Спосіб визначення гетерозиготного носійства метахроматичної лейкодистрофії

Спосіб визначення гетерозиготного носійства метахроматичної лейкодистрофм, який включає визначення активності арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів шляхом інкубації зразків лейкоцитів при температурі 37°С протягом 1 години, який відрізняється тим, що додатково здійснюють інкубацію зразків лейкоцитів при температурі 0-4°С протягом 16-20 годин і отримані результати порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А Винахід відноситься до медицини, а зокрема діагностики спадкової патологи, і може використовуватись при медико-генетичному консультуванні сімей, обтяжених по метахроматичній лейкодистрофм - спадковій хворобі, що обумовлена мутацією в гені арилсульфатази А і, як наслідок, зниженням активності цього ферменту Відомий спосіб визначення гетерозиготного носійства метахроматичної лейкодистрофм за допомогою молекулярно-генетичних технологій (1) Для цього виділяють ДНК, напрацьовують фрагменти гену арилсульфатази А за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та аналізують наявність мутацій в цих фрагментах Використання молекулярно-генетичних методів ускладнене в зв'язку з великою КІЛЬКІСТЮ описаних мутацій в гені арилсульфатази А, а також ймовірності нової, досі неописаної мутації в цьому гені Особливо це актуально при необхідності визначення гетерозиготного носійства при проспективному консультуванні подружніх пар з випадками непідтвердженого біохімічно діагнозу метахроматичної лейкодистрофм в родоводі, при родинному шлюбі та ш , тобто при відсутності хворої дитини Відомий спосіб визначення гетерозиготного носійства метахроматичної лейкодистрофм шляхом демонстрації 50%-го зниження активності арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів при визначенні останньої за стандартним методом Baum et al (2) Для цього з 3 - 5мл венозної гепаринізованої крові виділяють лейкоцити за стандартною методикою (3) До 0,2мл гомогенату лейко цитів додають 0,2мл субстратної суміші такого складу ЮмМ п-нітрокатехолсульфат у ацетатному буфері рН 5,0, що містить 10% хлорида натрію та 0,5мМ пірофосфата натрію Зразки шкубують при 37°С на протязі 1 години Реакцію зупиняють додаванням 2,5н гідроксиду натрію КІЛЬКІСТЬ звільненого субстрату оцінюють визначенням оптичної ЩІЛЬНОСТІ зразків при 515нм Калібрування проводять з використанням стандартних розчинів п-нітрокатехолу Результати висловлюють у нмоль/год/мг білку КІЛЬКІСТЬ білку в гомогенаті лейкоцитів визначають за стандартним методом Крістіана та Варбурга (4) Отримані показники порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А, що визначається дослідним шляхом При визначенні активності арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів за стандартним методом Baum et al спостерігається значне перекривання областей нормальних значень активності АСА та значень, що визначаються у гетерозиготних носив На Фіг 1 представлена діаграма розподілу нормальних значень активності арилсульфатази А (обстежено 48 здорових донорів) та значень, що визначаються у гетерозиготних носив (обстежено 26 облігатних гетерозигот) Наявність зони перекривання цих двох областей значно ускладнює інтерпретацію показників, що потрапляють в цю зону Задачею заявляемого винаходу є підвищення достовірності визначення гетерозиготних носійств метахроматичної лейкодистрофм біохімічним методом Поставлена задача вирішується тим, що, до 00 (О ю 51468 датково здійснюють інкубацію зразків лейкоцитів (облігатних гетерозигот) отримані наступні резульпри 0 - 4°С на протязі 16-20 годин і отримані покатати зники порівнюють з областю нормальних значень Інкубація зразків при 37°С активності арилсульфатази А, отриманих в цих же Мати - 40нмоль/год/мг білку умовах Батько - 27нмоль/год/мг білку На фіг 1 наданий розподіл нормальних знаПацієнтка Г - 65нмоль/год/мг білку чень активності арилсульфатази А (п=48) та знаІнкубація зразків при 0 - 4°С чень, що визначаються у