Спосіб отримання біологічно активного препарату із кісткового мозку

Спосіб отримання біологічно активного препарату із кісткового мозку, що включає подрібнення та розчинення його в органічному розчиннику, який відрізняється тим, що екстракцію проводять ізотонічним розчином, а отриманий продукт піддають термічній обробці при температурі 80-85вС протягом 10-20 хвилин з наступною стерилізацією його за допомогою міліпорових фільтрів з діаметром пор 0,22-0,17 мкм. Винахід належить до біотехнології, безпосередньо до фармакології і може бути використаний при виробництві біологічно активних препаратів для активації гуморального імунітету. Відомі способи отримання біологічно активних речовин із тканин та органів тварин основані на збагаченні препаратів низькомолекулярними речовинами, які володіють регуляторною дією на анаболічні процеси організму [1, 2, 3]. Біологічно активні речовини утворюються в результаті переживання тканини в несприятливих умовах, де відбувається перебудова процесів метаболізму тканини та створення біогенних речовин, в склад яких входять органічні (пептиди, амінокислоти, дікарбонові кислоти, жирно-ароматичні кислоти, оксікислоти, вуглеводи тощо) та мінеральні (залізо, магній, алюміній, кремній, марганець, цинк, нікель, хром, мідь, фосфор, кальцій, магній, натрій, тощо) речовини. За останній час встановлено, що кожна тканина, крім згаданих біологічно активних речовин, володіє специфічними речовинами, характерними тільки для певної тканини [5, 6, 7, 8, 9]. Прототипом винаходу є спосіб отримання біологічно активного препарату із кісткового мозку [4] Визначення дії гуморальних факторів кісткового мозку та їх вплив на функції та активність гуморального імунітету описано в джерелах [9, 10, 11, 12, 13, 14. 15]. Спосіб отримання біологічно активного препарату із кісткового мозку по прототипу, включає подрібнення його в гомогенізаторі та розчинення в органічному середовищі. До недоліків існуючих технологій виробництва біологічно активних препаратів із кісткового мозку [4] слід віднести те, що при отриманні гу моральних факторів із сировини використовують різні органічні розчинники, а кінцевий продукт ма^ вузький діапазон дії В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб отримання біологічно активного препарату із кісткового мозку шляхом екстракції із гомогенату розчинних в ізотонічному розчині сполук, виділення нерегулятсрних білків за допомогою термічної обробки та фільтрації, що забезпечить активність і специфічність модулятора гуморального імунітету та зниження організмом тварин енергозатрат при імунній відповіді на білок. Поставлена задача виконується тим, що в способі отримання біологічно активного препарату із кісткового мозку, що включає подрібнення його та розчинення в ізотонічному розчині специфічних та неспецифічних сполук. Новим є те, що розчин піддають термічній обробці при температурі 8085°С на протязі 10-20 хвилин для видалення нерегуляторних білків та стерилізації розчину (модулятора функцій лімфоцитів В-системи), з використанням міліпорових фільтрів діаметром 0,220,17 мкм. Вище викладений спосіб сприяє зниженню антигенності цільового препарату Мобес - (модулятор В-системи), активації біологічної дії на метаболізм завдяки наявності низькомолекулярних біогенних речовин та модуляції функцій лімфоцитів В-системи гуморальними факторами кісткового мозку. Синергічність цих механізмів дії Мобес сприяє розширенню діапазону впливу на гомеостаз