Спосiб одержання препарату для профiлактики та лiкування шлунково-кишкових захворювань тварин

Изобретение относится к микробиологии и касается производства лечебно-профилактического препарата для животноводчества на основе живых культур молочнокислых бактерий. Известен комплексный микробный "СБА" для лечения желудочно-кишечных заболеваний животных [1]. Препарат "СБА" имеет следующую характеристику, мелкий сухой порошок от кремового до светлокоричневого цвета, содержащий живые клетки молочнокислых бактерий -Lactobacillus asidophylus (1,6.108 кл/г) и Streptococcus faeclum (1,2.108 кл/г). Наиболее близким к заявляемому препарату является сухой ацидофилии [2], обладающий профилактическим эффектом при использовании его для молодняка крупного рогатого скота. Сухой ацидофилии - сухой порошок светло-коричневого цвета, содержащий живые клетки Lactobacillus acidophylus в количестве 2.108 кл/г. В качестве питательной и защитной среды при выращивании и сушке L.acidophylus используют молоко. Однако недостатком препаратов является сравнительно небольшое количество живых клеток молочнокислых бактерий (2-5,5.108 кл/г) и использование дефицитного продукта - молока, применением которого во многом обусловлено действие препарата ацидофилина. В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа получения препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных путем введения в состав препарата специально селекционированных штаммов микроорганизмов в оптимальном соотношении при их предварительном раздельном культивировании в слабокислой среде, что обеспечивает повышенную адгезию большого количества живых клеток микроорганизмов с пищеварительном тракте животных и за счет этого достигается получение биопрепарата с высоким лечебно-профилактическим аффектом. Поставленная задача решается тем, что в способе получения препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, предусматривающем культивирование энтерококков вида Enterococcus faeclum и молочнокислых бактерий в питательной среде, включающей ферментативный гидролизат кормовых дрожжей, при температуре 37-39°С с последующим отделением биомассы и сушкой целевого продукта, согласно изобретению, из вида Enterococcus faeclum используют штамм Enterococcus faeclum ВКПМ В2579, из молочнокислых бактерий - штамм Lactobacillus salivarius ВКПМ В-2581, культивирование и сушку биомассы осуществляют отдельно, причем при культивировании штамма Lactobacillus salivarius ВКПМ В-2581 устанавливают рН питательной среды 5,7-6,1, а после сушки культуры штаммов Enterococcus faeclum ВКПМ В2579 и Lactobacillus salivarius ВКПМ В-2581 смешивают в соотношении 7-9 : 1-3 по весу соответственно. Штамм Enterococcus faeclum K-50 - факультативный анаэроб, каталазоотрицательный, не образует псевдокаталазу, гидролизует эскулин, образует аммиак из аргинина. Сворачивают молоко, образуя 0,15-0,3% молочной кислоты на 14 сутки, восстанавливает молоко с лакмусом и метиленовой синью. Расчет в среде с 6,5% NaCl, 4% таурохолата натрия. Штамм отнесен к роду Enterococcus, растет при температуре + 10° и 50°С, оптимальная температура роста 37-44°С, оптимальное рН среды 6,5-6,7. Штамм синтезирует витамины группы В: тиамин (B1), рибофлавин (B2), никотиновую кислоту (В5), пиридоксин (B6), биотин (В7) (табл. 1). Витамины накапливаются внутри клеток, 3-10% общего синтеза пиридоксина, биотина и никотиновой кислоты выделяется в культуральную жидкость. Штамм обладает высоким индексом адгезивности к энтеро-цитам КРС-6.1 (табл. 3). Штамм Lactobacillus salivarius K-278 б факультативный анаэроб, каталазоотрицательный, не образует псевдокаталазу, не гидролизует эскулин, образует аммиак из аргинина. Сворачивает и слабо пентомизирует молоко, образуя 0,8-0,9% молочной кислоты на 14 сутки, восстанавливает молоко с лакмусом и метиленовой синью. Не растет в бульоне с 6,5% NaCl, растет при 4% таурохолата натрия. Штамм относится к подгруппе Thermobacterium рода Lactobacillus. Оптимальная температура роста 37-44°С, рост при + 15° и 50° отсутствует, оптимальное рН среды от 5,7 до 6,1. Штамм синтезирует витамины