Штам асоціативних бактерій bacillus polymyxa, який використовують для захисту рослин від фітопатогенних грибів

Штам асоціативних бактерій Bacillus polymyxa 6-М, який використовують для приготування антифунгального біопрепарату Винахід стосується сільськогосподарської мікробіологи, зокрема, бактерій, які використовують як засіб захисту рослин від фітопатогенних грибів, що сприяє підвищенню врожайності овочевих та зернових культур і поліпшенню їх якості Широке застосування ХІМІЧНИХ засобів підвищення продуктивності культурних рослин призводить до накопичення залишків шкідливих сполук і міграції їх в системі атмосфера-рослина-грунтвода і т д Наслідком таких міграцій є забруднення продукції рослинництва і тваринництва з подальшим потраплянням шкідливих речовин в організм людини Альтернативою надлишкової хімізації сільськогосподарського виробництва є створення мікробних препаратів, що поліпшують кореневе живлення рослин, стимулюють їх ріст та захищають від хвороб та ШКІДНИКІВ, поліпшують родючість ґрунтів За прототип прийнято штам бактерій Bacillus subtihs 26D на основі якого виготовляють фітоспорин - мікробний препарат проти бактеріальних і грибкових хвороб (А С №1717156) Штам В subtihs 26D було виділено співробітниками Інституту мікробіологи та вірусологи НАНУ (м Київ) і Таджицького сільськогосподарського інституту (м Душанбе) у природних умовах з бавовнику в Шааржуцькому районі Таджицької РСР у 1986 році Автори Смірнов В В , Менлікієв М Я , Резнік С Р , Ваньянц Г , В'юницька В А , Султанова М X , Шаріпова Н У , Хотянович А В Культурально-морфолопчні, фізюлогобюхімічні особливості культури бактерій В subtihs 26D Грампозитивні аеробні спороутворюючі палички, що продукують каталазу На МПА, СА, середовищі Громиш, картопляному агарі ростуть рясно На МПА утворюють складчасті колонії в'язкої консистенції, тілесного кольору, краї колоній неправильної форми На картопляному агарі - колони світло-тілесного кольору, блискучі, в'язкої консистенції, краї рівні На середовищі Громиш колонії тілесного кольору, складчасті, краї порізані, консистенція в'язка У мазках 18-годинноі культури виявляються прямі паличковидні клітини розміром 1,9хО,5мкм, розміщені поодиноко, попарно, рідше у ланцюжках КЛІТИНІ рідкі При спороутворенні клітини не роздуваються Спори еліптичної форми розміром 0,9х0,5мкм, у клітинах розміщені центрально Культура ферментує глюкозу, арабшозу, лактозу, манніт, сахарозу з утворенням кислоти, не розкладає дульцит, дає позитивну реакцію ФогесПроскауера, пдролізує крохмаль, желатшу, не пдролізує сечовину, утилізує цитрат, пропюнат не використовує Культура не росте в анаеробних умовах, не утворює включення полі-роксимасляної кислоти на середовищі МПА з глюкозою, не володіє лецитиназою, індол, сірководень не утворює Штам не патогенний Значним недоліком прототипу є те, що він (штам Bacillus subtihs 26D) інгібує ріст деяких симбіотичних вільноіснуючих та асоціативних азотфіксувальних бактерій, особливо азотобактеру, тобто проявляє бактерицидну або бактеріостатичну дію до деяких виробничих штамів, що ускладнює технологію застосування фітоспорина з азотфіксувальними, фосформобілізуючими і рістстимулюючими біопрепаратами Недоліком прототипу є висока токсична активність як до патогенної, так і до агрономічне цінної мікрофлори, що ускладнює технологію застосування фітоспорина Задачею винаходу було одержання азотфіксувальних штамів бактерій сумісних з мікробними препаратами іншої функціональності, а також з О со 49390 більшістю ХІМІЧНИХ засобів захисту рослин