Спосіб визначення порогових величин впливу антропогенних факторів на клітини організмів

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к способу оценки меры воздействия мутагенных факторов на живые объекты посредством определения функциональной активности генетического аппарата клетки и может быть использовано при оценке пороговых доз воздействий разных физических и химических факторов. Известны работы, в которых оценка модифицирущего воздействия различных антропогенных факторов на генечический аппарат клетки осуществляется путем анализа ядрышковых характеристик. Например, в популяциях растения Vicsa cracca, произрастающих в районе действия ЛЭП и испытывающих действие дополнительного экологического фактора - повышенного электромагнитного фона, обнаружено увеличение полиморфизма по величине ядрышка [1]. Выявлено также стимулирующее влияние малых концентраций некоторых мутагенных факторов на гонады рыб (вьюн) и ооциты млекопитающих (кролик). Так, минимальные (пороговые) дозы мутагена диметилсульфата концентрации 3.10-6 Μ через 2-6 ч и одно из генетически активных соединений - парааминобензойная кислота в дозе 500 мг/кг через 2 недели вызывают образование большого числа дополнительных ядрышек (в несколько раз выше, чем в контроле) и усиление биосинтеза белка в ядрах и цитоплазме [2]. К недостаткам уже выполненных исследований необходимо отнести: 1. Методики получения цитологических препаратов, описанные в работах, неприменимы ко всем группам животных и растений, например, используя приведенные в статьях методические операции невозможно получить объективные данные о ядрышках в клетках морских беспозвоночных животных. 2. Большинство методик невыполнимо в сжатые сроки - требуется 1-2 суток (у заявителей 4-5 часов). 3. Окрашивание производится красителями, которые не исключают возможности выявления и других, помимо ядрышек, ядерных элементов, например, конденсированных участков хромосом в интерфазном ядре, которые, в свою очередь, могут быть приняты за мелкие ядрышки. 4. Неотработанность методических операций приводит к низкому качеству цитологических препаратов. 5. Недостатки на заключительном этапе при получении полного набора результатов о количественных характеристиках ядрышек; а) не определяются отдельные характеристики из целого ряда - процент клеток с разным числом ядрышек, среднее число ядрышек на клетку, средний диаметр (площадь) ядрышка, размер ядрышек в клетке; б) анализ ядрышковых показателей проводится такими способами, которые могут привести к искаженным результатам. Например, измерение размеров ядрышек на парафиновых срезах (срез при этом не обязательно проходит через середину ядрышка), определение объемов ядрышек по вырезанным фотографическим оттискам. 6. Часто отсутствуе т статистическая обработка данных: не приводятся результаты по достоверной разнице между средними арифметическими (критерий Стьюдента) и сравниваемыми выборками (критерий хи-квадрат). 7. Определение ядерно-ядрышкового отношения во многих случаях маскирует истинные изменения в количественных характеристиках именно ядрышек. В основу изобретения поставлена задача создания высокочувствительного и информативного способа определения пороговых величин воздействий антропогенных факторов на клетки организма, в котором использование функциональных характеристик генома - ядрышек - обеспечивает регистрацию пороговых величин воздействий антропогенних факторов и за счет этого появляются новые возможности для более точного определения ПДК. Поставленная задача решается тем, что в способе определения пороговых величин воздействий антропогенных факторов на клетки организмов, предусматривающего исследование ядрышек в анализируемых и контрольных клетках, регистрацию ядрышковых показателей и определение пороговых величин по отклонению показателя от контроля согласно изобретению вводятся для регистрации следующие показатели: среднее число, диаметр ядрышек и их размер на клетку. Оценка степени внешнего воздействия на живой организм производится посредством статистического анализа количественных характеристик ядрышек (группы активно функционирующих, деспирализованных генов рибосомной РНК). Под световым микроскопом определяются следующие показатели: число ядрышек в клетке, диаметр (площадь) ядрышек и их размер на клетку - которые дают точную количественную оценку функциональной активности генома. Ядрышки и их количественные характеристики изучались ранее как клеточные структуры наряду с ядром, хромосомами и другими клеточными органеллами. Однако использование количественных характеристик ядрышек в качестве теста для оценки воздействия различных факторов на геном представляется наиболее перспективным: в сравнении с хромосомными методами "ядрышковый" тест чувствительнее на несколько порядков. Упрощение способа заключается в использовании для анализа любой ткани живого организма, применении незначительного количества реактивов, не требующи х дополнительной очистки, что позволяет применять его в полевых условиях. Способ не предъявляет особых требований к качеству препарата. Наличие ядрышек как в растительных, так и животных клетках с эукариотическим ядром (за исключением простейших) дает основание использовать заявляемый способ на различных гр уппах организмов. Пример 1. Исследовалось влияние малых доз радиации на генетический аппарат эмбрионов вьюна, Misgurnus fossilis. Для инкубации икры были использованы опытный (естественный ил содержал искусственные радионуклиды) и контрольный (с "чистым" илом) аквариумы. Гамма-активность илов в эксперименте изменялась от 0,2 до 1,2 мР/час. Фиксировались икринки через 24 часа после оплодотворения, в то время, когда ядрышковая активность наиболее высокая. Анализировались воздушно-сухие цитологические препараты, окрашенные 50% раствором азотнокислого серебра. Под световым микроскопом определяли все три показателя, которые характеризуют число и размер ядрышек в клетках. Уже в первые сутки, т.