Спосіб моделювання хронічного стресу різного рівня у щурів

Спосіб моделювання хронічного стресу різного рівня у щурів, який відрізняється тим, що ситуативний стресуючий подразник підсилюють дією світла у нічний час та електричним струмом порогової чутливості, а тривалість дії подразників продовжують до 10 місяців. (19) (21) u200702224 (22) 01.03.2007 (24) 27.08.2007 (46) 27.08.2007, Бюл. № 13, 2007 р. (72) Пишнов Георгій Юрійович, Брюзгіна Тетяна Семенівна (73) ІНСТИТУТ МЕДИЦИНИ ПРАЦІ АМН УКРАЇНИ, Пишнов Георгій Юрійович, Брюзгіна Тетяна Семе 3 25759 Цей спосіб може бути застосований для з'ясування патогенетичних механізмів розвитку передпатологічних явищ при хронічному психоемоційному навантаженні. Спосіб здійснюється таким чином: Згідно з діючою "Гігієнічною класифікацією праці..." 2001p. напруженість праці поділяється на 3 класи, а саме: оптимальний, допустимий та шкідливий клас 1-3 ступеня. Шкідливий клас за показником "напруженість праці" є характерною рисою для різноманітної операторської праці [13, 14]. Таким чином умовно можна виділити 4 рівня напруження (стресу) під впливом зовнішніх чинників: без напруження (допустимий та оптимальний рівень), напруження І рівня (клас 3.1), напруження II рівня (клас 3.2), напруження III рівня (клас 3.3). Дослідження проведені на щура х-самцях лінії Вістар. В основу моделі хронічного емоційного стресу (ХЕС) було покладено модель [15], яку було розроблено академіком В.В. Фролькісом зі співавторами для вивчення впливу довготривалого стресу на тривалість життя щурів. Дан у модель було доповнено і модифіковано згідно розробленої проф. Ф.П. Ведяєвим моделі емоційностресового стану у тварин [4]. Окрім того вибирали пом'якшений режим утримання тварин без водної та їстівної депривації для усунення можливої передчасної загибелі тварин. При цьому в експериментальних тварин виникає "стрес очікування", який є характерною ознакою напруженої праці операторів. Моделювання ХЕС здійснювали наступним чином. Контрольна група тварин утримувалась у клітці 40х60см у кількості 5шт. у стандартних умовах, годування здійснювалось за графіком віварію. Група І (напруження І рівня) утримувалась у перенаселених клітках з частою зміною мешканців (по 8 тварин), 1 раз на 2 тижня на протязі доби кількість тварин у клітці збільшувалась до 16шт. Окрім того, для цієї групи проводили періодичну харчову та водну ротацію за схемою: кожен тиждень змінювався режим харчування з ранкових часів на вечерні.. Для групи II (напруження II рівня) додавали порушення режиму природного освітлення, а саме, на протязі всього строку експерименту здійснювали освітлення люмінесцентними лампами (80Вт) у нічний час, з перервою в 1 тиждень для злому біоритмів. Для групи III (напруження III рівня) ще додавали такий екстероцептивний подразник, як електричний струм. Підключення струму до 4 стелі клітки здійснювалось на 3-й місяць і до кінця експерименту утримання тварин автоматично через 20 (30) хвилин на протязі 3 годин щоденно (5 днів на тиждень) з 12-ої до 15-ої години. Час дії струму становив не більше 30сек. Величина струму підбиралась експериментально до появи рухової активності тварин, проміжок між підключенням струму коливався від 20 до 30хв. щоденно для усунення ефекту звикання. Таким чином тварини (з 7-ми місячного віку) утримувались 10 місяців. Наприкінці 1-го, 3-го, 5-го, 7-го і 10-го місяця тварин зважували та визначали поведінкові реакції, а саме: проводили тестування "відкрите поле" протягом 2хв. та утримання на вертикальної поверхні (поперечному дроті) [7]. При моделюванні 10-ти місячної тривалості хронічного стресу ми виходили з розрахунку 20-25 річного стажу у людини до всієї тривалості її життя з екстраполяцією на тварин. Поведінкові реакції тварин визначали за наступними показниками: 1. горизонтальна активність (кількість перетнутих квадратів "відкритого поля" за 2-ві хв.) 2. вертикальна активність (число вертикальних підйомів) 3. показник стресування (число фекалій). За тиждень до завершення експерименту проводили забір крові з хвостової вени для визначення ліпідів в сироватці крові стандартним методом. Також визначали вміст лейкоцитів, еозинофілів, НСТ-тест [10]. Таким чином, перевагами запропонованого способу є: - стандартизація умов проведення дослідження; - можливість аналізу у гр упах