Спосіб ранньої діагностики злоякісних пухлин

Спосіб ранньої діагностики злоякісних пухлин, що включає операцію дослідження цитогенетичних порушень хромосомної організації на клітинах крові, за результатами якої виконують ранню діагностику злоякісних пухлин, який відрізняється тим, що операцію дослідження цитогенетичних порушень хромосомної організації на клітинах крові виконують на стадії інтерфазного поділу клітин стадії максимальної деконденсації гетерохроматину та реплікації ДНК/гетерохроматину. Пропонована корисна модель відноситься до медицини, зокрема до способів ранньої діагностики злоякісних пухлин. Найбільш близьким до пропонованого способу за сукупністю суттєвих ознак є спосіб ранньої діагностики злоякісних пухлин, що включає операцію дослідження цитогенетичних порушень хромосомної організації на клітинах крові, за результатами якої виконують ранню діагностику злоякісних пухлин [Деклараційний патент України на винахід №64533 А, МПК7 А61В5/00, G01N33/49, G01N33/48; дата публікації: 16.02.2004р., Бюл. №2, 2004р.]. У відповідності до описаного способу ранню діагностику встановлюють на основі виявлення деконденсації центромерного гетерохроматину у вигляді дифузії центромер (за DAPI гетерохроматин-специфічним флуоресцентним барвником), як критерію появи передчасного розділення хроматид та С-анафазного каріотипу на стадії метафази мітотичного поділу клітин крові, поза пухлиною. Недоліком описаного способу є невизначеність молекулярно-генетичних підстав надмолекулярних змін деконденсації гетерохроматину на стадії метафази, оскільки в мітотичному поділі клітини стадія метафази (G2/M) є ключовою стадією для визначення максимальної конденсації та упаковки гетерохроматину перед розходженням хроматид до мітотичного веретина та цитокінезом. Окрім сказаного, недоліком описаного способу є і невизначеність стану гетерохроматину на попередній стадії мітотичного поділу - стадії інтерфазної деконденсації та реплікації гетерохроматину (G1/S). У основу пропонованої корисної моделі поставлено задачу створення більш чутливого способу ранньої діагностики злоякісних пухлин, за рахунок створення умов для визначення молекулярногенетичних підстав надмолекулярних змін деконденсації гетерохроматину на стадії метафази, а також визначення стану гетерохроматину на попередній стадії мітотичного поділу - стадії інтерфазної деконденсації та реплікації гетерохроматину (G1/S), який би розширив уяву про механізми порушення хромосомної організації при пухлинній прогресії. Поставлена задача вирішується використанням пропонованого способу, який, як і відомий спосіб ранньої діагностики злоякісних пухлин, містить операцію дослідження цитогенетичних пору (19) UA (11) 15113 (13) U (21) u200512022 (22) 14.12.2005 (24) 15.06.2006 (46) 15.06.2006, Бюл. № 6, 2006 р. (72) Швачко Людмила Павлівна, Бух Інна Георгіївна, Степаненко Аркадій Павлович, Процик Володимир Семенович, Кікоть Володимир Онуфрійович, Климнюк Григорій Іванович, Гульчій Микола Васильович (73) ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, ІНСТИТУТ ОНКОЛОГІЇ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ, Швачко Людмила Павлівна, Бух Інна Георгіївна, Степаненко Аркадій Павлович, Процик 3 15113 4 шень хромосомної організації на клітинах крові, за досліджень у динаміці розвитку злоякісної клітинрезультатами якої виконують ранню діагностику ної трансформації. злоякісних пухлин, а, відповідно до пропозиції, Авторами встановлено, що на стадії інтерфази операцію дослідження цитогенетичних порушень мітотичного поділу клітин крові у хворих на онкохромосомної організації на клітинах крові виконулогічну прогресію має місце принципова гетерохють на стадії інтерфазного поділу клітин - стадії роматизація за специфічним до герерохроматиномаксимальної деконденсації гетерохроматину та вих ройонів DAPI-флюоресцентним аналізом та реплікації ДНК/гетерохроматину. Hoechst 33258 (також специфічним флюорохроСуть пропонованої корисної моделі пояснюмом до АТ-зв'язування переважно сателітних ДНКється графічними матеріалами та фотографіями, повторів гетерохроматинових районів), який викоде: ристовують в кількісному аналізі синтезу та репліНа Фіг.1 показано інтенсивність флюоресценкації ДНК (див. Фіг.2). Окрім того, експериментальції інтерфазних ядер