Штам бактерій pseudomonas fluorescens укм в-36, який призначений для розкладу гербіциду дуалу

Штам бактерій Pseudomonas fluorescens УКМ В-36, депонований в депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за № ІМВ В-7172, який призначений для розкладу гербіциду дуалу. (19) (21) u200510841 (22) 15.11.2005 (24) 15.05.2006 (46) 15.05.2006, Бюл. № 5, 2006 р. (72) Тертична Ольга Василівна, Омельянець Таісія Григорівна 3 14400 4 здатний розкладати гербіцид дуал в рідкому сереШтам зберігається у ліофілізованому стані в довищі та в ґрунті. запаяних пробірках або у високому (8-10мл) стовТехнічним результатом корисної моделі, що пчику напіврідкого середовища МПА (0,5% м'ясозаявляється, є ефективність деструктивної дії в пептонному агарі) під шаром стерильного вазеліґрунті по відношенню до гербіциду дуалу групи нового масла при кімнатній температурі. Пересівагалоїдзамісних анаілідів карбонової кислоти. ється 1 раз на рік. Характеристика штаму Pseudomonas Безпека. fluorescens УКМ B-36. Для встановлення ступеню небезпеки штаму Номенклатурні дані: рід - Pseudomonas, вид Pseudomonas fluorescens УКМ В-36 проводили бювар III Pseudomonas fluorescens, депонований в зараження лабораторних тварин. Встановлено, що колекції Інституту мікробіології і вірусології НАНУ штам В-36 відноситься до невірулентних для тепза №1MB В-7172. локровних організмів культур. ЛД50 цього штаму Походження штаму. для білих мишей складає при внутрішньоочереШтам Pseudomonas fluorescens У KM B-36 вивинному введенні 1,12 109 0,33 109 КУО/тварину, ділений із чорноземного ґрунту загальноприйняпри введенні per os 9,07 1010 3,1 109 КУО/тварину, тими методами [5] і відібраний серед 102 штамів при інтраназальному введенні ЛД50 для мишей псевдомонад за ознакою найбільшої деструкційної визначити не вдається: максимально можлива для активності по відношенню до гербіциду дуалу. введення доза 5 109 КУО/тварину викликає загиКультурально-морфологічні ознаки. бель 4 із 10 тварин, тобто ЛД50>5 109 КУО/тварину. Клітини - дрібні палички (1,2-2,8)х(0,3-0,6)мкм. ЛД50 для білих щурів складає при внутрішньоСпор не утворюють, грамнегативні, рухомі, лофоточеревинному введенні 2,54 1010 5,11 1010 рихи. Оксидазопозитивні за Ковачем. КУО/тварину, введення per os максимально можДобре ростуть на звичайних поживних сереливої для введення дози 1,6 1011 КУО/тварину не довищах. На м'ясо-пептонному агарі - колонії кругвикликає загибелі жодного із 10 заражених тварин, лі, гладенькі, блискучі, випуклі, білі, пастоподібні. тобто ЛД50>1,6 1011 КУО/тварину. При інтраназаВ середовище виділяють жовто-зелений флюльному введенні ЛД50>8,0 1010 КУО/тварину [8]. оресціюючий пігмент, характерний для багатьох При всіх способах надходження бактерій в орвидів роду Pseudomonas. На м'ясо-пептонному ганізм вони не спричиняють інфекції у теплокровбульйоні дають рясний ріст, утворюючи рівномірне них тварин. помутніння. Здатний рости на синтетичному пожиХарактеристика деструкційних властивостей вному середовищі. штаму. Фізіолого-біохімічні ознаки. Серед значної колекції псевдомонад (102 Оксидазопозитивні за Ковачем. Розріджують штами 7 видів) було спочатку відібрано штами, не желатину, гідролізують аргінін, не утворюють лечутливі до токсичної дії дуалу [9]. Серед 69 не чутвану з сахарози. Мають денітрифікуючі властивосливих до дії дуалу штамів мікроорганізмів роду ті. Засвоюють як єдине джерело вуглецю Pseudomonas нами було проведено пошук штамів, глюкозу, - ксилозу, сахарозу, трегалозу, жирні