співставлення з різним рівнем навантаження. - можливість проведення довготривалого експерименту у реальному часі. Для контролю хронічної напруженості визначали вміст жирних кислот у сироватці крові на 10-й місяць експерименту, визначали вміст лейкоцитів у крові та температуру тіла. Дослідженнями встановлено, що на 10-й місяць утримання щурів за вище наведеною схемою стресування, вміст арахідонової кислоти в сироватці крові достовірно перевищував таковий не тільки у контролі, а й групах різного рівня дії стресорних чинників (табл. 1). Таблиця 1 Спектр жирних кислот в сироватці крові щурів при різних рівнях стресу Назва ЖК С 14:0 міристинова С 15:0 пентадеканова С 16:0 пальмитинова С 16:1 пальмитоолеїнова С 17:0 маргаринова С 18:0 стеаринова С 18:1 олеїнова контроль 15,8±1,3 1,57±0,12 35,4±3,3 3,1±0,3 1,0±0,27 9,2±0,8 12,7±1,0 І гр упа 16,2±0,7 1,83±0,1 36,3±1,2 3,4±0,3 0,7±0,03 9,2±0,9 14,0±1,0 II гр упа 15,1±1,7 1,5±0,03 36,5±0,3 2,8±0,1 0,6±0,1 8,3±0,5 14,0±0,9 III група 16,9±1,6 1,8±0,1 32,0±0,6 2,7±0,06 1,0±0,06 9,4±0,6 12,3±0,7 5 25759 6 Продовження таблиці 1 Назва ЖК С 18:2 лінолева С 18:3 ліноленова С20:4 арахідонова åHac. åНенас. åПНЖК контроль 14,1±1,9 1,0±0,3 4,0±0,1* 63,0±4,6 33,7±1,4 19,1±0,4 За літературними даними цей факт вказує на підвищений рівень перекісного окислення ліпідів біомембран, тобто на наявність стресу у щурів [3, 12]. На наш погляд вміст арахідонової кислоти може бути не тільки якісним, але й кількісним маркером рівня стресування організму. Для додаткового впевнення у тому, що запропоноване моделювання стресу у тварин відображає хронічну стресорну дію, проводили забір крові для постановки НСТ-тесту, загального вмісту лейкоцитів у периферійної крові та еозинофілів, як І гр упа 10,0±1,4 0,7±0,03 7,4±0,8* 65,0±1,2 35,0±1,2 18,5±2,2 II гр упа 13,1±1,5 0,7±0,06 7,5±0,8* 61,9±1,7 38,1±1,7 21,2±1,0 III група 12,7±0,5 1,3±0,2 10,0±0,5* 61,1±0,7 38,9±0,7 23,9±0,2 маркерів стресу. Було виявлено, що кількість лейкоцитів на 4-й місяць експерименту достовірно перевищує контроль у II та III експериментальних груп, а на 10-й місяць перевищує контроль у всіх 3-х гр упах. Вміст еозинофілів перевищував контроль також у II та III груп, на 10-й місяць - у III групи. Це може побічно свідчити про наявність стресування організму піддослідних тварин, тобто про адекватність обраного підходу для моделювання хронічного стресу. Таблиця 2 Вміст лейкоцитів і еозинофілів у крові щурів Групи (n=7) Контроль І гр упа II гр упа III група Вміст лейкоцитів у крові (х109) На 4-й місяць На 10-й місяць 6,9±0,2* 7,0±0,1* 6,6±0,2 9,5±0,2* 9,6±0,2* 8,5±0,2* 12,3±1,0* 10,0±0,2* За показниками НСТ-тесту (табл. 3) виявлено підвищення неспецифічної резистентності організму щурів у III гр упі у порівнянні з контролем - достовірне збільшення як спонтанного так і активованого НСТ-тесту. Це можна трактувати як несприятливий факт для III групи, тому що хронічне перенапруження неспецифічної резистентності може призвести до виснаження адаптаційних ме Вміст еозинофілів у крові (%) На 4-й місяць На 10-й місяць 1,9±0,3* 2,3±0,4* 1,7±0,2 1,9±0,4 3,3±0,4* 2,4±0,4 8,0±0,5* 4,1±0,2* ханізмів регуляції організму до стресового навантаження, та проявів дизадаптаційних явищ. До речи, тварини III групи мали найгірший зовнішній вигляд щодо хутряного покрову - спостерігалось полисіння, тьмяний колір волос, брудний підшорсток, вогкість на дотик. Рухлива активність тварин цієї групи підвищувалась при наближенні до клітки, тобто, спостерігалася підвищена тривожність. Таблиця 3 Показники НСТ-тесту та температури у щурів в експерименті Групи Контроль І гр упа II гр упа III група НСТ-тест (у.о.) спонтанний активований 12,3±1,7* 15,3±1,6* 11,3±1,6 13,7±1,4 10,6±1,4 13,7±1,1 23,6±1,5* 29,0±1,1* Відомо, що активація метаболізму ейкозотетраєноєвих кислот може призводити до порушень теплового балансу організму [6]. Тому на 10-й місяць експерименту було проведено вимірювання базальної температури та шкіри щурів за допомогою електротермометру (табл. 3). Виявлено, що базальна температура у щурів III групи достовірно вище, ніж у контрольній групи. Навпаки, температура шкіри кінцівок у всіх щурів Температура С° базальна кінцівок 37,8±0,1* 21,8±0,37* 37,5±0,2 20,4±0,17* 37,5±0,2 20,2±0,12* 38,4±0,07* 20,2±0,14* піддослідних груп нижче, ніж у