Спосіб одержання сухих бактеріальних препаратів

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству сухи х бактериальных препаратов. Цель изобретения - увеличение выхода жизнеспособных клеток при распылительном высушивании микробных суспензий. В настоящее время сухие бакпрепараты, содержащие жизнеспособные клетки микроорганизмов широко используются в народном хозяйстве. Известен способ защиты и консервирования микроорганизмов глинами, предусматривающий смешивание водных суспензий микроорганизмов и глинистых минералов и последующее удаление избытка влаги до получения состава, в котором клетки покрыты слоем глины (заявка Франции №2394606, кл. С12 К1/08, А 01N 15/00, опубл. 17.07.87). Недостатком данного способа является необходимость многократного отмывания клеток микроорганизмов перед их смешиванием с суспензией глины. Описан способ защиты и стабилизации бактерий, основанный на внесении в бактериальную суспензию глинистых минералов для получения вязкой смеси (заявка Франции № 2611214, МКИ С 12 N 1/20, А 23 Р 1/00, опубл. 26.08.88). Недостатком данного способа является возможная потеря активности и инфицирование полученной вязкой смеси при ее хранении. Предложен способ высушивания дрожжей в смеси с мукой, полученной из выжимок сахарной свеклы (заявка Японии № 61-51876). Такой способ требует сложной дополнительной обработки используемых материалов и к тому же неприемлем для ряда микроорганизмов, для которых введение в среду органических веществ сложного состава может сопровождаться ингибировани-ем роста (например, метанотрофные бактерии). Наиболее близок по технической сущности к заявляемому способ (авт.св. СССР № 1616990. кл. С 12 N 1/02, опубл. 30.12.90) получения сухи х бактериальных препаратов, предусматривающий распылительное высушивание суспензии микроорганизмов после ее смешивания сначала с суспензией глинистого минерала палыгорскита, а затем с сухим молоком и последующим распылительным высушиванием полученной смеси. Однако, введение в такую смесь сухого молока значительно удорожает процесс и может ингибировать жизнедеятельность ряда микроорганизмов (к примеру, метанотроф-ных бактерий) и таким образом не всегда является приемлемым. В основу изобретения поставлена задача создания сухи х бакпрепаратов, в котором благодаря использованию глинистых минералов как на стадии культивирования микроорганизмов, так и при их подготовке к 'распылительному высушиванию обеспечивается взаимодействие клеток с этими высокодисперсными минералами и за счет этого создается удобная для хранения и применения сыпучая форма препарата с высоким титром жизнеспособных бактерий. Поставленная задача решается тем, что в сухи х бактериальных препаратах, полученных методом распылительного высушивания после смешивания суспензии микроорганизмов с глинистыми минералами согласно изобретению глинистые минералы вносятся в два приема. На стадии культивирования бактерий содержание глинистых минералов в питательной среде задают на уровне 0,2-20 г/л, а перед распылительным высушиванием суспензии их концентрацию увеличивают до 20-100 г/л. Пример 1. Культуру микроорганизмов Agrobacterium radlobecter 204 выращивали при 30°С в колбах объемом 750 мл на качалках в течение 2 сут на среде следующего состава (г/л): К 2НРО4 • ЗН2 О - 0,5; КН2РО 4 0,5; MgSO4 • 7Н2О - 0,3; (NH4)2SO4 - f ,0; СаСО3 -1,0; меласса -10,0; кукурузный экстракт - 10,0, рН среды - 7,27,6. В ряд колб вносили различные концентрации палыгорскита, монтмориллонита или другого глинистого минерала (табл.1). В контрольные колбы эти материалы не вносили. Колбы стерилизовали. После этого в них задавали по 50 мл питательной среды вышеприведенного состава, инокулированной данными микроорганизмами. Результат влияния этих минералов на рост микроорганизмов учи тывали по количеству клеток, определяемому путем высева из серийных десятикратных разведений в агаризованную среду (1,5% агара) вышеприведенного состава. Данные исследований свидетельствуют о том, что глинистые минералы заметно повышают ростовую активность эти х микроорганизмов, что выражается в более высокой их численности в присутствие данных минералов, по сравнению с контролем, где они не вносились. В 2 л суспензии микроорганизмов с титром 1,89 * 10 кл/мл, выращенной в присутствие глинистых минералов дополнительно вносили палыгорскит до конечной концентрации 100 г/л. Смесь