Спосіб оцінки впливу різних факторів на клітини організму

Способ оценки воздействия различных факторов на клетки организма, предусматривающий исследование наиболее чувствительных параметров ядрышковой активности в клетках при их анализе под световым микроскопом и определение пороговых величин по отклонению изучаемых показателей в опытных вариантах по сравнению с контрольными, отличающийся тем, что в качестве параметра ядрышковой активности регистрируют размер одиночного ядрышка или процент гетероморфных парных ядрышек для клеток с одним-двумя ядрышками и количество ядрышек - в многоядрышковых клетках. Ю (13) 29432 (11) UA Институте гидробиологии НАН Украины детальные исследования на различных группах организмов с использованием следующих ядрышковых характеристик: среднее число, диаметр ядрышек и их размер на клетку, - обосновали применение данных показателей в качестве высокочувствительного способа определения пороговых величин воздействий антропогенных факторов на клетки организмов (Романенко В.Д., Архипчук В.В., Кипнис Л.С. и др. Патент Украины № 3962 от 15.06.1994. Способ определения пороговых величин воздействий антропогенных факторов на клетки организмов. – Прототип). Оценка степени внешнего воздействия на живой организм производилась посредством статистического анализа количественных характеристик ядрышек (групп активно функционирующих, деспирализованных генов рибосомной РНК). Под световым микроскопом определяли следующие показатели: число ядрышек в клетке, размер (диаметр, площадь, объем) ядрышка и размер ядрышек на клетку, -которые дают точную количественную оценку функциональной активности генома. Ядрышки и их количественные характеристики изучались ранее как клеточные структуры наряду с ядром, хромосомами и другими клеточными органеллами. Однако использование количественных характеристик ядрышек в качестве биотеста для оценки воздействия различных факторов на геном является более перспективным: в сравнении с хромосомными методами "ядрышковый" тест чувствительнее на три-четыре порядка. (19) Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к способу оценки влияния разных факторов физической и химической природы на клетки растений и животных посредством регистрации изменений в функциональной активности генетического аппарата и может быть использовано в биотестировании при определении пороговых величин внешних воздействий на организм. Известны работы, в которых оценка модифицирующего воздействия различных антропогенных факторов на генетический аппарат клетки осуществлялась посредством анализа ядрышковых характеристик. Например, в популяциях растения Vicia cracca, произрастающих в районе действия ЛЭП и испытывающих действие дополнительного экологического фактора - повышенного электромагнитного фона, обнаружено увеличение полиморфизма по величине ядрышка (Бондарь Л.М., Частоколенко Л.В., Баранова В.А. Генетика, 1987, т.23, № 2, с.317-324). Выявлено также стимулирующее влияние малых концентраций некоторых мутагенных факторов на гонады рыб ( вьюн ) и ооциты млекопитающих (кролик). Так, минимальные (пороговые) дозы мутагена диметилсульфата концентрации 3х10 М через 2-6 ч и одно из генетически активных соединений - парааминобензойная кислота в дозе 500 мг/кг через 2 недели вызывают образование большого числа дополнительных ядрышек (в несколько раз выше, чем в контроле) и усиление биосинтеза белка в ядрах и цитоплазме ( Хволес А.Г., Черняев Т.А. Доклады АН СССР, 1988, т.301, N 4, с.985-988). Выполненные ранее в C2 ______________________________ 29432 Способ, предложенный в работе-прототипе, носит универсальный характер: он применим к самым разным группам организмов, предусматривает комплексный анализ морфологических характеристик ядрышек. Однако использование прототипа, а именно всей совокупности ядрышковых характеристик, не позволяет получать ожидаемый результат без применения специальных измерительных приспособлений для микроскопа, например, окуляр-микрометра. Эта операция затрудняет реализацию метода технически, увеличивает его продолжительность, материальные затраты. В основу данного изобретения поставлена задача создания высокочувствительного и информативного способа определения пороговых величин воздействий антропогенных факторов на клетки организма, пугем исследования только наиболее чувствительных и информативных ядрышковых характеристик, что обеспечит его существенное техническое упрощение и повышение экспрессивности. Поставленная задача достигается тем, что в способе определения пороговых величин воздействий антропогенныхфакторов на клетки организмов, предусматривается анализ не всей совокупности количественных характеристик ядрышек, а только отдельных наиболее чувствительных, значительно технически проще определяемых и в то же время объективно отражающих биосинтетическую активность клетки ядрышковых параметров, таких как: размер одиночных ядрышек и/или доля гетероморфных парных ядрышек в клетках с одним-двумя ядрышками, а также количества ядрышек в многоядрышковых клетках. Как показали наши многолетние исследования, а также анализ литературных первоисточников среди растительных и животных организмов широко распространены клетки с малым числом ядрышек. В подобного типа ядрах наблюдаются одиночные и парные ядрышки, последние могут быть гомоморфными (одинакового размера) и гетероморфными (различаться по своему размеру). В клетках некоторых организмов обнаруживается большее количество ядрышек - они являются по данной характеристике многоядрышковыми. Упрощение метода заключается в исследовании только тех ядрышковых характеристик, которые значительно технически и методически упрощают процедуру эксперимента, требуют более простого оборудования, применения незначительного количества реактивов, не требующих дополнительной очистки, и главное, обладающих большей чувствительностью в сравнении с комплексным анализом ядрышковых показателей, объективно отражающих суммарную ядрышковую, следовательно, и биосинтетическую, активность анализируемых клеток. Метод не предъявляет особых требований к качеству препарата. Наличие ядрышек как в растительных, так и животных клетках с эукариотическим ядром (за исключением простейших) дает основание использовать заявляемый способ на различных группах организмов. Пример 1. Исследовали влияние малых доз радиации (мощностью порядка 10 мкГр/ч) на генетический аппарат эмбрионов карпа, Cyprinus carpio. Для инкубации икры были использованы опытный (естественный ил верхней части Киевского водохранилища, из зоны отчуждения) и контрольный (с радиационно "чистым" илом) аквариумы. Гамма-активность илов в эксперименте изменялась от 0,2 до 1,2 мР/ч (2 - 12 мкГр /ч). Икринки фиксировали на всем протяжении эмбрионального развития: на стадиях желточной пробки, хвостовой почки, начала пигментации глаз и подвижного эмбриона, перед вылуплением. Анализировали воздушно-сухие цитологические препараты, окрашенные 50% раствором азотнокислого серебра. Под световым микроскопом (окуляры 10х, объектив 100х, общее увеличение 1000х) определяли все показателя, которые характеризуют число и размер ядрышек в клетках: процент клеток с разным числом ядрышек, среднее число ядрышек на клетку, размер (диаметр, объем, площадь поверхности) одиночных, парных гомо- и гетероморфных ядрышек; суммарную величину - размер ядрышек на клетку. Проведено 4 серии экспериментов. Сравнительный анализ всех морфологических параметров ядрышковой активности в эмбриогенезе карпа выявил очень высокую чувствительность размеров одиночных ядрышек на стадии хвостовой почки (этап гаструляции). Уже в первые сутки, через 16-20 часов после начала эксперимента, т.е. при суммарной дозе облучения 3-5 мР, объем одиночных ядрышек почти в два раза превышал контрольные показатели. Настолько существенные отклонения не были обнаружены в наших экспериментах ни для какой-либо иной ядрышковой характеристики в течение всего эмбриогенеза. Далее, обнаружена высокая степень положительной корреляции между всеми исследованными количественными характеристиками ядрышек. Например, процент гетероморфных парных ядрышек проявляет высокую степень взаимосвязи с размерами ядрышек (R=0,65-0,90; Р