группы В: тиамин (В1), рибофлавин (В2), никотиновую кислоту (В5), пиридоксин (B6), биотин (В7). Витамины накапливаются внутри клеток, 3-10% общего синтеза пиридоксина, биотина и никотиновой кислоты выделяются в. культуральную жидкость. Штамм обладает средним индексом адгезивности к энтероцитам КРС (2.01) (табл. 1, 3). Изобретение поясняется примерами. Способ получения сухи х монокультур молочнокислых бактерий (табл. 2). Пример 1. Готовят питательную среду следующего соста ва: ферментолизат крахмала - 1,8% по РВ: ферментолизат БВК - 60 мг % по аминному азоту; кукур узный экстракт - 0,3%; рН - 6,6. В питательную среду вносят 1% 18-14-часовой культуры Е, faecium К-50 и выращивают в течение 8-10 часов при температуре 38±1°С и рН = 6,6, с постоянно работающей мешалкой (200 об/мин) без подачи воздуха. Постоянное рН поддерживают подачей 20% водного раствора аммиака. По окончании процесса ферментации титр клеток Е. faecium составляет 6.109 кл/мл. Затем культуральную жидкость концентрируют сепарированием и высушивают на растительной сушилке в мягком режиме при температуре на входе - 110°С и на выходе - 40°С. Титр клеток сухого препарата составляет 160.109кл/г. Во втором ферментере выращивают в течение 8-10 часов культуру L. salivarius 2786 (1 % инокулята) при температуре 38±1°С, рН - 6,0 на среде следующего состава: ферментолизат крахмала - 2,4% по РВ; ферментолизат БВК - 80 мг % по аминному азоту, кукур узный экстракт - 0,3%. По окончании процесса ферментации титр клеток L. salivarius составляет 4 .109 кл/мл. Культуральную жидкость концентрируют в режиме, описанном выше. Титр клеток сухого препарата составляет 6.108 кл/г. Пример 2. Получение монокультур осуществляют как описано в примере 1, за исключением того, что питательная среда содержит 200 мг% аминного азота. Процесс ферментации каждой культуры удлиняется на 4,5 часа, титр клеток в сухом препарате Е. faecium К-50 составляет до 90.109 кл/г, L. sallvarius 2786 - 5-107 кл/г, что ниже на 75%, чем в примере 1. Большое количество азота в питательной среде угнетает рост и деление клеток, что отрицательно сказывается на их жизнедеятельности при сепарировании и высушивании. Пример 3. Получение монокультур осуществляют как описано в примере 1, за исключением того, что рН при выращивании Е, faecium устанавливают для Е,. faecium К-50-5,5, а для L. sallvarius - 7,0. Клетки растут медленнее, процесс ферментации удлиняется на 5 ч. Титр клеток в сухом препарате E. faecium - 80.109 кл/г, L. salivarius 2786-3.108 кл/г, что ниже на 50%, чем в примере Т. Для получения цельного препарата проводят смешение сухого E. faecium К-50 и L. salivarius 2786 в соотношении 80:20. Стандартизируют препарат кукурузной мукой. Готовый продукт содержит в 1 г 50 млрд. жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий. Установление оптимального соотношения монокультур молочнокислых бактерий, способных адгезировать в пищеварительном тракте, подтверждено экспериментально и представлено в табл. 3. С применением препарата эффект достигается в первые же дни с момента рождения теленка. До первого сосания животное получает препарат. В динамике развития E. faeclum имеют высокую скорость роста, дает генерацию каждые 30 минут, он быстро размножается в кишечнике, заселяя его эпителий, тем самым инактивируя действие патогенных микроорганизмов, попадающих из окружающей среды, усиливает процесс формирования иммунитета у животного в молозивный период. Затем L. sallvarius начинает размножаться, усиливая антагонистическую активность Е. faecium и способствуя формированию здорового микробного ценоза. Кроме того, продуцирование молочной кислоты, витаминов группы В и биологически активных веществ штаммами в комплексе делает их природными антиоксидантами, способными предотвращать перекисные процессы в организме новорожденного животного, у которого еще слабо развита пищеварительная система. Оба штамма Е. faecium К-50 и L. sallvarius 2786 устойчивы к антибиотикам тетрациклинового ряда, левомицетину и др., что особенно важно для нормализации микрофлоры кишечника и улучшения роста животных.