тщательно перемешивали и высушивали путем распыления. Получено 185 г препарата с влажностью 7,96%. Концентрацию клеток в нем определяли после регидратации в течение трех часов путем высева в агаризованную среду. Количество жизнеспособных бактерий в 1 г препарата составляло 1,8 • 10 клеток (табл.2). Для сравнения использовали 2 л суспензии этих микроорганизмов с титром 1,06 х109 кл/мл, выращенной в отсутствие глинистых минералов. Перед распылительным высушиванием в нее эти минералы также не вносили. Получено 7,2 г сухого препарата, содержащего в 1 г 2,8 • 10 жизнеспособных бактерий (табл.2). Таким образом, выход жизнеспособных клеток в сухом препарате, полученном с глинистым минералом был в 16,6 раза выше, чем в препарате, полученном без этих материалов. Пример 2. Культуру микроорганизмов Agrobacterium radiobacter выращивали с глинистым минералом палыгорскитом в условиях, описанных в примере 1. В 2 л суспензии микроорганизмов с титром 1,89 ' 109 кл/мл вносили палыгорскит до его концентрации 20 г/л. Смесь тщательно перемешивали и высушивали п утем распыления. Получено 30,5 г препарата, влажностью 8,7%. Концентрацию клеток в нем определяли вышеуказанным методом (пример 1). Количество жизнеспособных бактерий в 1 г препарата составляло 4,5 • 1010 клеток (табл.2). Таким образом, выход жизнеспособных клеток в сухом препарате, полученном с глинистым минералом был почти в 7 раз выше, чем в препарате без этих минералов. Пример З. Культур у микроорганизмов Agrobacterium radlobacter выращивали с глинистыми минералами в условиях, описанных в примере 1. В 2 л суспензии микроорганизмов, с титром 1,89 • 109 кл/мл, вносили монтмориллонит до его концентрации 50 г/л. Смесь тщательно перемешивали и высушивали путем распыления. Получено 89 г препарата с влажностью 8,2%. Концентрацию клеток в нем определяли вышеуказанным методом (пример 1). Количество жизнеспособных бактерий в 1 г препарата составляло 3,4 • 1010 клеток (табл.2). Таким образом, выход жизнеспособных клеток в сухом препарате, полученном с глинистым минералом был в 15,1 раза выше, чем в препарате, полученном без этих минералов. Пример 4. Культуру бактерий Methylomonas rub га выращивали в герметичных колбах объемом 750 мл на качалках в течение 2 сут при 30°С в питательной среде следующего состава (в г/л): КН2РО4 - 0,25; К2НРО 4 • ЗН2О - 0,25; KNО 3 - 0,5; MgSO4 х7Н2О - 0,3; NaCI - 3,5; СаСl2 - 0,02; FeCl 3 -0,001, рН среды - 6,7-6,9. Для этого в ряд колб вносили различные концентрации палыгорскита и монтмориллонита. В ряд других колб эти материалы не вносили. Колбы стерилизовали, после чего в них задавали по 50 мл питательной среды вышеприведенного состава, инокулированной данными бактериями. Колбы вакуумировали на 0,3 атм и вакуумированный объем заполняли метаном,' создавая таким образом газовую смесь, необходимую для роста метэнотрофных бактерий, содержащую 30% метана и 70% воздуха. Результат влияния этих минералов на рост метанотрофов учитывали по количеству клеток, определяемому путем высева из серийных десятикратных разведений на поверхность агаризованной среды (табл.3). Данные исследований свидетельствуют о значительном увеличении численности жизнеспособных бактерий в суспензии при их культивировании с глинистыми минералами по сравнению с контролем, где эти минералы не вносили. В 2 л суспензии микроорганизмов с титром 2,3 • 10 кл/мл, выращенной в присутствие 0,5 г/л палыгорскита дополнительно вносили этот минерал до его конечной концентрации 50 г/л (табл.4). Смесь тщательно перемешивали и высушивали путем распыления. Получено 82 г сухого препарата, содержащего в 1 грамме 4,1 • W клеток жизнеспособных микроорганизмов. Для сравнения в 2 л суспензии микроорганизмов с титром 1,5 • 108 кл/мл, выращенной в отсутствие глинистых минералов, эти материалы дополнительно не вносили. Суспензию высушивали методом распыления. Получено 8,3 г препарата. Содержание в нем жизнеспособных бактерий M.rubra составляло 4,4 • 109 кл/г препарата (табл.4). Таким образом, суммарный выход жизнеспособных клеток в препарате, полученном при наличии глинистого минерала почти на порядок был выше, чем в отсутствие этого материала. Таким образом, внесение глинистых минералов в культуральную жидкость позволяет заметно увеличить выход жизнеспособных клеток в сухом препарате микроорганизмов при их получении методом распылительного высушивания.