Спосіб визначення популяцій та субпопуляцій лімфоцитів

Спосіб визначення популяцій та субпопуляцій лімфоцитів, що включає забір крові, виділення лімфоцитів, який відрізняється тим, що 8-10 мкл суспезії виділених лімфоцитів після трикратного 3 антитіл [2. Иммуноцитохимия и моноклональные антитела в онкогематологии / В.Г. Пинчук, Д.Ф. Глузман, В.А. Надгорная и др. - Киев: Наук. думка, 1990. - 232с.], який включає забір крові із периферичної крові (вени) у кількості 5-10мл, розведення крові розчином 0,15М NaCI 5мл розчину Хенкса, виділення лімфоцитів у градієнті щільності фіколу - верографіну, трикратне відмивання в живильному середовищі, визначення життєздатності виділених лімфоцитів шляхом фарбування суспензії лімфоцитів розчином трипанового синього, виготовленого ex tempore, розведення суспензії лімфоцитів розчином Хенкса до концентрації 46млн/мл, підготовку предметного скла для нанесення лімфоцитів, що включає обробку L-лізином, покриття парафільмом, перфорацію парафільма дироколом, нанесення у перфоровані отвори парафільму на предметному склі краплини осаду лімфоцитів, інкубацію у вологій камері 20хв, відбір надлишку вологи фільтрувальним папером, нанесення на суспензію лімфоцитів 20мкл моноклональних антитіл, коньюгованих з ФІТЦ, інкубацію 20хв при 18-24°С, відмивання надлишку антитіл у 0,15М NaCl розчині, підсушування 20хв при 1824°С, нанесення на поверхню комплексу лімфоцити+моноклональних антитіла, коньюговані з ФІТЦ, підсушування на повітрі 20хв при 18-24° нанесення на препарат забуференого гліцерину, покриття препарату покровним скельцем, підрахунок популяцій і субпопуляцій лімфоцитів у люмінісцентному мікроскопі у день визначення чи на протязі 4 місяців з моменту виготовлення препарату при зберіганні у фользі при температурі 4°С. Недоліком відомого способу є мала ефективність та обмеженість досліджень для перегляду під мікроскопом (4-5 за робочий день), неможливість тривалого зберігання препаратів (лише 4 місяці), необхідність спеціалізованих методів збереження, велика кількість дорогих реактивів, значна витрата часу на підготовку препаратів до перегляду. В основу способу, що заявляється поставлена задача створення ефективного більш простого, швидкого та дешевого способу визначення популяцій та субпопуляцій лімфоцитів з можливістю їх відстроченого аналізу шляхом забору із периферичної крові (вени, пальця) у кількості 0,5-1,0мл, розведення розчином 0,15М NaCl у співвідношенні 1:3, виділення лімфоцитів у градієнті щільності фіколу-верографіну, трикратного відмивання в живильному середовищі, доведення осаду лімфоцитів розчином 0,15М NaCl до 1,0мл, нанесення 810мкл суспезії лімфоцитів на попередньо обезжирене скло, підсушування на протязі 20 хвилин при 18-20°С, фіксації у розчині охолодженого ацетону при 4°С напротязі 10хв, зберігання до необхідності безпосереднього визначення в терміні до 5 років у обгортці з фольги при температурі 4°С, нанесення 10мкл моноклональних антитіл, коньюгованих з ФІТЦ, інкубацію 20хв у вологій камері при 35-37°С, відмивання надлишку антитіл у розчині 0,15М NaCI, підсушування 20хв при 18-24°С, проведення аналізу вмісту популяцій та субпопуляцій лімфоцитів з допомогою люмінісцентному мікроскопу, цитометру чи іншої техніки. 17261 4 Сутність способу, що заявляється полягає у тому, що визначення популяцій та субпопуляцій лімфоцитів проводиться мікрометодом, 10мкл суспезії виділених лімфоцитів після 3-й кратного відмивання наносять на попередньо обезжирене скло, витримують на протязі 20 хвилин у вологій камері при 18-20°С, висушують при 18-24°С, фіксують 10хв у розчині охолодженого ацетону (4°С), фіксації у розчині охолодженого ацетону при 4°С напротязі 10хв, зберігають до необхідності безпосереднього визначення в терміні до 5 років у обгортці з фольги при температурі 4°С, при визначенні наносять 8-10мкл моноклональних антитіл, коньюгованих з ФІТЦ, інкубують 20хв у вологій камері при 35-37°С, відмивають надлишок антитіл у розчині 0,15М