Спосіб ранньої діагностики злоякісних пухлин

Пропонований винахід відноситься до медицини, зокрема до онкології. Він може бути застосований для ранньої діагностики злоякісних пухлин. Відомий спосіб ранньої діагностики злоякісних пухлин, відповідно до якого шкіру хворого сканують парою когерентних відбитих променів і визначають зони анізотропії, за якою діагностують злоякісну пухлину [Патент України №17968, МПК 6А61В5/00; А61Н39/00. Опубл. 31.10.1997. Бюл. №5]. Описаний спосіб може бути широко застосований у практиці профілактичних оглядів, може дати інформацію для подальших досліджень хворого, але не дає можливості поставити остаточний діагноз, через наявність, наприклад, на шкірі хворого забруднень, звичайного або незвичайного загару (від електричної дуги), мутацій шкіри і т. ін. Тому згаданий спосіб може бути використаний лише для відбору пацієнтів для подальших досліджень. До того ж, коли результат дії злоякісної пухлини вже вийшов на шкіру, остання достатньо розвинена в організмі і для лікування пацієнта треба залучити досить значні засоби, наприклад хіміотерапію. Тобто, описану діагностику важко назвати ранньою. Також відомий спосіб ранньої діагностики гострого лімфбластного лейкозу, побудований на виявленні передчасного розділення центромер (точніше, є передчасне розділення сестринських хроматид, оскільки в мітотичній хромосомі однією центромерою утримуються 2 хроматиди) та появи С-анафази на стадії мітотичного поділу клітин крові з гострим лімфобластним лейкозом, що може визначатися суттєвою діагностичною ознакою в даній патології онкозахворювання поряд з високим процентом бластоутворення та бластних кризів /Сіренко А.Г. Передчасне розділення центромер метафазних хромосом, як перспективний діагностичний і прогностичний маркер при гострій лімфобластній лейкемії у дітей. - дисертація на здобуття вченого ступеня канд.біол.наук. Львів: Львівський науково-дослідний інститут спадкової патології. – 1999. Недоліком способу є те, що в ньому не визначені критерії, що стосуються саме ранньої діагностики онкологічного захворювання. Найбільш близьким до пропонованого способу за сукупністю суттєви х ознак є спосіб ранньої діагностики злоякісних пухлин, який містить операції дослідження цитогенетичних порушень хромосомної організації на клітинах крові шляхом використання генетичних маркерів, по результатам якого виконують ранню діагностику злоякісних пухлин [Loren S. Michel, Vasco Liberal, Anupam Chatterjee. MAD2 haplo-insufficiency causes premature anaphase and chromosome instability in mammailian cells. -Nature. Vol 409. 18 January 2001]. Спосіб побудований на тому, що на клітинних пухлинних лініях колоректального раку, раку легенів та раку молочної залози виявляються мітотичні аномалії хромосом - передчасне розділення сестринських хроматид та Санафаза (передчасне розділення сестринських хроматид усіх хромосом метафазного каріотипу) Автори описаного способу пов'язують ці порушення з мутацією білку MAD 2, що контролює приєднання хромосом до мітотичного веретена. Не дивлячись на те, що молекулярний механізм, який відповідає за розвиток анеуплоїдій у канцерогенезі лишається до кінця не з'ясованим, автори визнають появу С-анафази на стадії мітотичного поділу клітин як важливу передумову для розвитку анеуплоїдного каріотипу у п ухлинних клітинах. Недолік описаного способу полягає у невизначеності критеріїв оцінки змін в механізмі формування та упаковки гетерохроматинових блоків центромерних районів мітотичних хромосом як фази злоякісного процесу, пов'язаної з нестабільністю центромер, наслідком якої є насамперед передчасне розділення сестринських хроматид та поява С-анафази на стадії мітозу. У основу пропонованого винаходу поставлено задачу створення такого способу ранньої діагностики злоякісних пухлин, який дозволив би визначити фазу злоякісного процесу у особи шляхом визначення критеріїв змін в механізмі формування та упаковки гетерохроматинових блоків перицентромерних/центромерних районів мітотичних хромосом, що проявляються у дифузії центромер, як головного критерію нестабільності та появи аномального передчасного розділення сестринських хроматид на стадії мітозу в соматичних клітинах крові при канцерогенезі. Поставлена задача вирішується використанням пропонованого способу, який, як і відомий спосіб ранньої діагностики злоякісних пухлин, містить операції дослідження цитогенетичних