від хвороб та ШКІДНИКІВ З цією метою в робочій колекції азотфіксувальних бактерій Південного філіалу Інституту сільськогосподарської мікробіологи УААН методом зустрічних культур було виявлено найбільш активний антифунгальний штам 6-М - антагоніст фітопатогенних мікроорганізмів Даний штам виділено з ризосфери гороху і за фізіологічними ознаками ідентифіковано як Bacillus polymyxa Технічним результатом винаходу, що заявляється, є значно вища ефективність дії на приріст врожаю злакових культур порівняно з ХІМІЧНИМИ протруйниками, а також, поліпшення кореневого живлення рослин і якості одержаної продукції рослинництва при збереженні та примноженні природної родючості ґрунтів, що досягається завдяки відсутності бактерицидної або бактеріостатичної дії штамів Bacillus polymyxa 6-М до деяких виробничих штамів Характеристика штаму Bacillus polymyxa 6-М Номенклатурні дані рід - Bacillus, вид - Bacillus polymyxa, депонований в колекції Інституту сільськогосподарської мікробіологи УААН Походження штаму Штам Bacillus polymyxa 6М виділено методом аналітичної селекції з ризосфери гороху на агаризованому гороховому середовищі Культурально-морфолопчні ознаки Клітини 3х добової культури штаму Bacillus polymyxa мають паличковидну форму розміром 0,6-0,8х2-5мкм, рухомі Грампозитивні, факультативний анаероб Ендогенна спора еліптичної форми центральнотермінального розташування в чітко роздутому спорангії У рідкому кукурудзяно-мелясовому середовищі спори утворюються на 2-3 добу, на гороховому агарі - на 4-5 добу Зростання біомаси бактерій при ПОСІВІ штрихом на гороховому агарі інтенсивне, штрих блискучий, слизький Колонії на гороховому агарі з'являються на 2-3 добу, мають випуклу округлу форму до 4мм в діаметрі, слизькі, блискучі Фізюлого-бюхімічні властивості Позитивна реакція на молоці з лакмусом Утворює газ Желатин не розріджує Кислотоутворюючий На середовищах з органічним азотом (МПА) не продукує слиз але активно спороутворює, добре розвивається на середовищах з солями амонію, росте на безазотних середовищах, але не утворює спор Штам 6-М активно засвоює глюкозу і сахарозу та на вуглеводних середовищах активно продукує слиз Каталазопозитивний, пдролізує крохмаль, утворює ацетоїн, казеїн розчіплює, відновлює нітрати до нітритів На твердих і в рідких середовищах штам Bacillus polymyxa 6-М росте в температурних межах від 12°С до 33°С, оптимум росту 22-28°С, оптимум спороутворення 16-20°С Зростання бактерій спостерігається в середовищах з діапазоном рН 5,58,5, оптимум рН - 7,0-7,2 Ознаки штаму СТІЙКІ Антибіотична активність за оцінкою за шкалою Джексона і Карла 3 і С, тобто пригнічення фітопатогенних грибів на віддалі у всіх повтореннях досліду Штам є антагоністом 14 видів фітопатогенних грибів збудників широко поширених хвороб сільськогосподарських рослин і безпечний для людини і тварин Зберігають на скошеному гороховому агарі при 3-5°С, пересівають один раз у шість МІСЯЦІВ, для тривалого зберігання (до 3-х років) біомасу штаму наносять на стерильні шматочки фільтрувального паперу і зберігають у стерильному пеніциловому флаконі Бютехнолопчна характеристика Штам Bacillus polymyxa 6-М інгібує розвиток багатьох грибів-збудників розповсюджених захворювань сільськогосподарських рослин, зокрема, крім збудників кореневих гнилей, одночасно не впливає на ріст агрономічне цінних симбіотичних і асоціативних азотфіксувальних і фосформобілізуючих бактерій Культурально-морфолопчна характеристика При культивуванні штаму Bacillus polymyxa 6М у кукурудзяно-мелясному середовищі при