Спосіб визначення здатності штамів стафілокока до біоплівкоутворення

Реферат: Спосіб визначення здатності штамів стафілокока до біоплівкоутворення шляхом культивування бактеріальних ізолятів у трипсин-соєвому бульйоні у стерильних плоскодонних 96-лункових планшетах з наступним відмиванням від планктонних клітин буферним розчином, фарбуванням генціанвіолетом, екстракцією барвника етанолом та визначенням оптичної щільності розчину на ридері. У лунки з ТСБ вносять по 100 мкл розчину кролячої цитратної плазми, у розведенні 1:2,5-1:5, а урахування результатів проводять через 4 години інкубації. UA 114912 U (12) UA 114912 U UA 114912 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до медичної мікробіології і може бути використана для діагностики здатності штамів стафілокока до біоплівкоутворення, а також чутливості до біоцидів штамів стафілокока, що існують в формі біоплівки. Найближчим аналогом вибраний найбільш розповсюджений, детально описаний в літературі, спосіб визначення здатності бактерій до біоплівкоутворення, запропонований D. Christensen в модифікації Романової Ю.М. [1, 2], в основу якого поставлено створення статичних умов для культивування бактерій у 96-лункових пластикових планшетах. Спосіб здійснюється наступним чином. Бактеріальний ізолят інкубують 18-24 години при температурі +35 °C у трипсин-соєвому бульйоні (ТСБ) з об'ємною часткою глюкози 1 %, доводять концентрацію суспензії до 0,5 по Мак Фарланду з наступним розведенням її ТСБ у 7 відношенні 1:100 (3×10 КУО/мл). Розведену культуру вносять в полістиролові лунки панелі планшета по 200 мкл. Як негативний контроль використовують стерильний ТСБ. Планшет накривають кришкою і інкубують при температурі +35 °C на протязі 24-48 годин. Для видалення планктонних форм стафілокока лунки відмивають 3 рази 1М розчином фосфатного буферу. Фарбування біоплівок здійснюють 1 % розчином кристалвіолету, який вносять у лунки по 200 мкл, витримують 25 хвилин при кімнатній температурі, видаляють і трикратно промивають 1М фосфатним буфером. Для екстракції криставіолету в кожну лунку добавляють по 200 мкл 96 % етанолу. Оптичну щільність спиртового розчину кристалвіолету вимірюють на спектрофотометрі при довжині хвилі 540-630нм, інтенсивність фарбування спирту відповідає ступеню утворення біоплівки. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: 7 культивування бактеріальних ізолятів (3×10 КУО/мл) у трипсин-соєвому бульйоні (ТСБ) у стерильних плоскодонних 96-лункових планшетах з наступним відмиванням від планктонних клітин 1М буферним розчином, фарбуванням 1 % генціанвіолетом, знебарвленням 96° етанолом та визначенням оптичної щільності сформованої біоплівки на ридері. Досягненню бажаного технічного результату при застосуванні відомого способу заважає те, що при його застосуванні виявляється здатність штаму до адсорбції лише на полістиролову поверхню лунки з наступним утворенням біоплівки через більш тривалий час (18-24 години), а не за рахунок специфічної адгезії до відповідного біологічного субстрату, до якого у дослідного штаму є специфічні адгезини, за більш короткий час. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення здатності штамів стафілокока до біоплівкоутворення, в якому за рахунок створення умов для специфічної адгезії забезпечити скорочення часу, необхідного для отримання результатів тесту. Поставлена задача вирішується шляхом модифікації відомого способу, який взято за найближчий аналог, який включає внесення в лунки полістиролового планшета з бульйонною культурою дослідного штаму кролячої плазми, що дозволяє оцінити здатність культури до біоплівкоутворення вже через 4 години. Спосіб здійснюють таким чином: добову культуру досліджуваних штамів стафілокока з твердого живильного середовища відсівають у ТСБ з об'ємною часткою глюкози 1 %, інкубували протягом 4 та 24 годин при + 35 °C, після чого доводять до концентрації) 0,5 по Мак Фарланду, розводять отриману суспензію у відношенні 1:100 (до 3. 10 7 КУО /мл), та вносять її по 200 мкл у полістиролові лунки планшета, вносять в кожну лунку з мікробною суспензією по 100 мкл розведеної, згідно з настановою виробника, кролячої цитратної плазми, інкубують планшети при температурі +35 °C, відмивають лунки від планктонної культури 1 Μ розчином фосфатного буферу, фарбують біоплівки шляхом внесення в лунки планшета по 200 мкл 1 % розчину кристалвіолету, трикратно відмивають лунки 1 Μ розчином фосфатного буферу, екстрагують кристалвіолет 96 % етанолом, вимірюють оптичну щільність (ОЩ) спиртового розчину екстрагованого кристалвіолету на спектрофотометрі при довжині хвилі 587 нм, що корелює зі здатністю штаму до біоплівкоутворення. Кількість розведеної плазми 100 мкл є оптимальною за дослідних умов. Діапазон значень розведення кролячої сироватки, що заявляється обґрунтовується результатами експериментальних досліджень, частина яких наведена в таблиці 1. 1 UA 114912 U Таблиця 1 Здатність до біоплівкоутворення в присутності різних концентрацій кролячої сироватки за показниками оптичної щільності № штаму 1/44 2/22 3/36 4/64 5/9 5 10 15 ТСБ 0,06 0,38 1,2 0,18 0,37 Через 4 години Через 24 години Середовище інкубації (+культура стафілокока) ТСБ+ ТСБ+ ТСБ+ ТСБ+ ТСБ+ ТСБ+ плазма плазма плазма ТСБ плазма плазма 1:5 плазма 1:10 1:2,5 1:5 1:10 1:2,5 0,34 0,84 0,21 0,18 0,41 0,96 0,59 1,46 3,4 1,2 0,66 1,52 3,44 1,26 1,63 3,1 1,48 1,83 1,8 3,32 1,56 0,42 1,78, 0,26 0,22 0,51 1,58 0,31 0,88 2,6 0,51 0,61 1,73 2,89 0,75 Достовірна різниця (р0,05), свідчать про прискорення процесу біоплівкоутворення коагулазопозитивними штамами стафілокока при взаємодії з кролячою плазмою, що дозволяє скоротити час експерименту до 4 годин. Саме цей час відповідає переходу культури стафілокока до найбільш активної фази логарифмічного росту. Порівняння ефективності запропонованого методу та методу за найближчим аналогом здійснено на 28 клінічних штамах стафілокока. Інтерпретацію отриманих результатів (оцінка ступеня біоплівкоутворення) здійснювали, згідно з широко використовуваними рекомендаціями [5]. Показники оптичної щільності (ОД ОЩ) 1,0 Адгезія до поверхні відсутня середня висока Здатність до біоплівкоутворення відсутня/слабка середня висока 20 Отримані результати досліджень (таблиця № 2) оброблено методом варіаційної статистики за допомогою програми MS Excel 2003 з використанням критерію t [9]. Достовірними вважали відмінності при значенні p