порушень хромосомної організації на клітинах крові шляхом використання генетичних маркерів, по результатам якого виконують ранню діагностику злоякісних пухлин, а, відповідно до винаходу, ранню діагностику встановлюють на основі виявлення деконденсації перицентромерного/центромерного гетерохроматину у вигляді дифузії центромер (за DAPI гетерохроматин-специфічним флуоресцентним барвником), як критерію появи передчасного розділення хроматид та С-анафазного каріотипу на стадії мітотичного поділу клітин крові поза пухлиною. У пропонованому способі визначена характерна асоціація хромосомальних порушень, що виявляються в організації мітотичних хромосом лімфоцитів периферичної крові поза пухлиною та корелюють з пухлинною прогресією. Зокрема, встановлено, що деконденсація перицентромерного/центромерного гетерохроматину корелює з нестабільністю центромерних районів хромосом, яка виявляється у передчасному розділенні сестринських хроматид окремих хромосом (від 1 до 15-20 хромосом каріотипу) та появи окремих клітин з Санафазним каріотипом (50-100% передчасного розділення сестринських хроматид в метафазному каріотипі). Спосіб, що пропонується, відпрацьований на групі хворих з не спадковими формами злоякісних пухлин щитовидної залози, колоректального раку, нейробластоми та пухлини Вільямса, які проходили лікування в Київському Центрі патології щитовидної залози (клінічна лікарня №16) та в Інституті онкології АМН України (Відділення голови та шиї, проктологічне відділення, дитяче відділення). Контрольною групою була група здорових донорів (Табл.1). Таблиця 1 Хромосомальні аномалії клітин крові (культивовані мітоген-стимульовані лімфоцити периферичної крові на стадії мітотичного поділу), що корелюють з онкологічною пухлинною прогресією Клінічний діагноз Мікрокарцинома Щитовидної залози (n=90) Карцинома Щитовидної залози 1-2ст. (n=60) Карцинома Щитовидної залози 3-4ст. (n=40) Колоректальнийрак (n=75) Нейробластома (n=8) Пухлина Вільмса (n=6) Контроль (здорові донори) (n=20) Дифузія Передчасне (декон - розділення денсація) сестринсь - С-анафаза ких центрохроматид мер 100% 10-15% 100% 68% 5-10% 100% 74% 10-30% 100% 65% 5-20% 100% 100% Примітка: з розрахунку на 100 метафаз. Суть винаходу пояснюється фотографіями, де показана деконденсація перицентромерного/центромерного гетерохроматину, що виявляється у ди фузії центромер на стадії мітотичного поділу лімфоцитів крові у хворих з онкологічною пухлинною прогресією (за DAPI-4, 6-діамідіно-2-феніліндоловим флуоресцентним барвником на гетерохроматинові райони хромосом). На фіг.1 - кров здорових донорів (контроль). На фіг.2 - кров хворих з онкологічною прогресією - карцинома щитовидної залози. На фіг.3 - кров хворих з онкологічною прогресією - нейробластома. На фіг.4 - кров хворих з онкологічною прогресією - пухлина Вільмса. На фіг.5 - показано передчасне розділення сестринських хромотид мітотичних хромосом клітин периферичної крові у хворих на рак щитовидної залози (перший-другий ступінь). На фіг.6 - показана поява С-анафази на стадії мітотичного поділу клітин периферичної крові у хворих з карциномою щитовидної залози (третій-четвертий ступінь). Об'єктом досліджень становили хромосоми клітин периферійної крові здорових осіб та хворих на злоякісні пухлини щитовидної залози, колоректального раку, нейробластоми та Вільмса (пухлина нирки). Дослідження проводили на базі клінічного Київського Центру патології щитовидної залози (проф. Степаненко А.П., головний лікар, канд. мед. наук Гульчій М.В.) та клінічного Інституту онкології АМН України (проф. Процик B.C., проф. Кікоть В.А., канд.. мед. наук Климнюк Г.І.) згідно з Угодами про співробітництво між Інститутом молекулярної біології і генетики НАНУ, Інститутом онкології АМНУ і Інститутом щитовидної залози. Конституцію каріотипу метафазних хромосом досліджували у клітинах крові , що культивувались на протязі 48-72-х годин у середовищі RPMI - 1640 за умов фі тогемаглютинін-мітогенної стимуляції лімфоцитів (РНА, Gibco "P"). Поділ клітин зупиняли за 1-1,5 годин до закінчення культивування шляхом введення колхіцину у кінцевій концентрації 0,4мкг/мл. Препарати метафазних хромосом отримували за стандартною методикою з використанням колхіцину [Г. Макгрегор, Дж. Варли «Методы работы с хромосомами животных».