Спосіб генетичного маркування і відбору дерев з великою кількістю гетерозиготного насіння у природних популяціях ялиці білої

Спосіб генетичного маркування і відбору дерев з великою кількістю гетерозиготного насіння 3 деревних рослин, до яких належатьхвойні, внесок чоловічих генів (пилку) у створення потомства можливо контролювати тільки за цілеспрямованих схрещуваннях, тому що запліднення рослин, які запилюються перехресне у природних популяціях і штучних насадженнях, є випадковою подією, що залежить від багатьох факторів. Тому при селекційному відборі рослин у деревостанаххвойних генетичні показники насіннєвого потомства можливо прогнозувати лише у відношенні материнських рослин. Відомо, що генетичні особливості дорослих рослин обумовлюють генетичну якість насіння. Як прототип вибрано спосіб відбору життєздатних, потенційно високопродуктивних рослинхвойних за рахунок визначення їх генетичної різноманітності на прикладі сосни звичайної [А. с. 1281216 СССР МКИ А 01 H 1/4, А 01 G 23/00. Способ отбора сеянцевхвойных растений / Духарев В.А., Животовский Л.А. – 1987], в якому аналізують 3 ізоферментні локуси неспецифічних естеразхвої сіянців. Ці локуси використовують для визначення якісного вмісту білків, аналізуючи отриману електрофоретичним шляхом ділянку ізоферментного спектру, що кодує синтез естераз, і виділяють рослини, які мають максимальну або близьку до неї генетичну гетерогенність даної ділянки. Загальними ознаками рішення, що заявляється, і прототипу є: спосіб селекційного відбору рослинхвойних, що характеризуються кращими генетичними показниками, використовуючи в якості генетичних маркерів ізоферментні локуси. Однак, в описаному способі аналізувались лише сіянці, з яких до створення штучних насаджень рекомендовано використовувати окремі, що мають найбільшу генетичну різноманітність. Але для створення лісонасіннєвих плантаційхвойних необхідно проводити пошук таких дерев та генетичних маркерів (ізоферментних локусів), за якими можливо відбирати рослини, що продукують насіння з покращеними генетичними якостями (гетерозиготне). При цьому слід мати на увазі, що ізоферментні локуси як генетичні маркери материнського дерева мають видову специфіку. В основу корисної моделі поставлене завдання розробки способу генетичного маркування у природних популяціях ялиці білої дерев, що продукують насіння з великою кількістю гетерозигот. Поставлене завдання вирішується тим, що у способі генетичного маркування дерев ялиці білої з великою кількістю гетерозиготного насіння, відповідно до корисної моделі, у якості генетичних маркерів використовують ізоферментні локуси 16545 4 глутаматоксалоацетаттрансамінази Got-3, алкогольдегідрогенази Adh-1 і кислої фосфатази Аср-1. Зазначені ознаки складають сутність корисної моделі. Причинно-наслідковий зв'язок істотних ознак корисної моделі з результатом, що досягається, полягає у наступному. Пошук генетичних маркерів дерев ялиці білої, що продукують насіння з підвищеною гетерозиготністю, здійснювали використовуючи 10 ізоферментних локусів, що кодують синтез ізоферментів 4 ген-ферментних систем (глутаматоксалоацетаттрансамінази (локуси Got-1, Got-2, Got-3), алкогольдегідрогенази (Adh-1, Adh2), естерази (Est-1, Est-2, Est-4), кислої фосфатази (Acp-1, Acp-3)). Генотипи материнських дерев визначали шляхом електрофоретичного розділення ізоферментів тканин гаплоїдних мегагаметофітів (ендоспермів) насіння, генотипи потомства диплоїдних тканин зародків насіння. Для встановлення генотипу кожного дерева аналізували 5 випадково обраних насінин із різних шишок. Електрофорез ізоферментів ендоспермів та зародків насіння проводили одночасно на сусідніх доріжках у поліакріламідному гелі. Отримані ізоферментні спектри використовували у визначенні генотипів дерев та їх потомства. Технічна задача корисної моделі - на основі порівняльного аналізу кількості гетерозиготних дерев і зародків їх насіння встановити ізоферментні локуси материнських рослин ялиці білої, за якими кількість гетерозиготного потомства найбільша. Технічний результат способу генетичного маркування дерев полягає в тому, що при створенні лісонасіннєвих плантацій ялиці білої використання насіння з дерев, що продукують велику кількість гетерозиготних зародків насіння за локусами Got-3, Adh-1 і Acp-1 дозволить мінімізувати частку гомозиготних проростків. Нижче наводиться описання способу генетичного маркування дерев ялиці білої з великою кількістю гетерозиготного насіння у природній популяції, і приклад його конкретної реалізації. Приклад 1. Вивчали 146 дерев ялиці білої з 4 природних популяцій в Українських Карпатах (Самбірська,Бредулецька, Говерлянська, Делятинська). Загальна вибірка зародків насіння з цих дерев склала 725. На основі аналізу електрофоретичних спектрів встановлено 51 генотип материнських дерев та зародків насіння 10 ізоферментних локусів (Табл.1). 