бласттрансформованих лімно встановлено, що саме ампліфікація Aluфоцитів крові у хворих на онкологічну прогресію за повторів, сателітних перецентромерDAPI та Hoechst 33258 флюорохромів, типових до них/центромерних ДНК-повторів, корелює з гетеАТ-зв'язування сателітних ДНК повторів гетерохрохроматинізіцією за рахунок екстрареплікації інроматину, а також специфічна індукція інтенсивнотерфазного гетерохроматину ядерних лімфоцитів сті флюоресценції інтерфазного гетерохроматину у хворих з онкологічною прогресією та при дії ДНКпри дії 5'-аза-цитидин-ДНК-деметилюючого реагедемитилюючого реагенту 5-аза-цитидину в культунту в культурі лімфоцитів здорових донорів. рі лімфоцитів здорових донорів (Ф3). На Фіг.2 наведена діаграма, де показано інтеПропонований спосіб здійснюють так. нсивність флюоресценції інтерфазних ядер бластКлітини периферійної крові як онкохворих, так і трансформованих лімфоцитів крові у хворих на контрольних здорових донорів, культивували на онкологічну прогресію та при дії 5'-аза-цитидинсередовищі RPMI 1640 з 10% ембріональною теДНК-деметилюючого реагенту в культурі лімфоцилячою сироваткою в присутності мітогенстимулютів здорових донорів. ючого фітогемаглютиніну для отримання мітотичНа Фіг.3 показана специфічна ампліфікація тиних хромосом та бласттрансформованих пових перицентромерних/центромерних Alu-ДНК інтерфазних клітин лімфоцитів на протязі 48 або повторів за DIG-Alu dot-гібридизацією геномних 72год. при 37°С, синхронізуючи культуру клітин з ДНК лімфоцитів хворих на онкологічну прогресію. застосуванням колхіцину [McGregor Н.С.; Varley На Фіг.4 показана специфічна ампліфікація саJ.М. Working with Animal Chromosomes., Wiley, New телітних Alu-ДНК повторів прицентромерноYork 1983.]. Методика культивування, отримання го/центромерного гетерохроматину в культури препаратів метафазних хромосом та інтерфазних лімфоцитів здорових донорів при дії 5'-азабласттрансформованих клітин лімфоцитів є базоцитидин-ДНК-деметилюючого реагенту. вою, як для способу-прототипу, так і для пропоноЗа специфічними до гетерохроматину DAPI та ваного способу. Однак, об'єктом досліджень у споHoechst 33258 (флюорохромами) виявлено достособі прототипі були метафазні хромосоми ядерних вірний приріст флюоресценції інтерфазного гетелімфоцитів крові хворих на онкологічну прогресію, рохроматину, що корелював з ампліфікацією Alu та виявлення принципової кореляції з деконденсаДНК повторів - типових сателітних повторів прицецією перицентромерного/центромерного гетерохнтромерного/центромерного гетерохроматину, як роматину, що спричинює специфічні аномалії мепри онкологічній прогресії, що супроводжується тафазних хромосом, асоційованих з передчасним геномним ДНК гіпометилюванням, так і при дії 5розділенням сестринських хроматид та появою Саза-цитидину ДНК-деметилюючого реагенту анафазного каріотипу в популяції метафазних (Фіг.3). хромосом. Об'єктом досліджень пропонованого В основі дослідження авторів лежить концепспособу є подальший цитогенетичний аналіз гетеція соматичного мутагенезу канцерогенного типу, рохроматину на стадії інтерфази клітинного подіяк стратегія для пошуку ранніх молекулярних та лу, як ключової стадії деконденсації та реплікації надмолекулярних змін у геномі соматичних клітин хромосом - G1/S-фази. Отримані препарати інтепоза пухлинною, змін, адекватно асоційованих з рфазних ядер фітогемаглютинініндукцією канцерогенезу та онкологічного захвобласттрансформованих лімфоцитів за допомогою рювання зокрема. Головного змісту соматичного фіксатору, за складом: 96 % етанол та льодова мутагенезу канцерогенного типу набуває поняття оцтова кислота (у співвідношенні 3:1, extempore), передканцерного механізму пухлинної прогресії, аналізували за специфічними до гетерохроматину вирішення якого автори обмежують дослідженням та реплікації ДНК DAPI та Hoechst 33258 флюоретаких змін на рівні соматичних клітин крові, а саме сцентними барвниками, специфічними до АТядерних лімфоцитів у хворих з різним типом перзв'язування переважно ДНК сателітних послідоввинних солідних пухлин та пов'язують з генетичностей гетерохроматину (спектри емісії 450nm та ними молекулярними/надмолекулярними марке465nm, відповідно) із застосуванням флюоресценрами, неспецифічними до етнології пухлини, що тного мікроскопу Axiotar plus