Спосіб оцінки токсичних ефектів важких металів на клітини крові щурів в дослідах in vitro

1. Спосіб оцінки токсичних ефектів важких металів на клітини крові щурів в дослідах in vitro, що включає внесення препаратів важких металів в проби крові, проведення інкубації з наступною оцінкою функціональної активності клітин крові, який відрізняє ться тим, що в дослідних пробах до 1 мл крові інтактних щурів додають 1 мл розчину ацетату свинцю та відповідно сульфату кадмію в кінцевих концентраціях по катіону металу в межах 1·1011 -1·10-3 моль/л, а в контрольних пробах до 1 мл крові додають 1 мл 0,9 % розчину NaCl, pH - 7,2, при цьому проби інкубують протягом 30 хвилин в термостаті при температурі +37°С з наступним відмиванням середовищем Хенкса під час центрифугування протягом 10 хвилин при 1500 об/хв., в пробах крові оцінюють функціональну активність нейтрофілів та лімфоцитів, зокрема, метаболічну їх активність досліджують з визначенням активності ферментів окислення глюкози, для нейтрофілів визначають бактерицидну активність та здатність їх до фагоцитозу, а для лімфоцитів визначають проліферативну активність. U 2 (19) 1 3 21313 4 та лімфоцитів людини), що не дає уявлення про спосіб оцінки токсичних ефектів важких металів на вплив ксенобіотиків на клітини крові. прикладі свинцю та кадмію полягає у визначенні Поставлена задача вирішується тим, що в допоказників, які характеризують функціональну акслідних пробах до 1мл крові інтактних щурів дотивність імунокомпетентних клітин крові та дають дають 1мл розчину ацетату свинцю та відповідно певне уявлення про імунотоксичні властивості цих сульфату кадмію в кінцевих концентраціях по катіксенобіотиків. Заявлений спосіб здійснюють наступним чиону металу в межах 1×10-11-1·10-3моль/л., а в контрольних пробах до 1мл крові додають 1мл 0,9% ном. Кров у щурів забирають на гепарин (10МЕ/мл) під час декапітації під легким ефірним розчину NaCI, pH 7,2, при цьому проби інкубують наркозом. В дослідних пробах до 1мл крові інтактпротягом 30 хвилин в термостаті при температурі них щурів додають 1мл розчину ацетату свинцю та +37°С з послідуючим відмиванням середовищем сульфату кадмію в кінцевих концентраціях по катіХенкса під час центрифугування протягом 10 хвилин при 1500об/хв., в пробах крові оцінюють функону металу (1·10-11, 1·10-9, 1·10-7, 1·10-6, 1·10-5, 1·10-3 (моль/л)). ціональну активність нейтрофілів та лімфоцитів, У контролі до 1мл крові додають 1мл 0,9% розчину зокрема, метаболічну їх активність досліджують з NaCl, pH 7,2. Контрольні і дослідні проби інкубують визначенням активності ферментів окислення глю30 хвилин в термостаті при температурі +37°С. кози, для нейтрофілів визначають бактерицидну активність та здатність їх до фагоцитозу, а для Після інкубації клітини двічі відмивають середовищем Хенкса без фенолового червоного центрилімфоцитів визначають проліферативну активфугуванням протягом 10 хвилин при 1500об/хв і ність. Відмивання здійснюють щонайменше двічі ним же доводять до попереднього об'єму. Після середовищем Хенкса без фенолового червоного, а чого в дослідних та контрольних пробах крові оціметаболічну активність нейтрофілів та лімфоцитів досліджують з визначенням активності ферментів нюють функціональну активність нейтрофілів та лімфоцитів. Для характеристики функціональної шляхів окислення глюкози мітохондріального сукактивності нейтрофілів визначають здатність їх до цинатдегідрогенази, позамітохондріального, глюфагоцитозу часточок полістиролового латексу d = козо -6 - фосфатдегідрогенази та бактерицидного 1,5мкм (підраховують фагоцитарний індекс (ФІ) ферменту мієлопероксидази. Бактерицидну активність нейтрофілів досліджують в тесті з нітросинім відсоток нейтрофілів, які приймають участь у процесі фагоцитозу і фагоцитарне число (ФЧ) - кільтетразолієм, а здатність нейтрофілів до фагоцитокість часточок