Спосіб прискореної серодіагностики туберкульозу у великої рогатої худоби

Спосіб прискореної серодіагностики туберкульозу великої рогатої худоби, що полягає у визначенні рівня специфічних антитіл у сироватці крові великої рогатої худоби в реакції пасивного гемолізу модифікованій (РПГМ), який відрізняється тим, що в реакції використовуються неінактивовані та нерозведені сироватки крові, облік результатів реакції проводиться фотометричним методом за різницею між показниками оптичної густини дослідної і контрольної проб, тривалість постановки реакції становить 5,5 - 6 годин. (19) (21) u200607249 (22) 30.06.2006 (24) 15.11.2006 (46) 15.11.2006, Бюл. № 11, 2006 р. (72) Дяченко Ганна Михайлівна, Кравченко Наталія Олександрівна, Головач Олександр Володимирович, Дмитрук Олена Миколаївна (73) ІНСТИТУТ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОЇ МІКРОБІОЛОГІЇ УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК 3 18970 4 кульозу бичачого виду (ППД-туберкулін для ссаврин визначають за різницею показників екстинкції ців) еритроцитів барана, попередньо стандартизонадосадової рідини у дослідній і контрольній прованої за показником екстинкції до 0,200 умовних бірках. Позитивним результатом вважається ріодиниць. вень титрів протитуберкульозних антитіл у досліУ контрольну пробірку до такої самої кількості джуваній сироватці крові 0,05 умовних одиниць досліджуваної сироватки крові великої рогатої хуекстинкції і вище, що визначено експеримендоби вносять 3см3 0,15% суспензії танізованих, тально. але не сенсибілізованих антигеном еритроцитів Спосіб випробовували з сироватками крові барана, попередньо стандартизованої за показнилабораторних тварин (кролів), заражених ком екстинкції до 0,200 умовних одиниць. Пробірки Mycobacterium bovis та сенсибілізованих атиповиінкубують при температурі 37°С протягом 60 хвими мікобактеріями в експериментальних умовах, лин. Після закінчення інкубації суміш центрифугута великої рогатої худоби з благополучного та неють протягом 10 хвилин при 1500 обертів за хвиблагополучного господарств щодо туберкульозу у лину. порівнянні з класичною реакцією гемолізу. Облік результатів реакції проводять на фотоПриклад 1. Визначення чутливості і специфічелектроколориметрі при довжині хвилі 400нм, фіності запропонованого способу діагностики при льтрі №3, в кюветах з товщиною робочого шару дослідженні сироваток крові тварин, заражених в 5мм. Рівень протитуберкульозних антитіл в умовекспериментальних умовах. Випробування провоних одиницях в досліджуваній сироватці крові твадилось у порівнянні із класичною РГ. Таблиця 1 Титри специфічних антитіл сироватки крові лабораторних тварин Група тварин 1 2 3 Інфіковані мікобактеріями Збудник туберкульозу Атипові (III група по Раньйону) Здорові (контроль) Класичний спосіб (РГ) Запропонований спосіб (РПГМ) Кількість позитивних Кількість позитивних Кількість результатів результатів Титр Титр антитіл тварин антитіл (ум. од) Відносна Відносна Абсолютна Абсолютна (%) (%) 5 1:256 5 100 0,095±0,002 5 100 5 1:1281:256 5 100 0,026±0,004 0 0 5 0 0 0 0 0 0 Як видно з даних, наведених в таблиці 1, на відміну від РГ, результати РПГМ дозволяють диференціювати тварин заражених збудником туберкульозу від сенсибілізованих атиповими мікобактеріями і здорових. Приклад №2. Визначення чутливості запропонованого способу при дослідженні сироваток крові корів з неблагополучного щодо туберкульозу господарства. Таблиця 2. Титри специфічних антитіл у сироватках крові ВРХ з неблагополучного щодо туберкульозу господарства № проби 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Показник екстинкції у дослідній пробірці контрольній пробірці 0,545 0,470 0,515 0,420 0,540 0,400 0,510 0,425 0,530 0,403 0,517 0,405 0,530 0,410 0,525 0,405 0,535 0,410 0,510 0,418 0,570 0,400 0,560 0,420 0,510 0,395 0,570 0,427 0,570 0,430 0,547 0,400 Титр антитіл (в ум. од.) 0,075 0,095 0,140 0,085 0,127 0,112 0,120 0,120 0,125 0,092 0,170 0,140 0,115 0,143 0,140 0,147 5 № проби 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. M±m 18970 6 Продовження таблиці 2. Показник