температурі 30°С виділяють три основні фази росту культури Експоненціальна фаза починається з моменту внесення посівного матеріалу (молоді вегетативні клітини 14-16 годинна культура), характеризується максимальною швидкістю розмноження клітин і триває 12 годин Вегетативні клітини добової культури грампозитивні, мають паличковидну форму, рухаються за допомогою джгутиків Стаціонарна фаза характеризується максимальним вмістом клітин в одиниці об'єму і триває до 3234 годин від початку культивування (або з моменту інокуляції середовища) Для цієї фази характерно поява спороутворюючих клітин Початок спороутворення відмічається у 28-годинній культурі Масове спороутворення відмічається у 48-годинній культурі При ВИСІВІ на гороховому агарі з вуглеводами колонії Bacillus polymyxa 6-М з'являються на 2-3 добу, мають округлу форму, опуклі, блискучі, слизькі, 2-4мм в діаметрі На твердих і рідких середовищах штам Bacillus polymyxa 6-М росте у температурних межах 1233°С, оптимум - 22-28°С, ріст в межах рН середовища - 5,5-8,5, оптимум рН - 7,0-7,2 Серед вивчених 17 видів фітопатогенних грибів штам Bacillus polymyxa 6-М пригнічує ріст 14 видів, у т ч широко поширені фітопатогени В sorokimana, F Avenaceum, F grammearum та ін Приготування рідкого препарату Оптимізований склад середовища Кукурудзяний екстракт- 15г/л, Меляса бурякова - ЗОг/л, Крейда -1г/л, Вода водопровідна рН довести рідким склом до 7,0-7,2 Культивування на качалці при 220об/хв при температурі 30°С Загальний титр 3-х добової культури 270,0млн/мл Титр вегетативних клітин 3-х добової культури - 40,0млн/мл Титр спор - 230,0млн/мл Антифунгальна активність штамів виявилась досить значною за оцінкою за шкалою Джексона і Карла індекс антагонізму -"З," а частота зустрічаємості цього типу реакцій - "С," що означає пригнічення фітопатогенних грибів на віддалі у всіх по 49390 втореннях досліду В ході досліджень по спектру дії, штам 6-М пригнічував розвиток широкого кола фітопатогенних грибів і серед них таких розповсюджених збудників хвороб сільськогосподарських рослин, як Bipolans sorokmiana, Fusanum avenaceum Sacc , Fusanum grammearum, Tnchotecium roseum, Ascohyta pisi Lib , Cercosporella herpotnchoides Fron , Colletotnchum gloeosponoides Penz, Phomopsis leptostromiformis Bubak , Rhizoctonia violaceae TuL, Sclerotima scleotiorumLib De Вагу, Pseudocercosporella herpotnchoides та ш Порівнювали антифунгальну дію штаму Bacillus polymyxa 6-М з аналогом - Bacillus subtilis 26D який є основою мікробного препарату фітоспорин Встановили, що швидкість росту і спектр антимікробної дм В роїутухаб-М і його антибіотична активність до грибів практично однакова з Bacillus subtilis 26D Однак, одержані результати (табл 1), свідчать про те, що штам Bacillus polymyxa 6-М не інгібує ріст симбіотичних азотфіксувальних бактерій родів Rhizobium і Bradyrhizobium, які утворюють бульбочки на коренях бобових культур (препарат ризобофіт застосовується під бобові культури), діазотрофів агробактерій, ентеробактерій і азотобактеру (препарати ризоагрин, ризоентерин і азотобактерин під злакові та овочеві культури), не заважає функціонуванню фосформобілізуючих штамів бактерій Enterobacter mmipressurahs 32-3 і Agrobactenum radiobacter 10 (універсальні препарати ФМБ 32-3 і агрофіл) Штам аналог - Bacillus subtilis 26D 26D проявляє бактерицидну або бактеріостатичну дію до азотобактеру і деяких інших виробничих штамів бактерій з агрономічне цінними властивостями Отже, отримані результати виявили, що господарська ЦІННІСТЬ штаму Bacillus polymyxa 