Процес мікроінкапсуляції клітин і тканини прищитоподібної залози в альгінатні мікрокапсули

Процес мікроінкапсуляції клітин і тканини прищитоподібної залози в альгінатні мікрокапсули, який включає рівномірне розподілення окремих клітин або шматочків тканини в розчині альгінату, їх полімеризацію в гелеутворюючому розчині з іонами кальцію та наступне промивання, який відрізняється тим, що на етапі полімеризації як механічний вплив додатково застосовують перемішування розчину з мікрокапсулами, які містять паратиреоїдні клітини або тканину, на магнітній мішалці з частотою 60-90 об/хв при температурі 37 °С. (19) (21) u200706398 (22) 08.06.2007 (24) 25.10.2007 (72) ПАСТЕР ІГОР ПЕТРОВИЧ, UA, ТРОНЬКО МИКОЛА ДМИТРОВИЧ, UA (73) ІНСТИТУТ ЕНДОКРИНОЛОГІЇ ТА ОБМІНУ РЕЧОВИН ІМ. В.П. КОМІСАРЕНКА АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ, UA, ПАСТЕР ІГОР ПЕТРОВИЧ, UA, ТРОНЬКО МИКОЛА ДМИТРОВИЧ, UA (56) 3 xenotransplantation of microencapsulated newborn pig parathyroid cells in the treatment of hypoparathyroidism in rats // Chin. Med. J. (Engl). 2003. - Vol.116, N8. - P.1161-1165]; пропусканням водного розчину альгінату (1,5%) з шматочками тканини прищитоподібної залози розміром приблизно 1мм через голку 18G в 1,5%-ний розчин хлорида кальцію (забуферений 2-Nциклогексиламіноетан сульфонової кислоти) для формування мікрокапсул шляхом інкубації протягом 4 хвилин при температурі 4°С; наступною інкубацією у водному розчині фоточутливого полі-L-лізину протягом 9 хвилин та промиванням буфером 2-N-циклогексиламіноетан сульфонової кислоти з наступним опроміненням ртутною лампою потужністю 400Вт протягом 4 хвилин; додатковою інкубацією мікрокапсул в 0,15%-ному розчині альгіната з метоксиполіетиленгліколем протягом 6 хвилин; промиванням буфером 2-N-циклогексиламіноетан сульфонової кислоти з наступною обробкою цитратом натрія протягом 6 хвилин для розрідження внутрішньокапсульного альгіната кальцію; остаточним промиванням капсул 2-Nциклогексиламіноетан сульфоновою кислотою [Lee C.H., Wang Y.J., Kuo S.M., Chang S.J. Microencapsulation of parathyroid tissue with photosensitive poly(L-lysine) and short chain alginateco-MPEG // Artif. Organs. - 2004. - Vol.28, N6. P.537-542]. Проте, всі ці способи мають певні недоліки, оскільки більшість з них є достатньо складними, багатоступінчастими процедурами, та не забезпечують достатньої стабільності альгінатних мікрокапсул, які містять окремі клітини або шматочки тканини прищитоподібної залози, до дії зовнішніх фізико-хімічних чинників (зокрема, впливу механічних факторів, зміни осмоляльності розчину, підвищення температури середовища тощо), а в деяких застосовують в якості гелеутворюючого катіона іони барію, які здатні пригнічувати калієві канали в мікроінкапсульованих клітинах і, як наслідок, привести до загибелі останніх [Zimmermann U., Thurmer F., Jork A. et al. A novel class of amitogenic alginate microcapsules for long-term immunoisolated transplantation // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2001. Vol.944. - P.199-215]. Крім цього, полі-L-лізин, який використовують в якості однієї з компонент багатошарових капсул, спричинює клітинну адгезію на поверхні мікрокапсул, здатен індукувати фіброз мікрокапсул шляхом активації компліменту і продукцію макрофагами цитокінів (зокрема, інтерлейкіну-1 і фактору некрозу пухлин-α), а за певних умов може викликати навіть некроз мікроінкапсульованих клітин [King A. Evaluation of alginate microcapsules for use in transplantation of islets of Langerhans. Acta Universitatis Upsaliensis. Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Medicine 1072. Uppsala, 2001. 43pp.; Strand B.L., Ryan L., Veld P.I. et al. Poly-Llysine induces fibrosis on alginate microcapsules via the induction of cytokines // Cell Transplant. - 2001. Vol.10, N3. - P.263-275]. 