виявляли лише на 7 добу культивування. Біоплівкоутворення у P. aeruginosa УКМ В-1, в порівнянні з таким у штаму УКМ В-900, характеризувалось деякими особливостями (креслення, Б). В даному випадку площа біоплівки 2 поступово збільшувалась і досягала максимуму - 172 мм на 4 добу спостереження. В подальшому, як і у штама УКМ В-900, було відмічено значне зниження її кількості практично до нульових показників, яке підтримувалось на даному рівні протягом наступних 48 годин. 2 Повторне збільшення площі біоплівки до 171,5 мм у Р. aeruginosa УКМ В-1 спостерігали на 8 добу культивування (дані на кресленні не приведені). Дані, отримані для P. aeruginosa УКМ В-12, показали, що формування біоплівки даним штамом характеризується доволі нерівномірним характером (креслення, В). Так, на першу добу 2 культивування площа біоплівки становила 66,3 мм , в подальшому спостерігалось незначне зниження відсотку накопичення, а на третю добу повторне зростання площі покриття зразка до 2 91,4 мм . Протягом наступних двох діб у Р. aeruginosa УКМ В-12 спостерігалось зниження 2 відсотку накопичення біоплівки в середньому до 32 мм . На кінцевому етапі спостереження у P. aeruginosa УКМ В-12 було відмічено повторне зростання площі сформованої біоплівки до 112,1 2 мм . Середня інтенсивність утвореної протягом усього періоду спостереження біоплівки у P. aeruginosa УКМ В-12 виявилась максимальною, дещо нижчі показники виявлялись у штама УКМ В-1, а культура P. aeruginosa УКМ В-900 характеризувалась мінімальним її накопиченням (таблиця). Таблиця Інтенсивність накопичення біоплівки досліджуваними штамами P. aeruginosa протягом періоду спостереження Досліджуваний штам P. aeruginosa УКМ В-1 УКМ В-12 УКМ В-900 1 11,9 20,5 47,4 Інтенсивність накопичення біоплівки, % Період відбору зразків, діб 2 3 4 5 6 7 26,9 27,7 53,3 1,0 1,1 1,2 12,3 28,2 9,7 10,0 32,6 15,1 7,1 3,7 3,1 5,8 1,1 16,2 Bs 17,6 18,3 12,1 Примітка: Вs - середня інтенсивність накопичення біоплівки. 25 30 35 40 Таким чином, запропонований, згідно з даною корисною моделлю, спосіб забезпечує можливість дослідження явища біоплівкоутворення, виявлення його особливостей для різних штамів мікроорганізмів, виділених з різних джерел. Отримані в результаті реалізації способу результати щодо динаміки накопичення біоплівки можуть стати у нагоді при підборі раціонального режиму антибіотикотерапії для лікування пацієнтів із хронічним протіканням захворювань, спричинених відповідними мікроорганізмами. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 1. Спосіб визначення інтенсивності біоплівкоутворення у мікроорганізмів, який передбачає отримання зразків біоіплівки шляхом культивування мікроорганізмів за прийнятних для формування біоплівки умов у резервуарі з середовищем для культивування та носієм для формування біоплівки та подальше мікроскопічне дослідження зразків утвореної біоплівки, який відрізняється тим, що як носій для формування біоплівки використовують покривні скельця, а мікроскопічне дослідження зразків біоплівки здійснюють за допомогою світлової мікроскопії та цифрової камери з отриманням ультрамікроскопічних зображень, при цьому як показник інтенсивності біоплівкоутворення використовують визначений при використанні програми TotalLab відсоток покриття носіїв біоплівкою. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додатково проводять забарвлювання зразків генціан-віолетом. 3 UA 89509 U Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4