Спосіб виготовлення вакцини “триходерм” проти трихофітії великої рогатої худоби бівалентної, живої, сухої, концентрованої

Спосіб виготовлення вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби живої, сухої, бівалентної, концентрованої, що включає виготовлення пожив 3 25296 нізацію грибної маси, змішування її з захисним середовищем і ліофілізацію, який відрізняється тим, що в одній дозі вакцини (1см 3) міститься 3060млн мікроконідій двох збудників трихофітії Trichophyton verrucosum i Trichophyton mentagrophytes. Проведені дослідження свідчать, що введення телятам 1см 3 запропонованої вакцини викликає у 90-100% випадків несприйнятливість до зараження Trichophyton verrucosum і Trichophyton mentagrophytes. Комерційна вакцина дає захист на рівні 90-100% лише до одного збудника - Trichophyton verrucosum, і не захищає тварин від Trichovhvton mentagrophytes. Крім того, зменшення дози щеплення в 5 разів значно полегшує ветеринарним спеціалістам проведення профілактичних обробок. В результаті проведеної роботи розроблені і затверджені в установленому порядку технічні умови на "Вакцину "Три ходерм" проти трихофітії великої рогатої худоби бівалентну, живу, суху, концентровану" - ТУ У 24.4-19024865-002:2005 Приклад 1. Процес виготовлення вакцини «іриходерм» включає в себе наступні операції: виготовлення поживного середовища, висів і роздільне вирощування грибів Trichophyton verrucosum і Trichophyton mentagrophytes, виготовлення захисного середовища (середовище висушування), знімання вирощеної культури з поживного середовища, гомогенізація грибної маси, доведення гомогенату до відповідної концентрації, змішування гомогенатів обох культур у співвідношенні 1:1, змішування отриманої суспензії із захисним середовищем, дозоване фасування вакцини у флакони, ліофілізація вакцини, укупорювання, маркування, контроль вакцини. Для виготовлення поживного середовища стерильне неохмелене пивне сусло з вмістом вуглеводів не менше 14-16% за Баллінгом, розводять водопровідною водою до рівня 7-8% вуглеводів за Баллінгом. Встановлюють рН 7,0-7,2, добавляють 2,0-2,5% мікробіологічного агар-агару, кип'ятять до розчинення агару і фільтрують через ватномарлевий фільтр. Потім розливають в стерильні скляні матраци по 250-300см 3. Стерилізують в автоклаві при 0,5-0,7атм протягом 40-60 хвилин. Після стерилізації рН сусло-агару повинна бути в межах 6,2-6,8. Для отримання посівного матеріалу 15-20 добові культури виробничих штамів Trichophyton verrucosum і Trichophyton mentagrophytes змивають 100-50см 3 стерильного фізіологічного розчину кухонної солі. Отриманою зависсю засівають нові матраци з сусло-агаром із розрахунку 7-10см 3 грибкової зависі на один матрац. Засіяні матраци інкубують при температурі 2628°С протягом 15-20 діб. Помітний ріст на агарі з'являється на 3-5 день. Культура повинна покривати всю поверхню поживного середовища у вигляді рівної білувато-жовтува тої плівки. В якості захисного середовища (середовища висушування ) використовують стерильний водний розчин 20%-ї сахарози і 4%-ї желатини. Для приготування цього середовища в гарячу дистильовану воду добавляють желатину із розрахунку 4% і піс 4 ля її розчинення сахарозу із розрахунку 20% (за масою) на взятий об'єм води, фільтрують і встановлюють рН 7,0-7,2. Стерилізують біжучим паром 3 дні підряд по 30 хвилин. Після стерилізації значення рН повинно бути в межах 6,2-6,8. Грибну масу збирають за допомогою спеціальних шкребків. Її асептичне складають в гомогенізатор, де і проводять розмелювання. Розмелювання грибної маси можна проводити в гомогенізаторах різних систем або колоїдних мельницях, що забезпечують необхідну величину розмолу і стерильність в роботі. При роботі гомогенізатора температура в ємності не повинна бути вищою за 30°С. Співвідношення грибкової маси і стерильної води встановлюють із розрахунку отримання гомогенату з концентрацією мікроконідій 60120млн/см 3. При цьому досягається необхідна концентрація і об'єм кінцевого продукту. Із гомогенізованої грибкової маси відбирають пробу і контролюють концентрацію мікроконідій в отриманому гомогенаті. Так вчиняють з кожним виробничим штамом. Після чого їх об'єднують в одн у ємність. Для змішування гомогенату із захисним середовищем використовують гомогенат із вмістом 600-1200млн/см 3 мікроконідій. Бутль з гомогенатом за допомогою стерильних шлангів змішують із захисним середовищем у співвідношенні 1:1-1:1,5. Оптимальним є співвідношення гомогенату і захисного середовища 1:1-1:1,2. Це співвідношення забезпечує максимальне збереження життєздатності мікроконідій і економічно виправдане. Подальше збільшення вмісту захисного середовища не приводить до суттєвого покращення показників вакцини, але збільшує затратну частин у на її виготовлення. При використанні співвідношення 1:1 отримують суміш з концентрацією мікроконідій 300-600млн/см 3. Бутель із сумішшю встановлюють в шутельапарат і ретельно перемішують. Далі, при постійному перемішуванні, проводять фасування вакцини у флакони в залежності від необхідної кількості доз. Одна доза повинна містити 30-60млн/см 3 мікроконідій. Ліофілізація вакцини складається з двох пов'язаних процесів: глибоке заморожування продукту в низькотемпературній камері з подальшим сублімаційним висушуванням. Касети з флаконами вакцини покривають стерильними марлевими салфетками або прикривають вакуумними пробками і розміщують в охолодженій до мінус 40-50°С камері і заморожують при температурі не нижчій за мінус 45°С протягом 1824 годин. Після цього касети закладають на висушування. Підвищення температури до мінус 29°С повинно відбуватись в межах 1-2 градуси за годину. З мінус 29°С до мінус 5°С лише на 1 градус за годину. З мінус 5°С до 5°С строго 1 градус за годину. 