здатних до росту на агаризованому середовищі з кислоти від оцтової до пеларгонової, манніт, сордодаванням дуалу як джерела живлення. Активна біт, інозит, гліцерин, нижчі спирти - етанол, пропаречовина дуалу метолахлор C12H21O2NCI містить в нол, бутанол, амінокислоти, бетаїн і саркозин. Не своєму складі азот і вуглець, що можуть при розкгідролізують крохмаль [6, 7]. ладі препарату використовуватись мікроорганізУмови культивування штаму мами як джерела живлення. Найбільш активними На м'ясо-пептонному бульйоні дають рясний за інтенсивністю росту на агаризованому середоріст, утворюючи рівномірне помутніння. Здатний вищі з додаванням дуалу як джерела живлення рости на синтетичному поживному середовищі. виявилися 4 штами бактерій роду Pseudomonas. На твердих і в рідких середовищах штам Для визначення найбільш активних штамів, Pseudomonas fluorescens УІСМВ-36 добре росте в здатних до розкладу дуалу, проведено вивчення температурних межах від 4 до 42 С, оптимум росперебігу деградації цього гербіциду в рідкому сету 25-30 С. Оптимум рН 7,0-7,2. редовищі. Склад середовища - м'ясо-пептонного агару В табл.1 наведені результати досліджень дидля культивування штаму: наміки вмісту дуалу та росту бактерій 15г сухого м'ясного поживного бульона Pseudomonas fluorescens УКМ-36 в рідкому синте1г пептону тичному середовищі складу: NaCl - 5г, MgSО4 - 0, 20г агар-агару г, NН4Н2РО4 - 1г, К2НРО4 - 1г, дуал - 1г , дистильоВода - 1000мл вана вода - до 1л. РН 7,2-7,4 Початкова концентрація бактерій складала Склад середовища Козера для культивування 3 106 клітин в 1мл. Дослідження кількості дуалу штаму: проводили в динаміці через 1, 3, 5, 7 і 10 діб після NaCI - 5г внесення в середовище. На 10-у добу в рідкому MgSО4 - 0,2г середовищі з додаванням штаму УКМ В-36 не буNH4H2 РО4 - 1г ло знайдено гербіциду. Інтенсивність росту бактеК2НРО4 - 1г рій збільшувалась до 5-ї доби, потім дещо зменГлюкоза - 1г шувалась, можливо внаслідок їх гальмування Вода дистильована - 1000мл. продуктами метаболізму бактерій. Спосіб, умови та склад середовища для довгострокового зберігання штаму. 5 14400 6 Оцінку деструкційних властивостей внесення культури бактерій і дуалу (таблиця 3). Це Pseudomonas fluorescens УКМ-36 щодо гербіциду збільшення кількості бактерій в ґрунті з дуалом в дуалу в ґрунті проводили шляхом внесення цих порівнянні з кількістю бактерій в ґрунті без дуалу пояснюється стимулюючою дією дуалу на розвибактерій в кількості 1,2 106 КУО/г в чорнозем, штуток бактерій штаму Pseudomonas fluorescens УКМ чно забруднений дуалом. Дуал вносили в дозі 1мг/ В-36. кг ґрунту. Посудини з ґрунтом зберігали при темВ нестерильному ґрунті кількість інтродуковапературі 18-22 С. Результати кількісного аналізу ного штаму P. fluorescens порівняно із стерильним дуалу [10] наведені в таблиці 2. ґрунтом нижча, що, можливо, пояснюється інгібуНа 30-у добу в варіанті з додаванням ючою дією аборигенної мікрофлори чорноземного Pseudomonas fluorescens УКМ В-36 в стерильному ґрунту на інтроду кований штам. ґрунті практично не знайдено залишків гербіциду; Таким чином, встановлено, що штам бактерій константа швидкості розпаду дуалу в цьому варіаPseudomonas fluorescens УКМ В-36 є активним нті в 4 рази вища, ніж в варіанті без внесення бакдеструктором гербіциду дуалу із групи галоїдзамітерій. В нестерильному ґрунті при внесенні сних анілідів карбонової кислоти. Деструкційна Pseudomonas fluorescens розпад дуалу спостеріактивність штаму, а також безпека його для тварин