гетерозиготних носив Мати - 162нмоль/18год/мг білку (п=26) при інкубації зразків при 37°С Батько - 107нмоль/18год/мг білку На Фіг 2 розподіл нормальних значень активПацієнтка Г - 136нмоль/18год/мг білку ності арилсульфатази А (п=19) та значень, що При порівнянні результатів з областю нормавизначаються у гетерозиготних носив (п=20) при льних значень видно, що активність арилсульфаінкубації зразків при 0-4°С тази А пацієнтки Г при інкубації зразків при 37°С знаходиться в зоні перекривання, в той час, як Спосіб здійснюється наступним чином активність ферменту, визначена після інкубації Лейкоцити отримують з гепаринізованої кровіпри 0-4°С говорить про гетерозиготне носійство за стандартною методикою згідно прототипу В хвороби пацієнткою Г Це заключения було підякості субстрату використовують ЮмМ птверджено молекулярно-генетичними методами нітрокатехолсульфат у ацетатному буфері рН 5,0, що містить 10% хлорида натрію та 0,5мМ пірофоТаким чином, впровадження способу визнасфата натрію Реакційну суміш готують, змішуючи чення гетерозиготного носіиства метахроматичної 0,2мл гомогенату лейкоцитів та 0,2мл субстрату лейкодистрофп у близько ЗО випадках на базі каІнкубацію зразків проводять при 37°С на протязі 1 федри медичної генетики, клінічної імунологи та години та при 0 - 4°С на протязі 16-20 годин Після алергології КМАПО їм П Л Шупиката лабораторії інкубації реакцію зупиняють додаванням 0,1 мл медичної генетики УДСЛ "ОХМАТДИТ" дозволило 2,5н NaOH КІЛЬКІСТЬ звільненого субстрату визробити слідуючи висновки значають шляхом вимірювання оптичної ЩІЛЬНОСТІ 1 завдяки заявляемому способу значно підрозчину при 515нм Результати висловлюють у вищено достовірність ідентифікації гетерозиготнонмоль/год/мг білку для зразків, що шкубували при го носіиства метахроматичної лейкодистрофп, 37°С, та у нмоль/18год/мг білку для зразків, що 2 впровадження способу визначення гетерошкубували при 0 - 4°С КІЛЬКІСТЬ білку в гомогенаті зиготного носіиства метахроматичної лейкодистлейкоцитів визначають за стандартним методом рофп дозволить значно покращити медикоКрістіана та Варбурга Отримані показники порівгенетичне консультування сімей, обтяжених по цій нюють з областю нормальних значень активності патологи, проспективне консультування подружніх арилсульфатази А На Фіг 2 представлена діаграпар з випадками непідтвердженого біохімічне діагма розподілу нормальних значень активності аринозу метахроматичної лейкодистрофп в родоводі, лсульфатази А (обстежено 19 здорових донорів) при родинному шлюбі та ш та значень, що визначаються у гетерозиготних Література носив (обстежено 20 облігатних гетерозигот), 1 Coulter-Mackie MB, Applegarth DA, Toone J, отримані заявляємим способом 3 діаграми видно, Vallance H, DNA-based diagnosis of arylsulfatase A що області нормальних значень та значень, що deficiencies as a supplement to enzyme assay a визначаються у гетерозиготних носив не перекриcase in point, Clm Biochem 1997, vol 30, 1 57-61 ваються Це дозволяє з великою достовірністю 2 Baum H, Dodgson KS, Spenser B, The assay ідентифікувати гетерозиготних носив метахромаof arylsulfatases A and В in human urine Clm Chim тичної лейкодистрофп Acta, 1959, 4 453-455 Приклад 3 Цветкова И В , Бахарев В А , Кази 3 , Осипова Г Н , Розенфельд Е Л , Розовский И С «ВыяПацієнтка Г, 12 років КЛІНІЧНО здорова Має вление недостаточности арилсульфатазы А при рідну молодшу сестру, хвору на метахроматичну метахро мати чес кой лейкодистрофии и пренатальлейкодистрофію (діагноз встановлений 2 роки тоний диагноз заболевания» Вопр мед химии, му в ІНШІЙ країні) Батьки звернулись з приводу 1980, вып 4, стр 464-464 встановлення гетерозиготного носіиства метахроматичної лейкодистрофп у пацієнтки Хвора сест4 Досон Р , Эллиот Д , Эллиот У , Джонс К , ра на консультації відсутня При визначенні активСправочник биохимика, Москва, Мир, 1991,543с ності арилсульфатази А у пацієнтки та у батьків 51468 іція зразкії ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71