латексу, поглинути х одним фагоцизу визначають за допомогою полістиролового латом). Бактерицидну активність нейтрофілів тексу d=1,5мкм. Проліферативну активність лімдосліджують в тесті з нітросинім тетразолієм (НСТ фоцитів визначають у присутності клітинних мітогенів - фітогемаглютиніну, конканаваліну А та - тест спонтанний та стимульований латексом). Для лімфоцитів оцінюють їх проліферативну актибактеріального ліпополісахариду. вність в реакції бластної трансформації (РБТЛ), Спосіб, що заявляється забезпечує удосконапри цьому визначають спонтанну та у присутності лення існуючих способів і за рахунок використання клітинних мітогенів - фітогемаглютиніну (ФГА), цільної крові щурів здійснюється відтворення в in vitro моделі умов, близьких до таких які є в цілісконканаваліну А (КонА), ліпополісахариду (ЛПС). Метаболічну активність нейтрофів і лімфоцитів ному організмі тварин. Запропонований спосіб досліджують цитохімічними методами з визначеноцінки токсичних ефектів важких металів на приням активності мітохондріального ферменту суккладі свинцю та кадмію полягає у визначенні покацинатдегідрогенази (СДГ) та позамітохондріальнозників, які характеризують функціональну активність імунокомпетентних клітин крові та дають го ферменту глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (Г6-ФДГ) шляхів окислення глюкози, які забезпечупевне уявлення про імунотоксичні властивості цих ють енергетичний потенціал клітин та мієлоперокксенобіотиків. Спосіб оцінки токсичних ефектів сидази (МПК), яка виконує бактерицидну дію. Підважких металів на клітини периферичної крові нерахунки для всіх методів проводять в мазках крові лінійних щурів в дослідах in vitro відрізняється тим, що в короткостроковому експерименті визначають за допомогою світлового мікроскопу МІКМЕД - 1. В результаті проведених досліджень встановфункціональну активність клітин крові: нейтрофілів лено, що катіони свинцю на рівні 1·10-3 моль/л ви(фагоцитарна, бактерицидна, метаболічна (внуткликали значне пригнічення фагоцитарної та бакрішньоклітинні ферменти) ) та лімфоцитів (спонтерицидної здатності нейтрофілів та активності в танна проліферативна активність, відповідь на мітогени, активність внутрішньоклітинних ферменних ферментів, стимулювали спонтанне бластоутворення лімфоцитів, їхню відповідь на мітоген тів) після інкубації з розчинами ацетату свинцю та ЛПС, пригнічували - на ФГА та знижували активсульфату кадмію. Дані дослідження співпадають з ність ферменту СДГ. Наступна концентрація свинрезультатами, отриманими в субхронічних експецю 1·10-5 моль/л також викликала зниження бактериментах на тваринах, є високоінформативними, відносно мало витратними. рицидності та функціональних резервів фагоцитів, активності в них ферменту СДГ. Для лімфоцитів Відомо, що нейтрофіли крові приймають було визначено пригнічення спонтанного бластоуучасть у процесі фагоцитозу, відіграють важливу творення та відповіді на Кон-А. Активність фермероль в регуляції гемопоезу, запаленні, процесах нтів в лімфоцитах не змінювалась по відношенню регенерації і підтримки структурнофункціонального гомеостазу організму. Лімфоцидо контрольної проби. Концентрація свинцю 1·10-7 моль/л не викликала змін з боку нейтрофілів, притам належить центральне місце в імунних реакцігнічувала проліферативну активність лімфоцитів ях, вони розпізнають специфічні антигени або анспонтанну та на мітогени ФГА і Кон-А, проте підситигенні детермінанти. Отже, запропонований 5 21313 6 лювала їх відповідь на ЛПС, при цьому активність лімфоцитів крові щурів (Таблиця 2). ферментів в лімфоцитах не змінювалась у порівПорівняння результатів досліджень в експенянні з контролем. Зменшення концентрації катіориментах in vivo та in vitro виявило схожість біолонів свинцю до 1·10-9 моль/л підсилювало поглинагічних е фектів та направленість змін функціональючу та бактерицидну здатність