гався вже на 30-у добу експерименту, тоді як в і людини створюють передумови для використанґрунті без додавання псевдомонад він тривав доня цих бактерій для очищення ґрунту від гербіцивше. ду. Збільшення кількості бактерій Pseudomonas fluorescens як в стерильному, так і в нестерильному ґрунті спостерігається вже через 1 добу після Таблиця 1 Динаміка кількості дуалу та бактерій Pseudomonas fluorescens УКМ В-36 рідкому синтетичному середовищі, М±m Термін дослідження (доба) 1 3 5 7 10 Кількість дуалу (мг/л) 0,78 0,02 0,68 0,03 0,39 0,04 0,18 0,03 0 Кількість бактерій (клітин/мл) 2,0 106 3,9 106 7,1 106 7,0 106 6,9 106 0,9 106 0,8 106 1,1 106 1,2 106 1,9 106 Таблиця 2 Динаміка деградації дуалу в ґрунті протягом 1-30 діб Кількість дуалу (мг/ кг) за термінами дослідження (доба) Варіант ДосКонстанта Період напіврозпаліду Через 1 добу Через 10 діб Через 20 діб Через 30 діб швидкості розду, Т паду, К Стерил. Ґрунт+дуал+ 0,82 1:0,12 0,089 7,8 0,58 0,03 0,28 0,03 0,04 0,004 штам В-36 Ґрунт+Дуал+ 0 0,131 5,3 0,72 0,14 0,21 0,04 0,11 0,05 Штам В-36 Грунт+ Дуал 0,114 6,1 0,91 0,05 0,3 0,02 0,12 0,01 0,03 0,001 Стерил. 0,022 31,5 0,90 0,08 0,63 0,16 0,47 0,02 0,43 0,06 Ґрунт+ Дуал Таблиця 3 Динаміка кількості бактерій Pseudomonas fluorescens У KM В-36 в ґрунті Кількість бактерій P. fluorescens в ґрунті (lg КУО/г) за варіантами досліду, М т Термін дослідження Ґрунт+ шт. В-36 1 3 5 7 4,10 4,07 4,60 4,51 0,03 0,02 0,07 0,04 Стерильн.ґрунт+шт. В36 4,75 0,08 4,88 0,07 4,85 0,10 5,61 0,08 Стерил.ґрунт+ дуал+шт.В-36 7,18 0,03 5,79 0,05 6,00 0,03 5,87 0,04 Ґрунт+ Дуал +шт. В36 4,510 0,04 5,26 0,05 6,74 0,05 6,74 0,04 7 14400 8 Продовження таблиці 3 Кількість бактерій P. fluorescens в ґрунті (lg КУО/г) за варіантами досліду, М т Термін дослідження Ґрунт+ шт. В-36 10 20 30 4,б6 0,06 4,78 0,10 4,69 0,06 Стерильн.ґрунт+шт. В36 6,03 0,06 5,79 0,04 5,94 0,06 Список літератури 1. Андреюк K.I., Іутинська Г.О., Антипчук А.Ф. та ін. Функціонування мікробних ценозів ґрунту в умовах антропогенного навантаження.- К.: Обереги, 2001-240 с. 2. Головлева Л.А. Деградация пестицидов микроорганизмами: биотехнические аспекты проблемы// Тр. ВНИИ с.-х. микробиологии .- 1983.т.56- с. 11-12 3. Круглов Ю.В. Микрофлора почвы и пестициды.- М. :Агропромиздат, 1991.- 128с. 4. Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні.- Київ, 2002. 5. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии.- М: Изд-во МГУ, 1991.-304 с. 6. Смирнов В.В., Киприянова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas.- К.: Наук. думка, 1990.-264 с. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Стерил.ґрунт+ дуал+шт.В-36 5,9 0,02 4,51 0,04 6,74 0,05 Ґрунт+ Дуал +шт. В36 4,60 0,08 4,10 0,03 4,10 0,03 7. Скворцова И.Н. Методы идентификации и выделения почвенных бактерий рода Pseudomonas .- М.,1981,- 107 с. 8. Медіко-біологічні дослідження виробничих щтамів мікроорганізмів і токсиколого-гігієнічна оцінка мікробних препаратів, визначення їх безпеки та обґрунтування гігієнічних нормативів і регламентів: Метод, вказівки / Укладачі Омельянець Т.Г. та ін.-Видання офіційне.- Київ, МОЗ України 2004.22 с. 9. Визначення чутливості мікроорганізмів до пестицидів методом дифузії в агар з використанням дисків з фільтрувального паперу: Метод, вказівки.- К.: Логос.- 2005.-12 с. 10. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде// Клисенко М.А., Калинина А.А., Новикова К.Ф.и др.-М.: Колос, 1992.-567 с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601