27283 4 За прототип авторами взято спосіб мікроінкапсуляції острівців підшлункової залози телят в альгінатні мікрокапсули, який включає пропускання суміші острівців в 1,7-2,5%-ному розчині альгінату через генератор мікрокапсул, полімеризацію мікрокапсул в розчині хлориду кальцію (100ммоль/л) та їх промивання в розчині Кребса-Рінгера [Figliuzzi M., Plati Т., Cornolti R., et al. Biocompatibility and function of microencapsulated pancreatic islets // Acta Biomaterialia. - 2006. - Vol.2, N2. - P.221-227]. Недоліками цього способу мікроінкапсуляції острівців підшлункової залози телят також є недостатня стабільність альгінатних мікрокапсул, які містять суспензію клітин, до дії зовнішніх фізико-хімічних чинників (зокрема, впливу механічних факторів, зміни осмоляльності розчину, підвищення температури середовища тощо). Таким чином, вказані недоліки знижують ефективність функціонування мікроінкапсульованих в альгінатні мікрокапсули острівців підшлункової залози телят. В основу даної корисної моделі поставлено задачу розробити такий процес мікроінкапсуляції клітин і тканини прищитоподібної залози в альгінатні мікрокапсули, в якому за рахунок підбору технологічних режимів на одному з етапів приготування підвищується механічна та осмотична стійкість альгінатних мікрокапсул, які містять паратиреоїдні клітини або тканину, до дії зовнішніх фізико-хімічних чинників (зокрема, впливу механічних факторів, зміни осмоляльності розчину, підвищення температури середовища тощо). Поставлена задача досягається тим, що в процесі мікроінкапсуляції клітин або тканини прищитоподібної залози в альгінатні мікрокапсули, який включає рівномірне розподілення окремих клітин або шматочків тканини в розчині альгінату, їх полімеризацію в гелеутворюючому розчині з іонами кальцію та наступне промивання, згідно з даною корисною моделлю, на етапі полімеризації в якості механічного впливу додатково застосовують перемішування розчину з мікрокапсулами, які містять клітини або тканину, на магнітній мішалці з частотою 60-90об/хв при температурі 37°С. До даного рішення автори прийшли після дослідження фізичних характеристик мікроінкапсульованої в альгінатні мікрокапсули тканини прищитоподібної залози на всіх етапах виготовлення та виявленні певної залежності стабільності мікрокапсул, які містять паратиреоїдну тканину, від додаткового механічного перемішування розчинів при оптимальній температурі. На відміну від прототипу, запропонований авторами процес підвищення стабільності мікроінкапсульованої паратиреоїдної тканини перемішуванням на магнітній мішалці з частотою 60-90об/хв при температурі 37°С дає можливість оптимізувати процедуру мікроінкапсуляції тканини прищитоподібної залози в альгінатні мікрокапсули. Даний механічний вплив є оптимальним, оскільки 5 сприяє кращому контакту іонів кальція з альгінатними мікрокапсулами, які містять паратиреоїдні клітини або тканину, та кращому проникненню іонів кальція через поверхню цих мікрокапсул, що дозволяє значно прискорити гелеутворюючі процеси в мікрокапсулах без їх пошкодження, а також виключає можливість утворення конгломератів. Даний температурний режим відповідає температурі людського тіла, як можливого місця трансплантації альгінатних мікрокапсул, і є оптимальним для мікроінкапсуляції клітин або тканини прищитоподібної залози, оскільки при зниженні температури уповільнується швидкість цього процесу, а при зростанні температури збільшується ймовірність деградації біополімеру та втрати його основних фізикохімічних властивостей (зокрема, здатності формувати гель в присутності катіонів). Процес здійснюється наступним чином. Попередньо готують водний розчин альгінату [Пастер І.