е. при суммарной дозе облучения 3-5 мР, обнаружена достоверная разница (и по критерию Стьюдента, и по критерию хи-квадрат) в размерах ядрышек между облученными и необлученными клетками эмбрионов рыб. В контроле средний размер ядрышек на клетку составлял 39,5 условных единиц, в опытных вариантах он равнялся 48,9; 52,0 и 58,6 услов. ед. в зависимости от интенсивности облучения. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что малые дозы радиации, величиной порядка нескольких миллирентген, влияют на функцию генома рыб. Пример 2. Исследовалось влияние различных концентраций солей алюминия (АlСl3) и свинца (Рb(NО3)2) на генетический аппарат икры карпа. Для инкубации были использованы опытные (вода с содержанием в ней токсикантов в концентрации по ионам металлов Αl - 10-30 мг/л. Pb - 0,1-5 мг/л) и контрольный ("чистая" вода) аквариум. Фиксировались икринки на разных стадиях эмбриогенеза. Дальнейший анализ проводили по схеме, изложенной в примере 1. Под воздействием концентраций, не фиксируемых методами-аналогами, а также не вызывающих фенотипических повреждений и не нарушающи х ход эмбрионального развития, обнаружены достоверные различия в процентном составе одно- и двуядрышковых клеток между контролем и опытом, а также достоверное уменьшение размеров ядрышек в опытных вариантах. Пример 3. Клетки селезенки, выделенные у пяти однолинейных самцов крыс, культивировались на средах, содержащих биологически активное вещество "мумие" и различающихся по концентрации этого вещества (0,0001; 0,001; 0,01; 0,1 и 1 мг/мл). Одна группа клеток была контрольной, среда на которой она выращивалась не включала в себя "мумие". После кратковременного культивирования (30 мин.) контрольная и пять опытных групп клеток фиксировались, приготавливались воздушно-сухие цитологические препараты. Дальнейшая схема эксперимента соответствует той, что была описана в примере 1. В результате обнаружено, что с увеличением концентрации лекарственного вещества в среде размер ядрышек в ядрах закономерно возрастает с 1,8 до 3,2 мкм 2, достигая определенного максимума (при концентрации "мумие" 0,1 мг/мл), выше которого площадь ядрышек на ядро не увеличивается. Следовательно, предлагаемый способ фиксирует влияние низких концентраций лекарственных веществ на геном млекопитающих. Пример 4. Исследовалось воздействие некоторых абиотических факторов на функциональную активность геномов клеток растений. В качестве анализируемого объекта использовалась меристемная ткань корешков лука-батуна. Корешки облучались кратковременно (2 мин.) и однократно лазерным лучом с длиной волны 337 нм, а также выращивались на влажных, фильтрах, содержащих мутагенное вещество бромистый этидий в концентрации 10-9. Всего было проведено три серии экспериментов. Выяснено, что число ядрышек в клетках лука-батуна является довольно консервативным показателем: во всех контрольных и опытных вариантах среднее количество ядрышек на клетку колебалось в узких пределах 1,4-1,5. Тогда как, площадь ядрышка и, соответственно, площадь ядрышек на ядро изменялись в результате воздействия анализируемых факторов. После лазерного облучения (уже через 10 мин.), выращивания на среде с мутагеном, а также сочетанного действия этих двух факторов площадь ядрышек в ядре достоверно уменьшалась с 32 мкм 2 до 15, 22 и 12 мкм 2, соответственно. С течением времени, прошедшим после влияния внешнего фактора, наблюдается постепенное восстановление размеров ядрышек. Таким образом, заявляемый способ позволяет фиксировать воздействия незначительных доз различных факторов на геном растительной клетки. Пример 5. Объектом исследования служили холоднокровные животные, обитающие в морской воде. В частности, анализировали эмбриональные и соматические ткани, гонады трепангов, голотурий, морских звезд, серых и черных морских ежей. С помощью "ядрышкового" теста регистрировали влияние ионов некоторых тяжелых металлов (медь в концентрации 10 мкгр/л, цинк в концентрациях 20 и 100 мкгр/л) на геном морских беспозвоночных уже в первые сутки воздействия. Так, у эмбрионов серых морских ежей на стадии гаструлы достоверно уменьшается среднее число ядрышек в опытных вариантах по сравнению с контрольными, например, под воздействием ионов меди анализируемый показатель снижается с 3,51 до 3,26 за счет увеличения процента клеток с 2 ядрышками и снижения доли клеток с 4 и 5 ядрышками. В отличие, от предыдущи х примеров фиксация икринок морских животных должна быть кратковременной: две смены фиксатора по 10-15 мин. каждая достаточны. Еще одно дополнение: до фиксации межклеточные связи разрушаются с помощью специальной среды без ионов Са и Мg. Предложенный способ может быть использован как экспресс-метод для быстрой и высокочувствительной диагностики, фиксируя на несколько порядков ниже, чем известные способы, влияние пороговых величин разных химических и физических факторов на живые объекты в токсикологии, фармакологии, радиоэкологии и т. п.