NaCl, підсушують 20хв при 18-24°С та проводять аналізу вмісту популяцій та субпопуляцій лімфоцитів з допомогою люмінісцентному мікроскопу, цитометру чи іншої техніки. Новим у способі, який заявляється є те, що після виділення 3-й кратного відмивання лімфоцитів, 10мкл суспезії виділених лімфоцити наносять на попередньо обезжирене скло, витримують на протязі 20 хвилин у вологій камері (18-20°С), фіксують 10хв. у розчині охолодженого ацетону (4°С), підсушування витримують до висихання, і наносять моноклональні антитіла, коньюговані з (FITS), витримують 20хв (18-24°С), надлишок антитіл відмивають у фізіологічному розчині, підсушують 20хв. (18-24°С), та проводять аналіз вмісту популяцій та субпопуляцій лімфоцитів з допомогою флюоресцентного мікроскопу, цитометра чи іншої техніки зразу ж чи в терміні до 5 років, при зберіганні у обгортці з фольги при температурі 4°С. Ефективний спосіб скороченого приготування препратів виділених лімфоцитів, що забезпечує їх якісне збереження при довгостроковому зберіганні дібрані шляхом довготривалих експериментальних досліджень (табл.1.). Реалізується спосіб наступним чином: кров забирають із периферичної вени у кількості 0,51мл і розводять розчином 0,15М NaCl 1:3; виділення лімфоцитів проводять шляхом 20хв. центрифугуванням у градієнті щільності Фіколу верографіну (щільність 1,077г/мл). Виділені лімфоцити тричі відмифають у розчині 0,15М NaCl. Надосад зливають. Об’єм осаду доводять до 1мл 0,15М NaCl і ресусперзують лімфоцити. Краплину (10мкл) суспезії виділених лімфоцитів наносять на попередньо обезжирене скло, витримують на протязі 20 хвилин у вологій камері (18-20°С), фіксують 10хв у розчині охолодженого ацетону (4°С), і витримують до висихання, наносяться 10мкл моноклональних антитіл, коньюгованих з (FITS), витримують 20хв. (18-24°С), надлишок антитіл відмивають у фізіологічному розчині, підсушують 20хв (18-24°С), та проводять аналіз вмісту популяцій та субпопуляцій лімфоцитів з допомогою флюоресцентного мікроскопу, цитометру чи іншої техніки зразу ж чи при зберіганні препаратів в терміні до 5 років, у обгортці з фольги при температурі 4°С. Приклад 1 Кров із периферичної крові (вени) забирають у кількості 5-10мл, розведення крові розчином 0,15М 5 NaCl у 5мл розчину Хенкса, виділяли лімфоцити у градієнті щільності фіколу - верографіну, трикратно відмивали у живильному середовищі, визначали життєздатність виділених лімфоцитів шляхом фарбування суспензії лімфоцитів розчином трипанового синього, виготовленого ex tempore, розводили суспензію лімфоцитів розчином Хенкса до концентрації 4-6млн/мл, підготовлювали предметне скельце для нанесення лімфоцитів, що включає обробку L-лізином, покриття парафільмом, перфорацію парафільма дироколом, наносили у перфоровані отвори парафільму на предметному скельці краплини осаду лімфоцитів, інкубували у вологій камері 20хв, відбирали надлишк вологи фільтувальним папером, наносили на суспензію лімфоцитів 20мкл моноклональних антитіла, коньюгованих з (ФІТЦ), інкубували 20хв при 18-24°С, відмивали надлишок антитіл у 0,15М NaCl розчині, підсушували 20хв при 18-24°С, наносили на поверхню комплексу лімфоцити+моноклональних антитіла, коньюговані з (ФІТЦ), підсушували на повітрі 20хв при 18-24° наносили на препрат забуферений гліцерин, покривали препарат покровним скельцем, підраховували популяції і субпопуляції лімфоцитів у люмінісцентному мікроскопі. На виконання способу витратили 6 годин. Приклад 2 Кров із периферичної крові (вени) забирають у кількості 5-10мл, розведення крові розчином 0,15М NaCl у 5мл розчину Хенкса, виділяли лімфоцити у градієнті щільності фіколу - верографіну, трикратно відмивали у живильному середовищі, визначали життєздатність виділених лімфоцитів шляхом фарбування суспензії лімфоцитів розчином трипанового синього, виготовленого ex tempore, розводили суспензію лімфоцитів розчином Хенкса до концентрації 4-6млн/мл, підготовлювали предметне скельце для нанесення лімфоцитів, що включає