організму тварин. Технічне рішення по розробці технології отримання препарату Мобес (модулятора В-системи) основане на слідуючих результатах досліджень. т сч CM ю О) со о» 39522 1. Відібраний після забою молодняку великої рогатої худоби кістковий мозок на протязі 4-5 діб витримують в холодильнику при температурі +2-4°С, після чого подрібнюють в гомогенізаторі, заливають двома об'ємами ізотонічного розчину і знову витримують в холодильнику на протязі 48 годин при температурі +2-4°С. Гомогенат кісткового мозку на водяній бані прогрівають при температурі +80-85°С протягом 10-30 хвилин. Після охолодження до кімнатної температури рідку фракцію гомогенату фільтрують через паперовий фільтр (груба очистка) Характеристика отриманого препарату викладена в таблиці 1. Для стерилізації препарату використовують міпіпорові пластини з діаметром пор 0,90, 0,22 та 0,17 мкм Стерильність препарату визначають згідно ГОСТу 28085-89 Результати стерилізації препарату викладені в табл 2 Міліпорові пластини з діаметром пор 0,22 та 0,17 мкм забезпечують стерильність препарату Приклад 2. Отриманий препарат Мобес вводили білимбезпородним мишам (самкам) живою масою 9-11 г підшкірно, одноразово в дозі 0,1 мл, контрольним - ізотонічний розчин, в такій же дозі. Умови утримання та годівлі мишей були ідентичні. Дослід тривав 10 діб, результати якого викладені в табл 3. Результати досліду (табл 3) свідчать про те, що препарат Мобес сприяє збільшенню живої маси дослідних мишей на 16,1%, завдяки наявності в препараті біологічно активних речовин, які активують метаболізм організму. До складу препарату Мобес окрім біологічно активних речовин входять гуморальні фактори кісткового мозку, специфічна дія яких направлена на активацію функцій лімфоцитів В-системи і підвищення імунно» відповіді організму на введення антигенів . Для визначення впливу препарату Мобес на імунологічні показники був проведений дослід на молодняку великої рогатої худоби. Телятам вводили препарат в дозі 0,015 мл/кг живої маси. Результати гематологічних та імунологічних показників на 18 добу після введення препарату викладені в таблиці 4. Результати досліду (табл. 4) свідчать про те, що гуморальні фактори кісткового мозку впливають певним чином на гематологічні та імунологічні показники дослідних тварин. Так, на 18 добу після введення препарату кількість еритроцитів зростала до 20,2%, гемоглобіну - 14,5%, моноцитів - 188,2%, Т-лімфоцитів - на 32,5%, загального білку - на 6,3%, титр нормальних антитіл збільшувався на 15,0%. Ці показники не могли не відбити ся на продуктивних якостях тварин, що приведено в табл. 5. Дані табл. 5 свідчать про те, що введення телятам препарату Мобес сприяє підвищенню їх продуктивності (23,0-33,9%) в залежності від дози препарату. Економічна ефективність від використання запропонованого способу активації гуморальних факторів імунітету складається із підвищення активності гуморальних та клітинних факторів імунітету, продуктивності тварин, їх збереженості, зниженню собівартості тваринницької продукції тощо. Винахід має не тільки економічне, але й екологічне і соціальне значення. Джерела інформації 1. Филатов В.П. Тканевая терапия. Ташкент, 1948. 2 Калашник И.А. Стимулирующая терапия в ветеринарии. К.: Урожай. - 126 с. 3. Никитенко A.M. Повышение иммунобиологической реактивности сельскохозяйственных животных с помощью тканевых препаратов. Метод, указания. - Белая Церковь, 1989. - 24 с. 4. Петров Р.