П., Тронько М.Д. Процес приготування водного розчину альгінату, призначеного для виготовлення мікрокапсул. Патент №20265 UA, МПК C12N11/00. Опубл. 15.01.2007]. Через генератор альгінатних мікрокапсул подають: розчин альгінату (0,25%) з рівномірно розподіленими окремими клітинами або шматочками тканини прищитоподібної залози розміром до 1мм3 із швидкістю 0,03мл/хв та кисень із швидкістю 6,5л/хв. Мікроінкапсульовані паратиреоїдні клітини або тканину інкубують в розчині хлориду кальцію (100ммоль/л, 290мосмоль/л, рН 7,4) при додатковому постійному перемішуванні на магнітній мішалці з частотою 60-90об/хв при температурі 37°С протягом 15-20 хвилин і тричі промиванням в розчині хлориду натрію (0,9%, 290мосмоль/л). Після мікроінкапсуляції вимірюють діаметри альгінатних мікрокапсул, які містять паратиреоїдні клітини або тканину, за допомогою світлового мікроскопа з окулярною вставкою, а також проводять оцінку цілісності, механічної та осмотичної стійкості та відбирають найбільш стабільні альгінатні мікрокапсули [Пастер І.П., Тронько М.Д. Процес визначення механічної стійкості альгінатних капсул, призначених для мікроінкапсуляції тканин або клітин. Патент №15729 UA, МПК G01N33/15, C12N5/00, А61В10/00. Опубл. 17.07.2006; Пастер І.П., Тронько М.Д. Процес визначення осмотичної стійкості альгінатних капсул, призначених для мікроінкапсуляції тканин або клітин. Патент №15730 UA, МПК G01N33/15, C12N5/00, А61В10/00. Опубл. 17.07.2006]. Приклад Мікроінкапсуляція тканини прищитоподібної залози людини в альгінатні мікрокапсули з метою отримання стабільних мікрокапсул, які містять паратиреоїдну тканину. Мікроінкапсуляцію тканини прищитоподібної залози людини проводять як за методом для мікроінкапсуляції острівців підшлункової залози телят [Figliuzzi М., Plati Т., Comolti R., et al. Biocompatibility and function of microencapsulated pancreatic islets // Acta Biomaterialia. - 2006. - Vol.2, 27283 6 N2. - P.221-227] (перший дослід), так і запропонованим методом, суть якого полягає в додатковому постійному перемішуванні на магнітній мішалці з частотою 60-90об/хв при температурі 37°С мікроінкапсульованої в альгінатні мікрокапсули паратиреоїдної тканини під час інкубації в розчині хлориду кальцію (100ммоль/л, 290мосмоль/л, рН 7,4) протягом 1520 хвилин на етапі полімеризації (другий дослід). Після мікроінкапсуляції вимірюють діаметри альгінатних мікрокапсул, які містять тканину прищитоподібної залози, за допомогою світлового мікроскопа з окулярною вставкою, а також проводять оцінку цілісності, механічної та осмотичної стійкості та відбирають найбільш стабільні альгінатні мікрокапсули [Пастер І.П., Тронько М.Д. Процес визначення механічної стійкості альгінатних капсул, призначених для мікроінкапсуляції тканин або клітин. Патент №15729 UA, МПК G01N33/15, C12N5/00, А61В10/00. Опубл. 17.07.2006; Пастер І.П., Тронько М.Д. Процес визначення осмотичної стійкості альгінатних капсул, призначених для мікроінкапсуляції тканин або клітин. Патент №15730 UA, МПК G01N33/15, C12N5/00, А61В10/00. Опубл. 17.07.2006]. Результати визначення механічної стійкості альгінатних мікрокапсул, які містять клітини або тканину, показали, що 24-годинна інкубація призводить до збільшення розмірів мікрокапсул на 84% в першому досліді та 69% в другому досліді (таблиця 1). Крім цього, в першому і другому дослідах реєструється відповідно 45% і 35% пошкоджених мікрокапсул. Наступна інкубація протягом додаткових 72 годин не призводить до подальших суттєвих змін розмірів мікрокапсул, які містять клітини або тканину. NN Показник, який досліджується 1 2 Діаметр мікрокапсул (мм) Інтактні мікрокапсули (%) 1 2 Діаметр мікрокапсул (мм) Інтактні мікрокапсули (%) 0 годин 2,82±0,11 100,0 Другий дослід 2,84±0,08 100,0 Примітка. * - Р