обробку L-лізином, покриття парафільмом, перфорацію парафільма дироколом, наносили у перфоровані отвори парафільму на предметному скельці краплини осаду лімфоцитів, інкубували у вологій камері 20хв, відбирали надлишк вологи фільтувальним папером, наносили на суспензію лімфоцитів 20мкл моноклональних антитіла, коньюгованих з ФІТЦ, інкубували 20хв при 18-24°С, відмивали надлишок антитіл у 0,15М NaCI розчині, підсушу 17261 6 вали 20хв при 18-24°С, наносили на поверхню комплексу лімфоцити+моноклональних антитіла, коньюговані з (ФІТЦ), підсушували на повітрі 20хв. при 18-24°. Препарат залишали для перегляду через 4 місяці. Загорнутим у фольгу при температурі 24°С. Для перегляду наносили на препрат забуферений гліцерин, покривали препарат покровним скельцем, підраховували популяції і субпопуляції лімфоцитів у люмінісцентному мікроскопі. Якість визначепння лімфоцитів у препарті була недостатньою. Відносна кількість цілих, які можна було враховувати знизилась до 40-50%, змінюючи висновки та сутєво впливаючи на поставновку імунологічного діагнозу і лікування хворого. Приклад 3 Кров забирали із периферичної вени у кількості 0,5-1мл і розводили розчином 0,15М NaCl 1:3; виділяли лімфоцити у градієнті щільності фікол верографіну. Виділені лімфоцити тричі відмивали у розчині 0,15М NaCl. Надосад зливали. Об’єм осаду доводилиь до 1мл 0,15М NaCl і ресусперували лімфоцити. 8-10мкл суспезії виділених лімфоцитів наносили на попередньо обезжирене скло, витримують на протязі 20 хвилин у вологій камері при 18-20°С, фіксують 10хв у розчині охолодженого ацетону при 4°С, витримують до висихання, наносяться 10мкл моноклональних антитіл, коньюгованих з ФІТЦ, витримують 20хв при 1824°С, надлишок антитіл відмивають у фізіологічному розчині, підсушують 20хв при 18-24°С, та проводять аналіз вмісту популяцій та субпопуляцій лімфоцитів з допомогою флюоресцентного мікроскопу, цитометру чи іншої техніки зразу ж чи в терміні до 5 років, при зберіганні препаратів у обгортці з фольги при температурі 4°С. При визначенні вмісту популяцій і субпопуляцій лімфоцитів, різниця їх вмісту майже не відрізнялась як на момент визначення, так і через 5 років після виготовлення препаратів. Час для виготовлення препратів становив 2 години 30 хвилин. Об’єм крові для визначення становив 0,5-1,0мл, тобто 10 частину від необхідної кількості прототипу. Таким чином використання способу дає можливість ефективно, швидко, недорого визначати популяуції та субпопуляції лімфоциті в у невеликих об’ємах біоматеріалів, як в день забору матеріалу, так і на протязі 5 років збереження. Таблиця 1 Відносна кількість клітин, що реєструються з допомогою імунофлюоресцентного методу „Способу визначення популяцій та субпопуляцій лімфоцитів” при довгостроковому зберіганні препаратів Термін зберігання (дні, місяці) 1 7 14 21 1 місяць 2 місяці Аналог: Способу, що заявляється Популяції, субпопуляції лімфоцитів % n=1257 CD3+ CD4+ CD8+ 2 3 4 100 100 100 100 100 100 99±2 98±3 99=1:5 98±1 92±4 91±4 95±2 89±3 90±4 Спосіб, що заявляється Популяції, субпопуляції лімфоцитів % n=1374 CD3+ CD4+ CD8+ 5 6 7 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 7 17261 8 Продовження таблиці 1 1 4 місяці 6 місяців 1 рік 2роки 3 роки 4 роки 5 років 6 років 2 7U5 50±6 2± 0 0 0 0 0 3 80±7 35±7 1± 0 0 0 0 0 Література: 1. Регистрационное удостоверение №29/24030301/1104-01 от 24 сентября 2001г. Медицинское изделие «Набор моноклональных и поликлональных антител для определения Тлимфоцитов, В-лимфоцитов, Т-хелперов, Ткиллеров/супрессоров и NK-лимфоцитов человека Комп’ютерна верстка А. Рябко 4 75±3 49±5 0 0 0 0 0 0 5 100 100 100 100 100 100 98± 96± 6 100 100 100 100 100 100 99± 98± 7 100 100 100 100 100 100 100 99± методом иммунофлуоресценции («Статус»)». ООО «Сорбент». 2. Иммуноцитохимия и моноклональные антитела в онкогематологии / В.Г. Пинчук, Д.Ф. Глузман, В.А. Надгорная и др. - Киев: Наук. думка, 1990. - 232с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601