5 16545 6 Таблиця 1 Кількість гомо- та гетерозиготних материнських рослин та кількість гетерозиготних зародків насіння, що вони продукують, частка гетерозиготного насіння у популяції ялиці білої за даними ізоферментних локусів Локус Got-1 Got-2 Got-3 Adh-1 Adh-2 Est-1 Est-2 Est-4 Acp-1 Acp-3 Генотипи материнських рослин ВВ AB ВС ВВ BE ВС ВВ AB ВС BH СН АА ВВ AB АА АА AB ВВ AD DD AG DB ВВ CC AC ВС AB CF ВВ FF АА BB AA ВС СС BE AB ЕЕ AC BD BB BE AB AA BB AA CC AB ВС AK AC Кількість генотипів материнськіх рослин, шт. що має гетерозиготні загальна зародки насіння 143 7 2 2 1 1 135 1 10 8 1 0 105 38 33 28 5 5 1 1 1 1 1 1 95 29 46 46 5 4 60 37 51 45 12 11 15 15 3 3 2 2 3 3 146 2 82 32 45 39 8 8 1 1 3 3 5 2 1 1 1 1 77 30 5 2 5 4 3 0 12 11 41 37 1 1 1 1 1 1 115 28 11 11 17 17 3 1 43 26 13 12 8 5 40 36 26 24 1 1 15 14 Примітка. Латинськими літерами умовно позначені гени. Гомозиготні рослини позначені однаковими літерами, гетерозиготні - різними. Встановлено, за всіма досліджуваними локусами, крім Acp-3, більшість генотипів материнських дерев гомозиготні, і частка гетерозиготного насіння, що вони продукують, Загальна кількість гетерозиготних зародків насіння, шт. Частка гетерозиготного насіння, % 10 8 2 2 20 0 70 57 15 3 5 5 50 127 11 71 100 30 41 8 7 9 2 72 89 25 2 9 4 4 1 45 2 6 0 18 68 3 2 2 49 24 41 3 52 27 4 76 45 3 39 28,57 80 40 40 50 36,84 40,71 60 60 100 100 34,48 55,22 27,50 38,88 44,44 54,55 54,67 53,33 70 60 20 45 45,64 62,50 40 60 40 80 20 30 20 30 0 32,73 36,76 60 40 40 35 43,64 48,24 60 40 45 16 42,22 37,5 60 55,71 нижча, ніж у менших за кількістю вибірках дерев, гетерозиготних за цими локусами (див. Табл.1). За виключенням локусів Got-1, Got-2 і Est-1, за всіма іншими ізоферментними локусами материнські дерева продукували велику кількість гетерозиготного насіння (Табл.2). Показник, що виражає співвідношення кількості гетерозиготних 7 16545 зародків насіння до кількості гетерозиготних материнських дерев, за локусом Got-1 також був великий, але з загальної кількості досліджуваних дерев 146 лише гетерозиготними були лише 3 (див. Табл.2). За локусом Est-4 кількість сформованого гетерозиготного насіння більша, ніж за локусами 8 Got-1, Got-2 і Est-1, але в цілому показник, що виражає співвідношення кількості гетерозиготних зародків насіння до кількості гетерозиготних материнських дерев, за локусом Est-4 невеликий порівняно з іншими (див. Табл.2). Таблиця 2 Кількість гетерозиготних зародків насіння та їх співвідношення з гетерозиготними материнськими рослинами у популяції сосни крейдяної за даними ізоферментних локусів Кількість материнських рослин, шт. альтернативних гетерозиготних гомозиготних Got-1 3 0 Got-2 11 0 Got-3 40 1 Adh46 5 1 Adh71 12/3 2 Est-1 0 0 Est-2 57 5/1/1 Est-4 60 3/1/5 Acp-1 28 3 Acp-3 82 8/13 Локус Кількість гетерозиготних зародків насіння, шт. 20 22 155 Співвідношення кількості гетерозиготних зародків насіння до гетерозиготних материнських рослин 6,67 2 3,88 188 4,09 266 3,75 2 206 146 117 246 0 3,61 2,43 4,18 3,0 Примітка. Через дріб наведена кількість альтернативних гомозиготних материнських рослин. Найбільшу кількість гетерозиготних материнських дерев та гетерозиготних зародків насіння, що вони продукують, встановлено за локусами Adh-2, Acp-3, а також Est-2 (див. Табл.2). Однак за цими локусами, окрім переважної кількості найбільш розповсюджених гомозиготних генотипів, також у достатній кількості зустрічаються альтернативні, що змогло обумовити наявність великої кількості гетерозиготного насіння у досліджуваних популяціях (за рахунок перехресного запилення альтернативних гомозигот). Тому гетерозиготне насіння ялиці білої за цими локусами могло утворитися не неопосередковано від гетерозиготних материнських дерев, і локуси Adh-2, Аср-3 і Est-2 недоцільно розглядати як маркерні для дерев, що утворюють велику кількість гетерозиготного насіння досліджуваного виду. За ізоферментними локусами Got-3, Adh-1 і Аср-1 гетерозиготні дерева ялиці білої продукують Комп’ютерна верстка О. Чепелев велику кількість гетерозиготного насіння, і показник, що виражає співвідношення кількості гетерозиготних зародків насіння до кількості гетерозиготних материнських дерев, великий. До того ж альтернативні гомозиготні за цими локусами дерева у досліджуваних популяціях ялиці білої зустрічаються у незначній кількості (дів. Табл.2). Таким чином, спосіб дозволяє використовувати ізоферментні локуси Got-3, Adh-1 і Аср-1 в якості генетичних маркерів для відбору гетерозиготних за цими локусами дерев у популяціях ялиці білої. Ці дерева, що продукують велику кількість гетерозиготного насіння, необхідно використовувати при створенні лісонасіннєвих плантацій ялиці білої. Джерела інформації, які використані при складанні заявки 1. А. с. 1517859 СССР МКИ А 01 H 1/4. Способ идентификации родительских и гибридных форм кукурузы / Крестников И.С., Ступа Л.Я. - 1989. 2. А. с. 1281216 СССР МКИ А 01 H 1/4, А 01 G 23/00. Способ отбора сеянцевхвойных растений / Духарев В.А., Животовский Л.А. - 1987 (прототип). Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601