FL фірми ZEISS (Німожуть зумовлювати розробку системи ранньої меччина) та програми "Scion Image". Під час досдіагностики та прогнозування онкологічних захволіджень за пропонованим способом виявлені рювань на клітинах крові. Саме геном соматичних принципові кількісні зміни інтерфазного гетерохклітин, а не пухлини, як наслідку соматичного муроматину, що корелюють з онкологічною прогресітагенезу канцерогенного типу, стає епіцентром єю (див. Фіг.1). Показано, що в основі значного збільшення флюоресценції інтерфазного гетерох 5 15113 6 роматину при онкологічній прогресії, у порівнянні з линною прогресією та узгоджується з верифікаціінтерфазним гетерохроматином здорових донорів, єю клінічного онкодіагнозу. Приклад 2 за DAPI та Hoechst 33258 аналізом (на 72% 5,45 Хворий P., 12 років, з клінічним діагнозом пухта 86% 6,21, відповідно) (див. Фіг.2), лежить принлина Юнга, пройшов лікування з хірургічним втруципова екстрареплікація гетерохроматину, що чання у дитячому відділенні Інституту онкології асоціюється з ампліфікацією Alu-повторів, найчиАМН України. За способом корисної моделі аналісельніших у геномі людини типових сателітних зували культуру фітогемаглютинінДНК-повторів перицентромерного/центромерного бласттрансформованих лімфоцитів периферійної гетерохроматину (див. Фіг.3) та корелює як з глокрові хворого на стадії інтерфазних ядер за допобальним геномним ДНК-гіпометилюванням, виявмогою DAPI та Hoechst 33258 специфічних до геленим при пухлинній прогресії на клітинах крові як терохроматину флюорохромів у порівняльному з у онкологічних хворих [див. заявку на корисну моконтролем визначенні інтенсивності флюоресцендель №u200508943 від 21 вересня 2005р.], так і ції інтерфазного гетерохроматину лімфоцитів хвопри дії специфічного ДНК-деметилюючого реагенрого. Принципове збільшення інтенсивності флюту 5'-азацитидину в культурі лімфоцитів здорових оресценції (на 64±5,31%) інтерфазного донорів на протязі 72год. культивування при 37°С гетерохроматину на стадії реплікації ДНК, за да(Фіг.3, 4). За пропонованим способом саме принним способом ранньої цитогенетичної онкодіагноципове збільшення інтенсивності флюоресценції стики на соматичних клітинах крові, поза пухлиною інтерфазних ядер клітин лімфоцитів у онкологічних - корелювало з верифікацією клінічного діагнозу хворих за рахунок специфічно-індукованої ДНКонкологічного захворювання. гіпометилюванням екстрареплікації перицентроПриклад 3 мерного/центромерного гетерохроматину набуває Хвора Б., 48 років, пройшла лікування з хірурчинника адекватного цитогенетичного маркеру, а гічним втручанням за клінічною верифікацією діагтому може бути використаний для ранньої діагноснозу - карцинома щитоподібної залози. За спосотики онкологічних захворювань на клітинах крові, бом корисної моделі аналізували інтенсивність поза пухлиною. флюоресценції інтерфазних ядер фітогемаглютиПриклад 1 нін-бласттрансформованих лімфоцитів перифеХвора P., 26 років, з клінічним діагнозом лімрійної крові хворої за специфічними до гетерохрофосаркома пройшла лікування з хірургічним втруматину DAPI та Hoechst 33258 флюорохромами, чанням в Центрі лікування та реабілітації хворих де визначався достовірний приріст флюоресценції на патологію щитоподібної залози м. Києва. Аналіз інтерфазного гетерохроматину у порівнянні з контядерних клітин лімфоцитів периферійної крові ролем здорових донорів на 74+6,23%, який корехворої за способом порівняння з контролем здоролював з онкологічною прогресією. вих донорів інтенсивності флюоресценції гетерохОтже, чинник гетерохроматинізації інтерфазроматину інтерфазних ядер бласттрансформованого гетерохроматину є принциповим генетичним них лімфоцитів за DAPI та Hoechst 33258 надмолекулярним маркером, що асоціюється з (специфічних до АТ-зв'язування сателітних посліглобальним ДНК-гіпометилюванням на рівні генодовностей ДНК гетерохроматину) флюорохромів му соматичних клітин крові, поза пухлинною, у засвідчує значний рівень інтенсивності флюоресхворих на онкологічну прогресію, а тому може виценції (на 72±4,28%) за рахунок гетерохроматинікористовуватись у системі ранньої діагностики зації на стадії реплікації ДНК, що корелює з пухонкологічних захворювань. 7 Комп’ютерна верстка Н. Лисенко 15113 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601