В., Михайлова А.А. Костно-мозговой стимулятор антителопродуцентов САП. Актуальные проблемы молекулярной, клеточной и клинической иммунологии. Итоги науки и техники. ВИНИТИ - 1983. Т. 12. - С 61-83. 5 Мирошниченко И.В., Ярылин А.А., Рябинина НД., Шарова Н.И , Акназарова Р.Х., Пирожков А.В. Факторы, секретируемые клетками костного мозга и тимуса, обогащенные предшественниками Т-лимфоцитов: сравнение с известными цитокинами и характеристика клеток - продуцентов Иммунология, 1989, № 6 - С. 23-26. 6. Курбанов К.З., Соколова Е.В., Ковальчук Л.В., Петров Р.В. Регуляторное влияние миелопептида на эффекторную функцию макрофагов и рост меланомы В 16. Иммунология, 1989, № 6. С. 45-47. 7. Кирилина Е А., Шанурин С.Ю., Фонина Л.А., Гурьянов С.А., Сорокин С В , Михайлова А.А. Изоляция индивидуального миелопептида, обладающего иммуностимулирующей активностью. Иммунология, 1992, № 4. - С. 31-33. 8. Мирошниченко И.В., Гусева О.А., Манько В.М , Ярилин А.А. Участие клеток костного мозга, несущие мембранные иммуноглобулины, в формировании кроветворных колоний в селезенке. Иммунология, 1992, № 4 . - С . 18-21. 9. Сергеев Ю.О. Изучение в системе in vivo функциональной активности гуморального фактора костного мозга, стимулирующего продукцию антител: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 1981,28 с. Таблиця 1 Характеристика препарату Показники Характеристика Зовнішній вигляд Прозора рідина Колір Світло-жовтий Масова частка сухої речбвини, % Масова частка білків, мг/мл 2,74 ± 0,047 Відсутня 39522 Таблиця 2 Характеристика препарату після стерилізації Діаметр пор фільтра, мкм Характеристика препарату 0,90 Не стерильно 0.22 Стерильно 0.17 Стерильно Таблиця З Результати досліду по визначенню біологічної активності препарату Показники Одиниці виміру Період досліду Контроль Дослід Мобес ІЗОТОНІЧНИЙ розчин Кількість мишей голів початок кінець 14 14 г початок 10.4+0.62 10.3+0,49 кінець 13,5+0,58 13.9+0,54 кінець 3.1+10 3,6+0.12 100,0 116,1 Жива маса Приріст живої маси г% 14 14 Гематологічні та імунологічні показники тварин після введення препарату Мобес Показники Одиниці виміру Таблиця 4 Контроль Ізотонічний розчин Дослід Мобес % до контролю Гемоглобін г/л 93,8+3,50 107,4+4,49 114,5 Еритроцити 10 1 2 /л 8,06+0,292 9,69+0,449 120,2 Лейкоцити 10% 10,02+0.900 7,24+0,682 72,3 Нейтрофіли % 30,4+1.29 28.0+1,54 92,1 Моноцити % 3,4+0,75 9,8+0,84 288,2 Лімфоцити % 55,2+1,59 54,2+1,77 98.2 109?л 5,740+0,373 4,090+0,407 71,3 % 31,4+2,87 41,6+2,71 132.5 В-лімфоцити % 35,6±2,29 27.2±1,50 76.4 і. Загальний білок г/л 70,2+1.47 74,6±1,41 106,3 Титр 4,0+0,274 4,6+1,187 115,0 Абсолютна кількість лімфоцитів Т-лімфоцити Рівень нормальних антител Таблиця 5 Результати досліду по визначенню впливу препарату Мобес на продуктивність телят в залежності від дози (мл/кг) Показники Одиниця виміру Контр, група 0,01 0,03 0,04 0,05 0,07 гол % кг 13 14 18 17 14 15 100 100 100 100 100 100 початок досліду 100,1 102,0 98,3 106,0 96,0 103.0 кінець досліду 109,7 113,9 111,3 118,5 108.2 114,6 312,0 384,0 418,0 404,0 394,0 374,0 Кількість тварин Збереженість Жива маса однієї голови Дослідні групи (мл/кг) Середньодобовий приріст живої маси г 39522 Продовження табл. 5 Показники Одиниця виміру Контр. група ДОСЛІДНІ групи (мл'кг) 0,01 0,03 0,04 0,05 72,0 106,0 92,0 82.0 62,0 123,0 133.9 129,4 126,3 119,8 0,07 Збільшення середньодобового приросту живої маси 7 % 100,0 Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 5 7 - 0 3