Спосіб проведення мікрохірургічних операцій з яйцеклітинами та ембріонами

СОЮЗ (.UlitTCMX СОЦИАЛИСТИЧРСКИХ РЕСПУБЛИК 727822 A1 (5D5 А 61 D 19/04, С 12 N5/00. С 12 Q 1/24 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 (21)4832540/15 (22)12.04.90 (46)23.04.92. Бюл. N* 15 (71) Научно-исследовательский институт животноводства Лесостепи и Полесья УССР (72) Ф.И.Осташко, Н.Д Безуглый и Н.А.Гордиенко (53) 636.081/082-576:32(088.8) (56) Willadsen S.M. Mlcromanlpulatlon of embryo of the large domestic species mammalian egg transfer/ Ed. C.Adams, 1982, p. 186-208. (54) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ МИКРОХИРУРГИЧЕСКИХ ОПЕРАЦИЙ С ЯЙЦЕКЛЕТКАМИ И ЭМБРИОНАМИ Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микрохирургии биологических объектов, имеющих внеклеточную оболочку, и может быть использовано в трансплантации эмбрионов млекопитающих. Целью изобретения является повышение сохранности биологического объекта и повышение технологичности операции. Поставленная цель достигается тем, что биологический объект извлекают из внеклеточной оболочки в гипертоническом растворе непроникающих через мембрану клетки веществ концентрации 1,2-1,5 М в среде, обеспечивающей жизнеспособность. Через оболочку вводят капилляр, втягивают в него клеточную массу биологического объекта и извлекают ее из оболочки, проводят микрохирургические операции с клеточной массой в растворе, обеспечивающем жизнеспособность, затем при необхо (57) Использование, биотехнологии, трансплантация эмбрионов млекопитающих. Сущность изобретения' эмбрионы крупного рогатого скота нэ стадии морулы получают на 7-й день после осеменения Помещают их в 1,5 М раствор сахарозы в фосфат но-солевом буфере Дюльбекко. Заточенной микропипеткой делают прокол оболочки и извлекают содержимое клетки Зародыш без оболочки переносят в изотоничесгий раствор Производят разделение зародыша на две половинки. Две части эмЬрионэ переносят в 1,5 М раствор сахарозы Каждую из частей зародыша помещают во внеклеточную оболочку и переносят о физиологический раствор.2 и і , 1 табл димости помещают сновя ее в одну или несколько внеклеточных оболочек в гипертоническом растворе и переносят в изотонический физиологический раствор. Способ проведения микрохирургических операций основан на том, что внеклеточная оболочка биологическою объекта, в частности прозрачная обопсчка (зона пеллюцида) яйцеклеток и эмбрионов, не обладает избирательной проницаемостью, в то время как цитоплэзмати(*еские мембраны клеток, в частности яйцеклеток и блзстомеров эмбрионов, обладают избирательной проницаемостью. Это приводит к тому что при помещении в гипертонические растпоры непроницаемых через цитоплззматшеские мембраны качеств например хлористого натрия, сахарози осмомо^ярностью 1 2-1,5 М, обьем клеточной массы биологического объекта уменьшается в 2 Ъ- 2Я 00 Ю Ю 1727822 раза, а размеры внеклеточной оболочки не изменяются. На фиг.1 на примере 2-клеточного эмбриона отображены объемы внутриклеточной массы зародыша, находящегося в изотоническом растворе, на фиг 2 - то же, в гипертоническом рэстзоре осмомопчрностыо 1.2-1 5 М. Выбор концентрации 1,2-1,5 М обусловлен тем, что при более низкой концентрации уменьшение объема клеточной массы незначительно и извлечь ее из внеклеточной оболочки трудно, а более высокая концентрация непроникающих веществ повреждает клетки (см. таблицу.) Сущность способа заключается в следующем. Биологический объект, имеющий внеклеточную оболочку, находящийся в физиологическом растворе, переносят в гипертонический раствор непроникающих веществ осмомолярностью 1,2-1,5 М Выдерживают в растворе в течение 1 мин, а