Спосіб введення непроникаючих речовин в еритроцити

Изобретение относится к биологии и медицине, предназначено для изготовления маркерных и лекарственных препаратов Цель изобретения — расширение спектра вводимых, веществ за гчет введения электро питов при одновременном упрощении спосо ба Для этого к взвеси эритроцитов добавляют водный раствор непроникающего ве щества и непроникающего криопротектора (р-ры, содержащие 150 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl с рН 7,4, 20% ПЭО — 1500 и 1 мк Ки/мл 14 С сахарозы) Суспензию замо раживают в жидком азоте и отогревают на водяной бане, затем отмывают от невключившегося вещества и атоническим раствором и центрифугируют при 3000 g" Огмывку клеток от 1 4 С сахарозы, находящейся в межклеточном пространстве, повторяют 6 раз При замораживании оттаивании кле ток в непроникающем криопротекторе про исходит обратимое нарушение барьерных свойств мембраны эритроцитов, что приво дит к заполнению клеток непроникающим в норме веществом с СО ел 48—87 1 1363571 отогреву на водяной бане. Эта процедура Изобретение относится к биологии и мезаняла 3 мин. дицине и может быть использовано при изготовлении маркерных и лекарственных преОтогретые клетки отмывали от внеклеточного Na + аналогично первой части. Сопаратов. держание внутриклеточного Na + определяли Целью изобретения является расширение методом пламенной фотометрии. В образцах спектра вводимых веществ за счет введения не подвергнутых замораживанию, конценэлектролитов при одновременном упрощетрация натрия составляла 14 мМ, т. е. пракнии способа тически не отличалась от содержания его в Способ осуществляется следующим обраинтактных эритроцитах. В образцах, подзом. К взвеси эритроцитов добавляют водвергнутых замораживанию в среде непроный раствор непроникающего вещества и ницающего кргопротектора ПЭО—1500, непроникающего криопротектора. Суспенконцентрация внуфиклеточного Na + составзию замораживают и отогревают, затем отляла 45 мМ. мывают от невключившегося вещества изоТаким образом, данный пример свидетоническим раствором. При замораживании-оттаивании клеток в непроникающем 15 тельствует об эффективном заполнении клеток ионами Na + при замораживании, а таккриопротекторе происходит обратимое наже показывает, что инкубация в среде криорушение барьерных свойств мембраны эритпротектора без замораживания не привороцитов, что приводит к заполнению клеток дит к подобному эффекту. непроникающим в норме веществом. Пример 3. Эритромассу, суспендирован20 ную в растворе, содержащем 150 мМ NaCI, Пример 1. К 1 мл эритромассы с гемато10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 2 мМ МпС1г, с критом 84% добавили равный объем раствогематокритом 84%, смешивали с равным ра, содержащего 150 мМ NaCl, 10 мМ объемом 1 М сахарозы, приготовленной на трио-HCl, рН 7,4 20% ПЭО — 1500 и 4 том же растворе. Суспензию разделили на 1 мк Ки/мл ' С-сахарозы. Ампулы с суспен2 части Одну часть суспензии подвергали зией замораживали в жидком азоте и отогребыстрому замораживанию погружением в вали на водяной бане. После отогрева к жидкий азот и отогреву на водяной бане. суспензии клеток добавили 10 объемов раСуспензию разбавили средой суспендиствора, содержащего 150 мМ NaCl, 10 мМ рования, не содержащей МпС1г и центрифутрис-HCl, рН 7,4 и центрифугировали при 3000 g 10 мин на холоде (2—4°С). Процеду- 30 гировали при 3000 g 3—4 мин. Процедуру отмывания клеток повторяли 4 раза до исру отмывки клеток от ' 4С-сахарозы, нахочезновения в надосадке сигнала ЭПР от дящейся в межклеточном пространстве, повионов Мп 2 + , находящихся в межклеточном торяли 6 раз. пространстве Отмывание одновременно проОсадок эритроцитов лизировали в 5 мл водили для обеих частей суспензии. В сусхолодной дистиллированной воды и центрипензиях определяли содержание М п 2 + с пофугировали для удаления мембран при 35 мощью ЭПР спектроскопии и рассчитывали 3000 g на холоде 5 мин В надосадке после заполнение клеток внеклеточным Мп 2 *, исосаждения гемоглобина 5%-ной трихлорпользуя отношение амплитуд образца с изуксусной кислотой (ТХУ) регистрировали с вестной концентрацией к амплитуде опытпомощью жидкого сцинтиллятора радионых образцов. Опыт показал, что суспендиактивность в сцинтилляционном счетчике рование эритроцитов в 0,5 М сахарозе не При этом в гемолизате обнаружили раприводит к проявлению сигнала ЭПР Мл 2 * диоактивность ' 4С-сахарозы. Расчет, основ эритроцитах. Замораживание в среде неванный на отношении радиоактивности в проникающего криопротектора — сахарозе 1 мл межклеточной жидкости и в 1 мл эрити последующий отогрев приводят к запол2+ роцитов показал, что внутриклеточная коннению клеток ионами Мп , о чем свидетельцентрация сахарозы составляла 0,5% от ствовал сигнал ЭПР Мп 2 + в эритроцитах, внешней. концентрация ионов Мп2"* при этом составПример 2. Эритромассу, суспендированляла 2,5—3°/о от первоначальной. ную в растворе, содержащем 150 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,4 с гематокритом 84% Формула изобретения смешивали с равным объемом 20% ПЭО-1500, приготовленном на том же растворе. Способ введения непроникающих веСуспензию разделили на две части Одну ществ в эритроциты путем суспендирования часть клеток отмывали от внеклеточного эритроцитов с вводимым веществом и послеNa + раствором, содержащим 0,15 холинхлорида, 10 мМ трис-HCl, рН 7,4 є 4—5-кратдующим воздействием физическим фактором ным центрифугированием при 3000 g на хо- 55 отличающийся тем, что, с целью расширелоде. Другую часть клеток подвергали быстния спектра вводимых веществ за счет вверому замораживанию погружением в жиддения электролитов при одновременном упрокий азот (200—400°/мин) и последующему щении способа, в суспензию дополнительно • „ . ' '•• " • • • • • 3 і '• • 1 3 6 3 5 7 1 '• вводят непроникающий в клетки криопротектор, замораживают смесь в жидком азо • ' , •;.'. " • . 4 те, оттаивают и отмывают от остатка вво^имого вещества изотоническим раствором. Составитель Н. Гуляева Редактор Е. Зубиетова Техред И. Верес Корректор А. Ильин Заказ 1621/ДСП Тираж 489 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж—35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4