26D (5М визначається не лише високою антифунгальною активністю, а ще вибірковістю його антагоністичної дії на ризосферні мікроорганізми На послідовних етапах роботи порівнювали вплив даного антифунгального штаму і ХІМІЧНИХ протруйників фундазолу та максиму на чисельність мікроскопічних грибів на поверхні насіння пшениці і ячменю (табл 2) Мікробіологічні висіви змиву з поверхні насіння обробленого вказаними речовинами показали, що дія бюпротекторів не поступається за ефективністю ХІМІЧНИМ препаратам Результати досліджень свідчать, що через 2 години після обробки культурою Bacillus polymyxa 6-М насіння озимої пшениці і ячменю КІЛЬКІСТЬ грибів на їх поверхні порівняно з контролем знижується у 1,3-4,0 рази, через місяць - у 7-9 разів, що на рівні дії фундазолу і майже ВДВІЧІ краще дії максиму Ефективність дії антифунгальних штамів в польових умовах визначали в наукових установах УААН (Одеська ДСГД, Миронівський інститут пшениць їм В М Ремесла, Інститут агроекології та біотехнологм, Інститут сільськогосподарської мікробіологи і його Південний філіал та ш), і вона в середньому склала 2,5 ц/га приросту врожаю злакових культур У виробничому ДОСЛІДІ на південному чорноземі в Криму порівнювали урожайність озимої пшениці, вирощеної з насіння обробленого культурою Bacillus polymyxa П і ХІМІЧНИМ протруйником вітатіурамом При обробці вітатіурамом одержана урожайність 32,0ц/га, при обробці Bacillus polymyxa П-36,4ц/га Отже, ефективність дії бюпротектору на 4,4ц/га була вище за дію ХІМІЧНОГО протруйника Таким чином, азотфіксувальний штам Bacillus polymyxa 6-М є антагоністом широкого спектру мікроскопічних грибів, збудників розповсюджених хвороб сільськогосподарських рослин, але не володіє бактеріцидною або бактеріостатичною здатністю до виробничих штамів-і, завдяки цьому, може використовуватись у практиці сільського господарства як бюпротектор сумісно з іншими мікробними препаратами не заважаючи прояву їх власних функцій азотфіксації, фосформобілізацм, рістстимуляцм та ш Таблиця 1 Антагонізм Bacillus polymyxa 6-М та Bacillus subtilis 26D у відношенні фосформобілізуючих, асоціативних і симбіотичних азотфіксувальних штамів бактерій Виробничі штами бактерій Біопрепарат Azotobacter vmelandn 10702 Azotobacter chroococcum 20, 21 Agrobactenum radiobacter 204 Enterobacter aerogenes 30-ф Enterobacter mmipressurahs 32-3 Alcahgenes paradoxus 207 Flavobactenum Oavum L-30 Bradyrhizobium japonicum 6346 Bradyrhizobium japonicum M-8 Rhizobium legummozarum П-2 Rhizobium legummozarum H-7 Азотобактерин під злаки Азотобактерин під овочі Ризоагрин під пшеницю Ризоентерин під ячмінь ФМБ універсальний Акаліпн під рис Флавобактерин універсальний Ризобофіт під сою Ризобофіт під сою поліпшений Ризобофіт під горох Ризобофіт під нут Зона впливу на ріст бактерій, мм В polymyxa 6-М В subtilis 26D 0 14-23* 0 11-25* - зона повної відсутності росту азотобактеру, *- спостерігається ріст по штриху досліджуваних штамів бактерій 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2-3** 20-40** 2-3** 15-18** 8-Ю** 5-Ю** 15-20** 49390 Таблиця 2 Вплив обробки насіння озимої пшениці і ячменю антифунпальним бюпротектором і ХІМІЧНИМИ протруйниками на прибну мікрофлору насіння Варіант обробки Контроль Bacillus polymyxa 6-М Фундазол Максим КІЛЬКІСТЬ прибів, КУО/п насіння після обробки через 7 діб 1 МІСЯЦЬ пшениця ЯЧМІНЬ пшениця ЯЧМІНЬ 370 630 370 300 2 подини пшениця ЯЧМІНЬ 400 830 100 630 200 230 130 330 ЗО 130 200 ЗО 200 300 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 50 ЗО 130 ЗО ЗО 170