затем фиксируют положение микросоской. Микроиглой или микроножом делают прокол или разрез внеклеточной оболочки, вводят микропипетку и вынимают целый или часть биологического объекта из собственной оболочки. Переносят его в изотонический раствор, где объект принимает прежние форму и размеры. Проводят необходимые операции и снова переносят целый или часть объекта в гипертонический раствор, где они уменьшаются в объеме. При необходимости помещают часть или целый биологический объект в пустую внеклеточную оболочку. П р и м е р . Эмбрионы крупного рогатого скота иа стадии морулы получают на 7-й день после осеменения. Пригодные к работе эмбрионы помещают в 1,5 М раствор сахэрозы в фосфор и о-солевом буфере Дюльбекко. В таком растворе объем внутриклеточной массы зародыша уменьшается в 2,8 раза, а размеры внеклеточной оболочки не изменяются, при этом пространство между оболочкой и цитоплззматической мембраной увеличиаается. Микрохирургическую операцию проводят под микроскопом "Биолам Р-2" с помощью двух 5 10 15 20 25 30 35 позиционеров микроманипулятора, эмбрионы удерживают микроприсоской. Заточенной микропипеткой с диаметром, сравнимым с размерами внутриклеточной массы, находящейся в гипертоническом растворе, делают прокол оболочки и извлекают содержимое клетки. При этом разрыв внеклеточной оболочки незначителен, а собственно эмбрион извлекают из нее без повреждений. Зародыш без оболочки переносят в изотонический раствор, где эмбрион восстанавливает свой первоначальный объем, и производят разделение зародыша стеклянной иглой иа две половинки Затем две части эмбриона переносят в 1,5 М раствор сахарозы снова, где размеры половинок уменьшаются Одну из частей зародыша помещают через отверстие во внеклеточную оболочку, из которой эмбрион был извлечен, а вторую часть зародыша - в другую ободочку, из которой предварительно извлечено содержимое. После проведения микрохирургической операции половинки эмбрионов, находящиеся во внеклеточной оболочке, переносят в физиологический раствор. Результаты эксперимента показывают, что использование гипертонического раствора при удалении внеклеточной оболочки позволяет манипулировать с эмбрионами без риска их повреждения и, следовательно, повысить процент жизнеспособных половипок после разделения зародышей. Формула изобретения Способ проведения микрохирургических операций с яйцеклетками и эмбрионами, включающий извлечение их из БНеКЛетОЧНОЙ обоЛОЧКИ С ПОСЛеДУЮЩИМ 803" 40 вращением в пустую оболочку, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения сохранности биологического объекта и повышения технологичности операции, извлечение я й ц е к л е т о к и э м б р и о н о в из 45 знеклеточной оболочки и возвращение их в пустую оболочку осуществляют в гипертоническом растворе непроникающих веществ осмомолярностью 1,2-1,5 М в среде, оЬеспечивающей жизнеспособность объек50 тов. 1727822 Осмомолярность гипертонического раствора, М 0,3 0,6 0.9 Кратность уменьшения объема клеточной массы 1,2 1.5 2,5 2,8 3,1 2,0 2,5 3,0 1.0 1,7 2.1 3,4 3,6 Жизнеспособность биологических обьектоа (% развивающихся эмбрионов в культуре) Контроль** Опыт* 84 89 85 86 87 86 90 88 86 90 87 74 84 46 87 26 * биологические обьекты помещают в гипертонический раствор, выдерживают в течение 1 ч, возвращают в физиологические условия и культивируют вне организма. ** Биологические обьекты культивируют вне организма в изотоническом растворе. Фиг. 2. Редактор И.Шмакова Составитель М.Усцелемов Техред М.Моргентал Корректор О Кравцова Заказ 1357 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб , 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101