нейтрофілів крові, ної активності нейтрофілів та лімфоцитів в бластоутворення лімфоцитів, їх відповіді на мітозалежності від концентрації досліджуваних металів гени ФГА і ЛПС, пригнічувало на Кон-А, активність в крові піддослідних тварин (Таблиця 3.). внутрішньоклітинних ферментів не змінювалась. Отже отримані дані свідчать про ефективність Найменша з використаних в дослідженнях концені перспективність заявленої корисної моделі, дотрація катіонів свинцю 10-11моль/л при додаванні ступність для застосування, оскільки вона не подо крові щурів не впливала на функціональну актребує великої кількості тварин, здійснюється в тивність нейтрофілів і лімфоцитів (Таблиця 1). короткочасний термін, методи дослідження не поДодавання до периферичної крові щурів катіотребують коштовного обладнання. Заявлена коринів кадмію у концентраціях 1·10-3моль/л та 1·10сна модель може використовуватись в токсикології 5 моль/л також сприяла пригніченню ФАН, зниженпри оцінці токсичних властивостей важких металів ню відсотка НСТ - позитивних клітин, активності та інших ксенобіотиків, а також в практичній гігієні ферментів СДГ, Г-6-ФДГ, МПК, підвищенню спонпри регламентації важких металів. танної проліферації лімфоцитів та пригніченню їх Джерела інформації. відповіді на мітогени. При інкубації клітин крові з 1. Чухловин А.Б., Ягунов А.С., Токалов С.В., катіонами кадмію у концентрації 10-6моль/л виявРезников A.M., Жарская В.Д. Влияние экстрактов лялись низькі значення ФІ та НСТ -спонтанного, почв с различным содержанием тяжелых метапідвищена відповідь лімфоцитів на ФГА, на інші ллов на жизнеспособность клеток системы крови // мітогени залишалась зниженою. Активність кліГигиена и санитария. - 1995. №6. С.11-13. тинних ферментів в обох популяціях лейкоцитів 2. Прокопенко В.В., Набока Ю.Н., Метелица крові не відрізнялась від контролю. Катіони кадмію Л.А., Могилевич С.Е., Гуща Т.О., Луйк А.И. Чувсту концентрації 10-9моль/л сприяли тільки зниженвительность молекулярных, надмолекулярных и ню бластоутворення лімфоцитів у відповідь на клеточных биообъектов к катионам тяжелых метамітоген Кон-А, а у найменшій концентрації – 10ллов // Современные проблемы токсикологии. 11 моль/л також, як і катіони свинцю не викликали 1999. - №3. - С.18-21. змін функціональної активності нейтрофілів та Таблиця 1 Результати впливу катіонів свинцю на функціональну активність нейтрофілів та лімфоцитів периферичної крові щурів в дослідах in vitro (M±m) Фагоцитарна Активність ферАктивність ферментів у Реакція бластної трансформації Концент- актив ність ней- НСТ-тест, % ментів у лімфоцинейтрофілах, умов,од, лімфоцитів , % рація Pb2трофілів тах, умов,од, в пробі ФЧ, СтимуСпонСпон(моль/л) ФІ,% умов,од льов а- СДГ Г-6-ФДГ ПК ФГА Кон-А ЛПС СДГ Г-6-ФДГ танний танна , ний Контро ль -11 1х10 -9 1х10 Контро ль -7 1х10 -5 1х10 -3 1х10 22,0± ±1,4 21,7± ±1,7 38,0± ±0,9* 21,3± ±1,6 25,3± ±3,0 17,0± ±2,6 13,3± ±2,5* 2,0±0,1 2,2±0,1 3,9±0,1* 2,1±0,1 2,3±0,1 2,3±0,2 1,4±0,1* 11,5± ±0,4 10,0± ±0,8 14,0± ±0,8* 10,3± ±0,8 9,0± ±0,6 7,2± ±1,3 * 6,0± ±1,1* 17,6± 0,8 18,3± 0,6 18,4± 2,3 17,0± 0,5 15,6± 0,8 14,2± ±0,7* 13,5± ±0,8* 17,5± ±0,5 17,4± ±0,1 17,3± ±0,3 17,9± ±0,3 17,4± ±0,4 17,2± ±0,2* 16,6± ±0,2* 18,4±0,2 2,5±0,1 18,1±0,1 2,4±0,1 18,2±0,4 2,5±0,1 18,7±0,3 2,6±0,1 17,9±0,3 2,4±0,1 18,1±0,5 2,4±0,1 17,3± ±0,4* 2,3± ±0,1* 21,3± ±1,4 27,7± ±2,9* 28,0± ±1,1* 23,0± ±1,7 12,3± ±0,6* 9,8± ±0,8* 30,7± ±2,5* 6,0± ±0,6 6,7± ±0,8 12,5± ±1,1* 6,3± ±0,4 1,8± ±0,3* 6,3± ±2,1 5,3± ±1,3 9,3± ±0,6 4,1± ±0,6* 3,3± ±0,6* 9,3± ±0,8 4,3± ±0,6* 1,3± ±0,6* -2,3± ±1,3* 5,0± ±0,4 9,0± ±0,8* 7,8± ±0,8* 5,3± ±0,4 8,5± ±0,8* 6,5± ±1,0 9,7± ±1,7* 12,9±0,2 2,5±0,3 12,8±0,2 12,4±0,3 12,7±0,4 12,3±0,5 13,1±0,2 12,8±0,3 12,6±0,2 12,1±0,4 12,9±0,5 12,5±0,2 12,4±0,3* 12,0±0,4 Примітка - * позначена статистично достовірна відмінність даних по відношенню до контролю (Р