екстинкції у дослідній пробірці контрольній пробірці 0,550 0,413 0,540 0,408 0,560 0,405 0,535 0,403 0,525 0,413 0,543 0,425 0,528 0,410 0,533 0,397 0,550 0,428 0,538±0,004 0,414±0,003 У всіх 25 досліджуваних сироватках крові тварин виявлено у діагностичному титрі протитуберкульозні антитіла проти збудника туберкульозу великої рогатої худоби, що підтверджує 100% чутливість запропонованого способу. Титр антитіл (в ум. од.) 0,137 0,132 0,155 0,132 0,112 0,118 0,118 0,136 0,122 0,124±0,004 Приклад 3. Визначення специфічності запропонованого способу при дослідженні негативних сироваток крові тварин з благополучного щодо туберкульозу господарства Таблиця 3. Титри специфічних антитіл у сироватках крові ВРХ з благополучного щодо туберкульозу господарства (в ум. од. екстинкції) № проби 1 2 3 4 5 6 M±m Показник екстинкції у дослідній пробірці контрольній пробірці 0,345 0,300 0,282 0,240 0,247 0,234 0,345 0,330 0,270 0,267 0,435 0,432 Як видно з таблиці 3, у сироватках крові здорових тварин антитіла виявляються у титрах, значно нижчих за діагностичний. Аналогічні дані, які свідчать про 100% специфічність способу одержані при дослідженні сироваток крові великої рогатої худоби з іншого благополучного господарства. Позитивні туберкулінові проби у тварин цього Титр антитіл в ум. од. екстинкції 0,045 0,042 0,013 0,015 0,003 0,003 0,025±0,008 господарства були викликані атиповими мікобактеріями, що встановлено за результатами бактеріологічного дослідження біологічного матеріалу, відібраного від них. З наведених даних (таблиця 4) видно, що низькі титри специфічних антитіл або їх відсутність у крові тварин в РПГМ підтверджують неспецифічну природу позитивних туберкулінових реакцій. Таблиця 4 Результати порівняльного вивчення ефективності РПГМ та туберкулінової проби Туберкулінова проба № проби інтенсивність алергі- результат дослідженчних реакцій (мм) ня 1 5 позитивний 2 негативний 3 5 позитивний 4 3 позитивний 5 4 позитивний 6 4 позитивний 7 негативний 8 негативний 9 негативний M±m РПГМ титр специфічних анти- результат досліджентіл (ум. од екстинкції) ня 0 негативний 0,002 негативний 0 негативний 0,020 негативний 0,013 негативний 0,020 негативний 0,020 негативний 0,040 негативний 0 негативний 0,012±0,003 7 18970 Таким чином, наведені приклади показують, що запропонований спосіб прискореної серодіагностики туберкульозу великої рогатої худоби за допомогою реакції пасивного гемолізу модифікованої порівняно з класичною реакцією гемолізу володіє вищою чутливістю (100%), пришвидшує в 8 4,5 разів одержання результатів, не потребує використання для дослідження інактивованих і розведених сироваток крові, що не призводить до зниження титру антитіл, характеризується об'єктивним обліком результатів і простою постановки (таблиця 5). Таблиця 5. Назва способу РПГМ Відомий РГ Метод обліку та одиниці обліку кінцевого результату Фотометричний, одиниці екстинкції Візуальний, від „+" до „+++" Розведення та інактивація сироватки крові В день одержання си- Нативна, не інактивороваток крові(5,5год.) вана На наступний день (24- Інактивована, розве26год.) дена від 1:8 до 1:512 Одержання результатів дослідження Заявлений спосіб, як скринінговий метод обстеження поголів'я великої рогатої худоби на туберкульоз, може бути широко використаний в практиці лабораторій ветеринарної медицини для проведення діагностичних досліджень. Джерела інформації: 1. Інструкція про заходи профілактики та оздоровлення тваринництва від туберкульозу. - Київ. 1994. - С.16 2. Настанова по діагностиці туберкульозу тва Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Кількість необхідної сироватки (см3) 0,4 0,7 рин та птиці. - Київ. - 1994. -С.39. 3. Опис до деклараційного патенту на винахід "Тест-система діагностична імуноферментна для визначення протитуберкульозних антитіл в сироватках крові великої рогатої худоби" Семиноженко В.П., Вербицький П.І., Кучерявенко О.О., Горжеєв В.М., Ображей А.Ф., Стегній Б.Т., Завгородній A.І, Тихонов П.М. та ін. UA 68240А 7А61 К39/21 15.07.2004 Бюл. №7, 2004. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601