35°С до 25°С - 1-2 градуси за годину. Після досягнення 25°С проводять досушування при цій температурі протягом 12-24 годин, до отримання рівної таблетки, яка відстає від стінок флакону. Після цього проводять укупорку флаконів гумовими пробками і обкатують алюмінієвими ковпачками. Вак 5 25296 цина придатна для використання протягом 12 місяців з дня виготовлення при зберіганні її в сухому темному місці при температурі 2-8°С. Після цього проводять контроль вакцини за наступними показниками: контамінація сторонньою мікрофлорою, кількість мікроконідій, кількість живих мікроконідій, нешкідливість, імуногенність, розчинність. Приклад 2. Перевіряють показники якості комерційної вакцини проти трихофітії великої рогатої 6 худоби ЛТФ-130, виробництва Ставропольської біологічної фабрики (РФ) і вакцини «Триходерм» нашого виготовлення. Отримані дані представлені в Таблиці 1. Як видно із Таблиці 1, за показниками «розчинність», «контамінація сторонньою мікрофлорою» комерційна вакцина і вакцина, розроблена нами мають однакові показники. В той же час життєздатність мікроконідій у запропонованій вакцині вища на 15%. Таблиця 1 Показники якості вакцин Вакцина Серія ЛТФ-130 ЛТФ-130 «Триходерм» «Триходерм» 34 39 3 4 Розчинність (хв) 2 2 2 2 Результати контролю Кількість мікро- Кількість живих Життєздатність Контамінація конідій (млн/см 3) мікроконідій (%) (млн/см 3) 6,8 5,2 76,47 7,6 5,8 76,3 50,3 45,7 90,85 37,7 34,5 91,5 Приклад 3. Дослідними і комерційними серіями вакцини імунізували по 2 групи телят віком 1-3 місяці. Вакцини вводили згідно настанов по застосуванню. Вакцини вводили внутрішньом'язево, двічі з інтервалом 14 діб. Вакцина ЛТФ-130 повинна містити не менше ніж 4,0млн/см життєздатних мікроконідій в робочому розведенні. Таку вакцину вводять телятам до 4-місячного віку в дозі 5см 3 на одне щеплення. Таким чином для одного щеплення теляті необхідно ввести 5см вакцини з вмістом не менше 20млн життєздатних мікроконідій. Запропонована вакцина повинна містити в 1см 3 не менше 20млн життєздатних мікроконідій. І доза щеплення складає лише 1см 3. Через 25 діб після другої вакцинації дослідних і контрольних (невакцинованих) телят заражають нашкірним способом вірулентними штамами збудників трихофі тії Trichophyton verrucosum і Trichophyton mentagrophytes. При цьому зліва заражають Trichophyton verrucosum, а справа Trichophyton mentagrophytes. Облік результатів проводять через 15-25 діб після зараження. Результати досліду наведені в Таблиці 2. Таблиця 2 Визначення імуногенності вакцин Об'єм для щеплення (см 3) щеплено (гол) ЛТФ-130 34 5 10 ЛТФ-130 39 5 10 «Триходерм» 3 1 10 «Триходерм» 4 1 10 Не вакциновані (контрольні) Вакцина Серія заражено (гол) 10 10 10 10 4 Кількість тварин із кількості заражених (гол) захворіло не захворіло 0/9 10/1 1/10 9/0 0/1 10/9 1/1 9/9 4/4 0/0 % захисту 100/10 90/0 100/90 90/90 0 Примітка: чисельник - заражені Trichophyton verrucosum знаменник - заражені Trichophyton mentagrophytes Дані, представлені в Таблиці 2, свідчать, що введення телятам 1см 3 запропонованої вакцини викликає у 90-100% випадків несприйнятливість до зараження Trichophyton verrucosum і Trichophyton mentagrophytes. Комерційна вакцина дає захист на рівні 90-100% лише до одного збудника - Trichophyton verrucosum, і не захищає тварин від Trichophyton mentagrophytes. Крім того зменшення дози щеплення в 5 разів значно полегшує проведення обробок ветеринарним спеціалістам. Джерела інформації: 1. Цициашвили Л.Е. Возбудители дерматомикозов крупного рогатого скота и геофильные кератинофилы в Грузинской ССР. // Автореф. Дисс. Канд. Биол. Наук. Ереван, 1970. - 18с. 2. Buhlman X., Rieth H. Microspomm, Trichophyton and Keratomyces infections in man and domestic animals. / Schweis. Arch. Tierhelkinde, 1962. -V.104.S.537-545. 3. El-Fiki A.J., Rielth H. Bovine Trichophyton infection as the sourse of human dermatomycosis. / 7 25296 Berl. Munch. Tierarzte. Wschr., 1958. -Ig.71. -S.471472. 4. Лабусова Н.И. С тимуляция поствакцинального иммунитета при трихофитии крупного рогатого скота / Автореф. дисс. канд. вет. наук. Минск.2004. -21с. Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 8 5. Скрипник В. Роль гіпсовидного трихофітона (Trichophyton mentagrophytes) в епізоотології трихо фітії тварин // Науково-технічний бюлетень інституту біології тварин і державного науководослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок. -Вип. 6. -№3,4. –с. 356-360.Львів, 2005. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601