- Москва: «Мир». -1986. -С.10-16]. Отримані препарати хромосом фарбували азуреозином (Гімза) та реєстрували передчасне розділення сестринських хроматид, яке охоплювало від 1 до 15 хромосом каріотипу (фіг.5). Мета фазні пластинки з передчасним розділенням 50-100% реєструвались як С-анафазний каріотип (фіг.6). Візуалізацію перицентромерного/центромерного гетерохроматину проводили шляхом інкубації препаратів метафазних хромосом з DAPI-4, 6-діамідіно-2-феніліндоловим флуоресцентним барвником на гетерохрматинові райони, у кінцевій концентрації 2мкг/мл на протязі інкубування 10 хвилин при 37°С. За допомогою DAPI реєстрували деконденсацію перицентромерного/центромерного гетерохроматину та дифузію центромер. Візуалізацію препаратів метафазних хромосом проводили за допомогою мікроскопу (фірма "Zeiss", Німеччина) з системою флуоресцентних фільтрів та фотопристроєм. Приклади здійснення пропонованого способу діагностики злоякісних пухлин на соматичних клітинах крові. Приклад 1. Хвора С., 54 років, надійшла до лікарні №16 , де під час перебування та традиційного тестування (УЗІдіагностика, аналіз гормонів щитовидної залози та локальна біопсія на морфологічний аналіз клітин) був поставлений діагноз багатоузлового зобу. Під час використання пропонованого способу були виявлені характерні цитогенетичні аномалії на соматичних клітинах крові хворої, що асоціюються з онкологічною прогресією в організмі хворої, а саме, на стадії мітотичного поділу лімфоцитів крові виявлена деконденсація центромерного гетерохроматину хромосом мітотичного каріотипу та 6 С-анафазні каріотипи з передчасним розділенням хроматид (на 100 метафазних пластинок). Після тотального хірургічного видалення щитовидної залози мала місце верифікація діагнозу хворої як багатоузловий зоб з мікрокарциномою. За статистикою клінічних обстежень в Київському центрі патології щитовидної залози саме багатоузлові зоби на 15-20% асоційовані з ризиком злоякісного переродження окремих мікроузлів щитовидної залози, повний морфологічний аналіз яких стає об'єктивно неможливим та потребує універсальних генетичних методів ранньої діагностики злоякісних пухлин. Приклад 2. Хвора К., 52 років, надійшла до лікарні №16 , де під час традиційного тестування був поставлений діагноз карциноми щитовидної залози До хірургічного втручання, під час використання пропонованого способу, у клітинах крові хворої на стадії мітотичного поділу лімфоцитів периферичної крові було виявлено дифузію центромерних районів хромосом за DAPI - гетерохроматин-специфічним аналізом, 16 клітин з передчасним розділенням сестринських хроматид та 1 С-анафазу (на 24 метафазних пластинках), що свідчило за пропонованим способом про злоякісний процес в організмі хворої. Даний ступінь маніфестації хромосомного дисбалансу корелював з клінічною верифікацією діагнозу хворої як карциноми щитовидної залози 3-го ступеню після тотального хірургічного видалення. Приклад 3. Хвора К., 47 років, надійшла до Інституту онкології АМН України в проктологічне відділення з діагнозом коло ректальний рак. До операційного втручання був використаний пропонований спосіб діагностики злоякісного пухлинного процесу на клітинах периферичної крові хворої. Під час використання пропонованого способу в популяції лімфоцитів на стадії мітозу мали місце загальна деконденсація перицентромерного/центромерного гетерохроматину, що спричинює явища дифузії центромер, каріотипу за пропонованим способом, як причини центромерної нестабільністі, пов'язаної з передчасним розділенням сестринських хроматид на стадії мітозу. Так в популяції лімфоцитів хворої було виявлено 24% клітин (на 100 аналізованих метафаз), що мали передчасне розділення хроматид на стадії мітозу. С-анафазний каріотип не зареєстровано. Після хірургічного втручання мав місце позитивний цито-морфологічний аналіз на злоякісні клітини видаленої пухлини у хворої. Таким чином, використання пропонованого способу забезпечило коректну ранню діагностику злоякісних пухлин за рахунок виявлення змін в механізмі формування та упаковки гетерохроматинових блоків перицентромерних/центромерних районів мітотичних хромосом, що проявляються у загальній деконденсації перицентромерного/центромерного гетерокроматину та дифузії центромер і визначення його, як головного критерію центромерної нестабільності та появи аномального передчасного розділення сестринських хроматид на стадії мітозу в соматичних клітинах крові, що корелюють з канцерогенезом та є одним ланцюгом трансформації каріотину.