контролі. Це може свідчити про перерозподіл температурного балансу в організмі при хронічному стресі, та стану компенсації у піддослідних тварин. Звуження периферичних судин зберігає тепло, але ймовірно підвищує навантаження на серцево-судинну систему, що невдовзі може призвести до стану декомпенсації. За даними літератури хронічне виробниче пе 7 25759 ренапруження викликає у людини низку психопатологічних симптомів, серед яких варто виділити підвищену тривожність, стомлення, збудливість, погіршення сну тощо. Тому, при експериментальних дослідженнях нами було вивчено поведінкові реакції щурів в динаміці хронічного навантаження згідно вище названої моделі стресу. На Фіг. показано, що число квадратів "відкритого поля", яки перетинають щури, поступово зменшуються як у контрольній групі, так і в групах І та II рівня напруження. Щури III гр упи перетинали достовірно більше квадратів "поля", ніж контрольної та інших гр уп. Вертикальна активність також була більшою у III гр упі за весь період досліджень, що трактується деякими авторами, як показник загальної дослідницької активності, чутливої до рівня тривожності. Число дефекацій у контрольній групі при проведенні тестування в середньому було однаковим, що побічно вказує на середній або низький рівень тривожності. У групах з різним рівнем напруги число дефекацій змінювалось в різні строки досліджень, що може свідчити про емоційну неврівноваженість у тварин цих груп. Джерела інформації: 1. Аракелов Г.Г., Лысенко Н.Е., Шотт Е.С. Психо физиологический метод оценки тревожности/Психологический журнал. - 1997. - №2. - Т.18. С.102-113. 2. А.С. 654249, МКИ А61В 5/16. Способ определения уровня эмоционального напряжения /О.К. Тихомиров, Ю.Г. Коршунов, И.Г. Белавина, Ю.Д. Бабаева (СССР). - №2371164/28 - 13, заявлено 11.06.1976г., опубликовано 30.03.1979г., бюллетень №12. 3. Варус B.I., Соловська С.С., Брюзгіна Т.С., Бєлов О.А. Оцінка порушень ліпідного метаболізму у поті ліцеїстів у період учбового процесу / Доп. Нац. акад. наук України. - 2004. - №11. - С.189-192. 4. Ведяев Ф.П. Лимбическая система мозга, эмоциональный стресе и его эндокринновегетативные проявления / Вестн. Акад. Мед. наук СССР. - 1975. - №8. - С.57-64. 5. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Уколова М.А. Адаптационные реакции и резистентность органи Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 8 зма /Ростов н/Д.: Изд-во Рост. ун-та, 1990. - 224с. 6. Грурин В.Н. Обмен липидов при гипотермии, гипертермии и лихорадке. - Минск: Белорусь, 1986. - 191с. 7. Колуев А.В. Проблемы изучения стрессорного поведения. - К.: CSF, 1998. - 204с. 8. Ковалева А.И., Пышнов Г.Ю. Проблема хронического утомления. / Мед.тр уда и пром. экол. - 2001, №11. - с.1-5. 9. Кундієв Ю.І., Чернюк B.I., Шевцова В.М. Напруженість праці як фактор професійного ризику здоров'ю // Український журнал з проблем медицини праці. - 2005. - №3-4. - С. 90-98. 10. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П., и др.; Под ред. Меньшикова В.В. - М.: Медицина, 1987. - 368с. 11. Онтогенетические и генетикоэволюционные аспекты нейроэндокринной регуляции стресса / Науменко Е.В., Вигаш М., Поленов А.Л. и др. - Новосибирск: Наука. Сиб. Отд-ние, 1990. - 230с. 12. Петрене С.Н., Юшина Л.В. Роль липидов в адаптационных реакциях организма на экстремальное воз действие. // Патологическая физиология и экстремальная терапия. - 1989. - №3. - с.51-53. 13. Пышнов Г.Ю., Чуй Т.С., Высоцкая Л.Г. Физиолого-гигиенические исследования работников радиотехнического обеспечения управления воздушным движением / Укр.журн. з. проблем медицини праці. - 2005. - №3-4. - С.39-46. 14. Пишнов Г.Ю. Апихтін К.А., Кудієвський Я.В. Клітинна реактивність при напруженій праці операторів керування повітряним рухом (авіадиспетчерів)/Клінічна та експериментальна патологія. 2004. - том 3. - №2. - С. 214-216. 15. Фролькіс В.В., Верхратський Н.С., Мигован С.А., Дубілей Т.О., Рушкевич Ю.С. Модель хронічного ситуаційного стресу та його вплив на темп старіння і тривалість життя щурів / Фізіол. Журн. 1998. - т. 44. - №5-6. - С.7-13. 16. Юматов Е.А. Моделирование конфликтного зоосоциального поведения у крыс в лабиринте. - В кн.: Модели и методы изучения экспериментальных стрессов. - Волгоград, 1977. - С.32-33. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601